李曉紅

(太原工業(yè)學(xué)院，山西太原 030000)

0 引言

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)[1-3]、生物、生命科學(xué)等領(lǐng)域的不斷發(fā)展[4-6]，人類對(duì)一些疾病檢測(cè)等研究深入到細(xì)胞領(lǐng)域[7]，以流體為媒介貫穿整個(gè)微型分析系統(tǒng)，逐步替代傳統(tǒng)大型生物化學(xué)分析實(shí)驗(yàn)室，且具有樣本用量少、制備成本低及便于大規(guī)模生產(chǎn)等市場(chǎng)推廣優(yōu)勢(shì)。微流控細(xì)胞分選方式主要分為被動(dòng)分選和主動(dòng)分選兩類。被動(dòng)分選技術(shù)主要是利用粒子、流場(chǎng)及通道結(jié)構(gòu)之間的相互作用實(shí)現(xiàn)對(duì)粒子的操縱。主要包括慣性力分選、橫向位移(DLD)、微過濾等方法。主動(dòng)分選技術(shù)通過利用各種形式的外加電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)，主要包括介電泳(dielectrophoresis，DEP)分選[8]，聲表面波(surface acoustic waves，SAW)分選[9]等。每種分選方式都有其各自特點(diǎn)，雖然單物理場(chǎng)可直接完成對(duì)細(xì)胞的橫移操控從而達(dá)到分選目的，但單物理場(chǎng)存在自身的不足，并且為提高細(xì)胞分選效率，需要將細(xì)胞聚焦到物理場(chǎng)提供分選力最大的區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)一操控，傳統(tǒng)慣性力分選芯片采用特定設(shè)計(jì)的流道，僅適用直徑不同的特定細(xì)胞，而且通道長(zhǎng)度一般都比較長(zhǎng)，不利于小型化設(shè)計(jì)，可調(diào)程度低，精度低；傳統(tǒng)介電泳力分選芯片，分選通量小，且只適用于粒子介電性質(zhì)不同的情況。因此單物理場(chǎng)分選方式無(wú)法克服本身的缺點(diǎn)，本項(xiàng)目提出的多物理場(chǎng)空間耦合分選方式將慣性力與介電泳力的優(yōu)勢(shì)結(jié)合，并進(jìn)行了一系列仿真研究，制備出了微流控芯片。

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 慣性力原理

在被動(dòng)式微流控技術(shù)中，慣性微流控因其操作精確、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、通量高而備受關(guān)注。慣性微流控技術(shù)是通過有限雷諾數(shù)下誘導(dǎo)微流體產(chǎn)生慣性效應(yīng)，比如粒子的慣性遷移，或者截面二次流來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)微粒子的操控[10]。在現(xiàn)有的慣性微流控器件中，常用的通道有3種類型:矩形通道、螺旋通道及帶有收縮-膨脹(CEA)結(jié)構(gòu)的矩形通道[11]。其中CEA通道具有通道長(zhǎng)度小于直通道、面積小于螺旋通道等優(yōu)點(diǎn)，因此選擇CEA通道來(lái)進(jìn)行粒子預(yù)聚焦分選。

由于流道壁與液體之間存在摩擦力，因此當(dāng)流體在直線形通道中呈層流流動(dòng)時(shí)，會(huì)阻礙其運(yùn)動(dòng)，使得靠近通道壁的流體速度最低，最終在流道中液體的流速曲線為拋物線形狀，流體的這種性質(zhì)稱為Poiseuille流。伴隨著這種拋物線的流速分布產(chǎn)生了一種剪切力梯度，這種剪切力梯度誘導(dǎo)產(chǎn)生的升力(shear-induced lift force)會(huì)將懸浮在流體中的粒子推向通道壁。當(dāng)粒子移動(dòng)到距離通道壁足夠近的位置時(shí)，通道壁誘導(dǎo)產(chǎn)生的升力(wall-induced lift force)又會(huì)將粒子推到流道中心位置。最終兩種方向相反的升力的合力被稱為慣性升力。由于力的復(fù)雜性，因此很難計(jì)算，最終由Di Carlo 簡(jiǎn)化得到該慣性升力大小[12]為

(1)

式中：ρ為流體密度；Um為流體的流速；a為粒子直徑；Dh為流體水力直徑；fL為凈慣性力的升力系數(shù)，它取決于雷諾數(shù)及粒子在通道截面處所處位置。盡管升力系數(shù)會(huì)受到雷諾數(shù)等的影響，但是在雷諾數(shù)小于100的情況下，fL可以近似為常數(shù)，fL≈0.5[13]。

在封閉微流道中，粒子在合力作用下到達(dá)慣性升力零點(diǎn)時(shí)會(huì)處于受力平衡狀態(tài)，此時(shí)會(huì)產(chǎn)生慣性升力平衡點(diǎn)，同種粒子會(huì)在平衡點(diǎn)的領(lǐng)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)慣性聚焦[14]。

