陳秀琴 林 甦 鄭 敏 黃梅清＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

目前對食源性致病菌的檢測主要是依賴傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合細菌的生物化學(xué)鑒定。這些方法耗時、費力、靈敏度低，無法定量分析食品中的食源性致病菌[2]。此外，有些致病菌無法通過培養(yǎng)基培養(yǎng)，因而結(jié)果存在假陰性的可能性[7]。近幾十年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測，其中熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）具有特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，被認為是一種具有應(yīng)用前景的方法。本研究通過選用特異性良好的靶基因來設(shè)計引物探針，建立一種檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7三種致病菌的多重?zé)晒釶CR方法，并將該方法應(yīng)用于生鮮肉檢測。

1 材 料

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 試驗所用的16株標(biāo)準(zhǔn)菌株來源及相應(yīng)的菌株編號見表1。

表1 試驗用菌株

1.2 試劑和培養(yǎng)基 細菌基因組DNA提取試劑盒（北京TIAGEN生化科技有限公司）；2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒、RNase-free和pMDTM18-T載體（大連TaKaRa生物工程有限公司）；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA公司）；緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硫酸祕瓊脂平板（BS瓊脂）、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯、血平板、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、改良EC新生霉素肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基、改良山梨醇麥康凱培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；NanoDropND-1000核酸濃度測定儀（美國賽默飛世爾公司）；拍擊式均質(zhì)器(法國英特塞恩斯有限公司)。

1.4 引物和探針 在GenBank分別下載沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7的invA、nuc和wzx基因序列，應(yīng)用Beacon Designer version 7.51設(shè)計引物和TaqMan探針。通過NCBI Blast檢測特異性。引物和探針序列見表2，引物探針均委托大連TaKaRa生物工程有限公司合成。

2 方 法

2.1 細菌基因組DNA提取 取各菌株對數(shù)生長期的新鮮培養(yǎng)物，按照細菌基因組DNA抽提試劑盒（北京天根）說明書提取制備DNA模板。用核酸濃度測定儀測定出DNA濃度與純度，DNA模板置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 單重qPCR擴增 反應(yīng)體系：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5μL，上下游引物各1μL，探針1μL，模板1μL，ddH2O補足至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，收集熒光，35個循環(huán)。

2.3 多重qPCR體系的優(yōu)化 基于單重qPCR擴增體系，對多重qPCR的引物濃度以及探針濃度進行優(yōu)化，最終篩選出最優(yōu)反應(yīng)條件。

新生兒窒息可以造成多種臟器的損傷，其中對腦和腎臟的損傷最為明顯［1］，而對腎臟的損傷診斷最常用的指標(biāo)仍為血清肌酐（creatinine，Cr）和尿素氮（urea，BUN），但二者的變化有其滯后性。尤其是對高危群體的新生兒，這兩項并不能早期靈敏的指示腎小球濾過率的改變。近年來發(fā)現(xiàn)標(biāo)胱抑素C（Cys－C）在反應(yīng)腎小球濾過率上較血清Cr、BUN有更高的敏感性［2］。本研究選取Cys－C、Cr和BUN，結(jié)合其他幾項常用的評價新生兒狀態(tài)的指標(biāo)，旨在評價Cys－C在新生兒窒息后腎臟損害早期診斷的臨床價值。

2.4 多重qPCR特異性試驗 按優(yōu)化后的熒光PCR反應(yīng)體系，分別對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7和其它12株供試菌種進行多重qPCR檢測，并設(shè)立空白對照。

2.5 多重qPCR靈敏度試驗和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7三種菌的重組質(zhì)粒分別用無菌水10倍梯度稀釋至102拷貝數(shù)/μL，各個稀釋度的質(zhì)粒按照2.3優(yōu)化的反應(yīng)條件進行多重qPCR。以重組質(zhì)?？截悢?shù)濃度的對數(shù)值作為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，繪制相對定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 多重qPCR重復(fù)性試驗 按照2.3優(yōu)化的反應(yīng)條件，以濃度為109～105拷貝數(shù)/μL的重組質(zhì)粒為模板，每個濃度進行10個重復(fù)，分別計算批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）和批間變異系數(shù)。

2.7 臨床樣品檢測 在本地3個超市購買30份生鮮肉，包括牛肉、豬肉和雞胸肉各10份。稱取樣品25 g肉至拍擊式均質(zhì)袋，加入225 mL無菌EC肉湯，均質(zhì)2 min。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，取增菌液1 mL用于核酸提取，按照優(yōu)化好的反應(yīng)條件進行qPCR檢測。同時采用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗[8]》、GB 4789.4-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗[9]》、GB 4789.36-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗》[10]）進行檢測結(jié)果比對，驗證多重qPCR方法的可靠性。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS 23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表2 本研究用到的引物和探針

3 結(jié)果與分析

3.1 多重qPCR體系優(yōu)化 對多重qPCR的引物濃度以及探針濃度進行優(yōu)化，最終篩選出最優(yōu)反應(yīng)體系為2×Premix Ex Taq（Probe qPCR）25.5μL，三種細菌混合的上下游引物各1.5μL，混合的探針0.4μL，混合模板4μL，ddH2O補足至50μL。

