徐 熠，劉 靜，黃 瑾，崔金剛 （. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 00437；. 上海市中醫(yī)藥研究院中西醫(yī)結(jié)合臨床研究所，上海 00437）

痛風(fēng)在中醫(yī)理論中屬于“痹證”、“白虎歷節(jié)”范疇[1]。中醫(yī)辨證分型主要有濕熱蘊(yùn)結(jié)型、寒濕痹阻型、肝腎虧虛型、痰瘀痹阻型、瘀血阻滯型、脾虛濕盛型和寒熱錯(cuò)雜型[2]，在治療上主要以泄?jié)崂麧?、通絡(luò)止痛為主[3]。茵連痛風(fēng)顆粒為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院自制制劑，是著名夏氏外科傳人夏涵教授數(shù)十年的經(jīng)典經(jīng)驗(yàn)方。該制劑由茵陳、連錢草和伸筋草三味中藥組成，用于治療間歇期痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[4]。茵連痛風(fēng)顆粒的成分多樣，前期研究中發(fā)現(xiàn)其不同部位群對(duì)痛風(fēng)模型大鼠均有不同程度的抗炎鎮(zhèn)痛作用[5]，但其作用有效成分和疾病靶標(biāo)的關(guān)系尚不明確，抗炎鎮(zhèn)痛作用可能與香豆素[6]、黃酮、有機(jī)酸[7]、三萜類、生物堿類以及蒽醌類[8]等成分有關(guān)。因此，筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)茵連痛風(fēng)顆粒的抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制進(jìn)行分析，預(yù)測茵連痛風(fēng)顆粒的主要活性成分和潛在靶標(biāo)部位，以期為該制劑建立臨床療效的質(zhì)量評(píng)估體系提供支持。

1 材料與方法

1.1 茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞旨鞍悬c(diǎn)的篩選

本研究利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(TCMSP)[9]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢 索獲得茵連痛風(fēng)顆粒中三味中藥的化學(xué)成分，通過TCMSP 篩選出化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)，預(yù)測成分的口服利用度(OB) 和類藥性(DL)[10]，以O(shè)B≥30%且DL≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分，再將其依次輸入TCMSP，查找得到潛在的靶點(diǎn)蛋白，并通 過Uniprot 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.uniprot.org/）[11]匹配蛋白所對(duì)應(yīng)的基因。

1.2 茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞?預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將茵連痛風(fēng)顆粒的活性成分及潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org /），構(gòu)建并預(yù)測茵連痛風(fēng)顆粒的活性成分及靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的收集

基于OMIM 數(shù)據(jù)庫[12]檢索抗炎、鎮(zhèn)痛相關(guān)靶蛋白基因，搜索關(guān)鍵詞"pain"、"ache"、"soreness"、"inflammation"、"inflammatory"，所有靶標(biāo)均通過UniProt 數(shù)據(jù)庫獲取其UniProt ID 信息。

1.4 茵連痛風(fēng)顆粒蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將OMIM 中獲取到的蛋白質(zhì)信息導(dǎo)入STRNG數(shù)據(jù)庫，篩選出蛋白相互作用分值＞0.7 的高置信數(shù)據(jù)[13]，用Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建與抗炎鎮(zhèn)痛有關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI) 網(wǎng)絡(luò)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)合并

利用Cytoscape 3.7.2 中的Merge 功能，將茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞?預(yù)測靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與抗炎鎮(zhèn)痛的PPI 網(wǎng)絡(luò)合并，確定兩者共有的潛在作用靶點(diǎn)。通過Cytoscape3.7.2 構(gòu)建茵連痛風(fēng)顆粒活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并分析茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛的潛在靶點(diǎn)。

1.6 通路及生物過程的富集分析

采用David v6.8 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[14-16]，對(duì)與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞?潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行基于基因組百科全書(KEGG)的生物通路富集分析，并利用OmicShare 對(duì)通路進(jìn)行可視化，采用Davidv6.8數(shù)據(jù)庫，對(duì)與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的茵連痛風(fēng)顆粒活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行基因本體GO 功能富集分析[13]。

2 結(jié)果

2.1 茵連痛風(fēng)顆粒活性成分篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中搜索“茵陳”、“連錢草”、“伸筋草”三味中藥的化學(xué)成分，共得到175 個(gè)化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%且DL ≥0. 18 作為篩選條件，刪除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分，共獲得23 個(gè)潛在有效成分（表1），其中，茵陳和連錢草共有成分為槲皮素和β-谷甾醇[17]（圖1）。