1.2 介電泳力原理

介電泳力(DEP)是指流體中的粒子在被加載非均勻電場(chǎng)后，粒子內(nèi)部電荷會(huì)被誘導(dǎo)極化，從而向電場(chǎng)梯度的正或負(fù)方向運(yùn)動(dòng)的效應(yīng)[14]。對(duì)于極化率高于懸浮液的粒子，受到正介電泳力作用(pDEP)，并向電場(chǎng)最強(qiáng)的區(qū)域移動(dòng)。反之，當(dāng)處于負(fù)介電泳力(nDEP)作用時(shí)，由于粒子極化率低于周圍介質(zhì)，向弱電場(chǎng)區(qū)移動(dòng)。

根據(jù)電偶極矩理論，粒子所受介電泳力大小為[15]

(2)

其中K(w)表達(dá)式為

(3)

溶液和粒子的介電常數(shù)決定了Re[K(w)]的正負(fù)，當(dāng)Re[K(w)]>0時(shí)，細(xì)胞受正介電泳力(pDEP)，向高電場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng)；當(dāng)Re[K(w)]<0時(shí)，細(xì)胞受負(fù)介電泳力(nDEP)，向低電場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng)。

2 芯片仿真設(shè)計(jì)研究

前面分析了慣性力及介電泳力原理，接下來(lái)對(duì)粒子受力進(jìn)行仿真研究。粒子分離主要包括收縮擴(kuò)張通道(CEA)及微電極2部分。其中微通道部分主要是實(shí)現(xiàn)粒子的聚焦和分離，微電極連接信號(hào)發(fā)生器用于產(chǎn)生非均勻電場(chǎng)，以此進(jìn)行進(jìn)一步的分選，提高分選效率。

2.1 慣性力分選研究

當(dāng)流體中的粒子流經(jīng)狹窄流道時(shí)，會(huì)導(dǎo)致壁面升力減弱，此時(shí)處于流道中線的粒子會(huì)受到剪切升力作用，從而移動(dòng)到流道側(cè)壁。當(dāng)粒子由收縮通道進(jìn)入到擴(kuò)張流道時(shí)，突然的收縮-擴(kuò)張通道結(jié)構(gòu)會(huì)使得流線彎曲，使得粒子動(dòng)量發(fā)生變化，發(fā)生流體與粒子間運(yùn)動(dòng)軌跡不匹配。在此之后的一段時(shí)間內(nèi)，粒子內(nèi)的動(dòng)量變化遵循牛頓第二定律及慣性力的支配，此時(shí)慣性力可推導(dǎo)為[16]

(4)

設(shè)粒子在此期間的平均速度為u，流過的微流道的特征尺寸為D，因此可計(jì)算出細(xì)胞動(dòng)量變化時(shí)間Δt=D/u，式(4)可以變換為

(5)

設(shè)細(xì)胞等效直徑為d，則慣性力可表示為

(6)

慣性力將被斯托克斯阻力平衡，斯托克斯阻力公式為

Fd=3πμdup

(7)

因此，粒子橫向遷移速度up為

(8)

式中ρp為粒子密度。

由此可知，當(dāng)粒子在收縮-擴(kuò)張微通道中運(yùn)動(dòng)時(shí)，發(fā)生的位移及橫向位移的速度是由受慣性升力和動(dòng)量改變引起的慣性力的相對(duì)大小決定的。當(dāng)流速較低時(shí)，粒子所受慣性升力較大，無(wú)法產(chǎn)生慣性聚焦效應(yīng)；當(dāng)流速較高時(shí)，粒子所受慣性力較大，粒子將移動(dòng)到平衡位置，形成慣性聚焦效應(yīng)。因此針對(duì)收縮擴(kuò)張結(jié)構(gòu)，利用Comsol進(jìn)行了2種速度仿真對(duì)比，速度仿真如圖1所示，入口速度設(shè)置分別為14.4、48 μL/min。從圖1可看出，入口速度越大，粒子進(jìn)入收縮通道時(shí)，由于慣性力及斯托克斯力的影響，會(huì)改變粒子的速度，由此來(lái)實(shí)現(xiàn)慣性聚焦。但是速度不能過大，太大可能會(huì)使得通道沖破。