3.2 多重qPCR的特異性 多重qPCR方法的特異性結(jié)果見圖1。3種靶細菌顯示良好的PCR擴增信號，而非靶細菌和空白對照均無特異性擴增。證明本試驗所采用的引物和探針對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7具有良好的特異性，且不會產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將制備的3種靶細菌重組陽性質(zhì)粒DNA稀釋至1010～105拷貝數(shù)/μL，按照已優(yōu)化的反應(yīng)體系及條件進行qPCR并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=-4.74X+57.046，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.996，擴增效率為90.78%；金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=-4.929X+58.824，R2為0.999，擴增效率為86.72%；大腸桿菌O157:H7的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為Y=-4.277X+52.119，R2為0.997，擴增效率為84.86%（見圖2）。R2均大于0.99，表明DNA拷貝數(shù)濃度的對數(shù)值與Ct值之間具有良好的線性關(guān)系。表明設(shè)計的引物和探針具有較高的擴增效率，所建立的多重qPCR結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

圖1 多重qPCR擴增結(jié)果

圖2 多重?zé)晒釶CR標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

3.4 qPCR靈敏度試驗 用106～102拷貝數(shù)/μL的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157:H7質(zhì)粒進行靈敏度檢驗，陽性結(jié)果判斷以35個循環(huán)為限。由圖3可知，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌靈敏度為105拷貝數(shù)/μL，而大腸桿菌O157:H7靈敏度為104拷貝數(shù)/μL。

圖3 3種食源性致病菌的靈敏度試驗

3.5 多重qPCR重復(fù)性檢驗 5個梯度批內(nèi)變異系數(shù)處在0.12%～1.71%，小于5%（見表3），批間變異系數(shù)處在0.05%～6.62%，小于15%～20%（見表4），表明重復(fù)性較好。

3.6 臨床樣品檢測 應(yīng)用已建立的多重qPCR方法對30份樣品中進行大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌檢測，結(jié)果表明大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢出率分別為23.3%（7/30）、10%（3/30）、13.3%（4/30）。傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測樣品中大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌的 檢 出 率 分 別 為20%（6/30）、10%（3/30）、10%（3/30）。用qPCR方法檢測大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢出率略高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，所需的檢測時間較國標(biāo)法明顯縮短。表明所建立的qPCR方法可特異、快速地實現(xiàn)對生鮮肉中大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測。

表3 多重qPCR批內(nèi)重復(fù)性檢驗

表4 多重qPCR批間重復(fù)性檢驗

表5 qPCR方法與國標(biāo)法檢測樣品比對

4 討 論

生鮮的畜禽產(chǎn)品從生產(chǎn)到餐桌中間涉及到多個環(huán)節(jié)，因而極其容易受到病原菌的污染。傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法需要經(jīng)過增殖培養(yǎng)、選擇性培養(yǎng)和生化鑒定三個步驟才能得出結(jié)果，被認為是檢測食源性致病菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是該方法通常需要5～6 d才能得出結(jié)果[11]，無法進行定量分析，檢測靈敏度低[12]。食品中污染食源性致病菌的劑量往往很低。因此，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法不能完全用于食源性致病菌的檢測。而基于核酸檢測的分子生物學(xué)方法，如qPCR具有靈敏度高、特異性強且能夠進行高通量分析等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[13-16]。

在多重qPCR反應(yīng)中，擴增結(jié)果的特異性取決于引物設(shè)計，而特異性靶基因的選擇又決定了引物設(shè)計的準(zhǔn)確性，因此，選用的靶基因最好在目標(biāo)菌中高度保守。在本試驗中選用的3種病原菌的靶基因分別為沙門氏菌吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的編碼基因invA、金黃色葡萄球菌編碼耐熱核酸酶基因nuc、大腸桿菌O157:H7編碼O抗原翻轉(zhuǎn)酶基因wzx。invA基因已被證明是沙門氏菌的特異性基因[17]。nuc基因是金黃色葡萄球菌的高度保守序列，特異性強，大量的文獻也選用該基因作為金黃色葡萄球菌特異性靶基因[3,14,17-18]。wzx基因也常被用作大腸桿菌O157的靶基因[19]。本研究設(shè)計的3對特異性引物和探針，優(yōu)化后的多重qPCR能對靶細菌的單一或混合基因組DNA進行特異性擴增，對其它13株菌株的基因組DNA則無擴增，表明本試驗所建立的qPCR方法特異性強。

為了驗證所建立多重qPCR方法在實際中檢測樣品的可行性，本研究用建立的新方法檢測30份生鮮肉，同時采用國標(biāo)法進行比對驗證。結(jié)果表明，應(yīng)用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測大腸桿菌O157:H7和金黃色葡萄球菌的檢出率略低于qPCR方法。有文獻也報道了類似的結(jié)果[16,20-22]。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測的是能在培養(yǎng)基上生長的活菌落，而qPCR方法檢測的是病原菌的核酸，無法區(qū)分死菌和活菌[16,22]。此外，有些細菌處于休眠狀態(tài)但無法培養(yǎng)生長[23]。因此，與國標(biāo)法相比，qPCR方法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

綜上，本研究針對大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌建立的多重qPCR方法具有特異性強、檢測迅速等優(yōu)點，可為生鮮肉中3種食源性致病菌檢測提供一種快速、準(zhǔn)確的檢測手段。