2.2 介電泳力分選研究

從出口處將傾斜叉指電極排列在芯片底部，電極與通道夾角設(shè)置為45°，此時(shí)粒子會(huì)受到介電泳力和流體曳力合力的作用，由于兩種粒子的介電性質(zhì)或尺寸不同，所受合力的大小也不同，因此粒子在運(yùn)動(dòng)過程中，會(huì)發(fā)生偏轉(zhuǎn)，從而進(jìn)入不同的通道，最終實(shí)現(xiàn)粒子的高效分離。由于傾斜叉指電極的垂直截面可以看作為普通叉指電極，所以按照普通電極結(jié)構(gòu)利用Comsol5.3來(lái)對(duì)電場(chǎng)進(jìn)行仿真模擬。施加電壓為5 V，溶液電導(dǎo)率為1 μS/cm。電場(chǎng)分布如圖2和圖3所示，并對(duì)2種電極結(jié)構(gòu)尺寸進(jìn)行了仿真，從圖中可以看出，2種電極尺寸均是在電極邊緣處電場(chǎng)強(qiáng)度最大，此時(shí)受到正介電泳的粒子將會(huì)被吸附在電極的邊緣；相鄰電極間隔的中點(diǎn)的電場(chǎng)強(qiáng)度最弱，此時(shí)受到負(fù)介電泳力的粒子將富集在間隔中央。2組電極的寬度和間距分別為40 μm和30 μm，從圖中可以看出30 μm的電極寬度及間距，電場(chǎng)強(qiáng)度較強(qiáng)。而且工藝上也很好實(shí)現(xiàn)，因此結(jié)構(gòu)上選擇30 μm電極實(shí)現(xiàn)介電泳分離。

因此通過以上理論及仿真分析，確定了該結(jié)構(gòu)尺寸，收縮擴(kuò)張通道部分，收縮區(qū)域長(zhǎng)度為1 200 μm，寬度50 μm。收縮區(qū)域間距為700 μm，寬度為350 μm。整個(gè)微通道高度為60 μm。微電極部分由20組寬度為30 μm，間距為30 μm，且與收縮擴(kuò)張通道出口處夾角為45°的傾斜叉指電極構(gòu)成。且電極兩側(cè)都分別連接信號(hào)發(fā)生器的正負(fù)極，由此制作的掩膜版如圖4和5所示，圖4為微流道部分，圖5為微電極部分。

3 芯片加工制備

芯片工藝制備流程分為2部分，第一部分為PDMS微流道制備。PDMS微流道利用深硅刻蝕工藝加工制備，在硅片上制備模具，將PDMS與固化劑按照10∶1比例混合，抽真空后澆注到模具上，主要工藝流程包括：

(1)清洗：將硅片放置于丙酮溶液中，超聲清洗10 min，之后用去離子水清洗，并放入75 ℃真空干燥箱30 min烘干。

(2)勻膠：將硅片置于勻膠機(jī)上，用滴管將正光刻膠AZ4620滴到硅片上，設(shè)置轉(zhuǎn)速為3 000 rad/min，轉(zhuǎn)1 min，完成勻膠。

(3)前烘：將勻膠后的硅片取出，放置100 ℃的烘臺(tái)上1 min后取下。

(4)光刻：將硅片與掩膜版放入光刻機(jī)后，將掩膜版與硅片對(duì)齊，設(shè)置曝光強(qiáng)度為200 mJ/cm2。

(5)顯影：將AZ400K的顯影液與水按照1∶4比例配比，將硅片置于溶液中顯影。

(6)后烘：將硅片置于120 ℃的烘臺(tái)上30 min，完成后烘處理。

(7)刻蝕：選擇20 μm以內(nèi)的菜單，刻蝕220 lp，完成刻蝕。

(8)去膠：將刻蝕后的硅片利用丙酮去膠，去離子水清洗干凈后，用氮?dú)獯蹈伞?/p>

(9)倒模：將PDMS與固化劑按照10:1的比例配比，抽真空后，澆注到硅片上，在75 ℃下，烘50 min，靜置一段時(shí)間后脫模，并剪裁成適合大小，最后打孔處理。

第二部分為電極制備,本次采用制備工藝比較成熟的ITO電極，采用正光刻膠AZ6130，目的是使得電極厚度盡量較薄，利用濕法腐蝕的方法。具體工藝步驟為：清洗、勻膠、前烘、顯影、光刻、后烘、腐蝕、去膠。最后將ITO玻璃片與PDMS利用氧等離子表面處理工藝，將芯片對(duì)準(zhǔn)鍵合。工藝流程圖如圖6所示。

顯微鏡下觀察到的內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖7、圖8所示?？梢钥闯鲭姌O部分和微通道部分鍵合牢固，鍵合部分沒有氣泡或者其他雜質(zhì)夾雜在鍵合區(qū)域，利用注射器注入流體時(shí)，也沒有漏液或者通道變形的情況。

4 結(jié)束語(yǔ)

本文針對(duì)目前微流控芯片單物理場(chǎng)分選精度低、通量小等劣勢(shì)，提出了一種多物理場(chǎng)耦合的方法，即利用收縮擴(kuò)張通道與介電泳耦合，并通過粒子的聚焦和分離原理，進(jìn)行了理論分析，利用Comsol Multiphysis軟件對(duì)芯片進(jìn)行了仿真及優(yōu)化，最終確定了芯片的微通道的高度及叉指電極的寬度、間距，并完成微流控芯片的制備，且工藝過程不復(fù)雜，可重復(fù)利用性高，為后續(xù)其他生物、化學(xué)等方向的微流控芯片制備及粒子分選提供了一定的參考。