表1 茵連痛風(fēng)顆粒23 個(gè)有效活性成分及其OB 及DL 值

2.2 茵連痛風(fēng)顆粒活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選出的23 個(gè)茵連痛風(fēng)顆粒潛在有效成分導(dǎo)入到TCMSP，查找相應(yīng)的靶點(diǎn)，得到686 個(gè)潛在靶點(diǎn)蛋白，并利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫匹配對(duì)應(yīng)基因。將結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞职悬c(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)包含228 個(gè)節(jié)點(diǎn)、686 條邊，紅色六邊形表示茵陳特有的活性成分、紫色六邊形表示連錢草特有的活性成分、綠色六邊形表示伸筋草特有活性成分、黃色箭頭表示兩個(gè)成分共有的活性成分、粉色菱形表示單味藥的作用靶點(diǎn)、湖綠色菱形表示兩味藥共同的作用靶點(diǎn)、藍(lán)色菱形表示三味藥共同的作用靶點(diǎn)。如圖2 所示，23 個(gè)茵連痛風(fēng)顆粒的活性成分均具有多靶點(diǎn)，不同靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)相同成分，不同的成分可對(duì)應(yīng)相同的靶點(diǎn)。

圖1 茵連痛風(fēng)顆粒有效活性成分韋恩圖

2.3 抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)信息的收集和篩選

在OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)的基因，共檢索到286 個(gè)相關(guān)基因靶點(diǎn)。與茵陳活性成分共有32 個(gè)共同靶基因，與連錢草活性成分共有35 個(gè)共同靶基因，與伸筋草活性成分共有7 個(gè)共同靶基因（圖3）。

2.4 茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛靶標(biāo)蛋白-蛋白相互作用分析及網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建

將茵連痛風(fēng)顆粒預(yù)測所得的基因與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)基因進(jìn)行映射后得到共有靶基因，輸入STRNG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析過程中，選取物種為Homosapiens，并將蛋白-蛋白互作得分＞0.7 的基因輸入Cytoscape 3.7.2 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，共有37 個(gè)節(jié)點(diǎn)，285 個(gè)連線。應(yīng)用軟件中的NetworkAnalysis plugin 對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析其在圖中的作用，自由度越大，該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的生物功能則越多。同時(shí)，顏色越深代表該節(jié)點(diǎn)自由度較大、生物功能較多（圖4）。進(jìn)一步對(duì)與抗炎鎮(zhèn)痛潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，網(wǎng)絡(luò)中有17 個(gè)靶點(diǎn)的自由度值大于平均度值15.41，預(yù)測可能為茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞职l(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛療效的潛在靶點(diǎn)。

2.5 GO 功能和KEGG 通路的富集分析

圖2 茵連痛風(fēng)顆粒主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖3 茵連痛風(fēng)顆?；钚猿煞窒嚓P(guān)基因與抗炎鎮(zhèn)痛相關(guān)基因

圖4 茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛蛋白-蛋白相互作用圖

圖5 茵連痛風(fēng)顆粒抗炎鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)的GO 富集

利用David 平臺(tái)進(jìn)行GO 功能富集分析，得到了293 個(gè)GO 條目，根據(jù)P＜0.05 篩選出211 個(gè)GO條目，針對(duì)前10 條BP 分析、CC 分析、MF 分析繪制直方圖（圖5）。其中，生物過程條目170 條，主要包括炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)的正調(diào)控、IL -6 的正調(diào)控等；細(xì)胞組成條目16 個(gè)，主要包括I-kappaB/NFkappaB 復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域、GABA-A 受體復(fù)合物等；分子功能條目25 條，主要包括細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚活性等。

利用David 平臺(tái)的KEGG 通路富集分析功能，得到79 條信號(hào)通路，根據(jù)P＜0.001 篩選出50 條信號(hào)通路（圖6）；包括TNF 信號(hào)通路、NOD 受體信號(hào)通路、NAFLD、MAPK 信號(hào)通路、Ras 信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子B 信號(hào)通路等。

2.6 活性成分-靶點(diǎn)-通路圖的構(gòu)建

基于上述信息，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路圖，以全面闡述茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛的作用機(jī)制（圖7）;圖中有112 個(gè)節(jié)點(diǎn)和462 條邊，綠色菱形代表茵連痛風(fēng)顆粒活性成分，紅色圓形代表潛在靶點(diǎn)，黃色箭頭代表信號(hào)通路，邊代表三者之間的相互作用，節(jié)點(diǎn)越大表示其抗炎鎮(zhèn)痛的作用越大。

圖6 茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛關(guān)鍵靶基因KEGG 通路富集

圖7 茵連痛風(fēng)顆粒抗炎鎮(zhèn)痛活性成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

茵連痛風(fēng)顆粒由茵陳、連錢草和伸筋草三味中藥組成，茵陳具有清利濕熱、利膽退黃的功效；連錢草具有利濕通淋，清熱解毒，散瘀消腫的功效；伸筋草具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)的功效。三者合用增強(qiáng)了清熱利濕，通絡(luò)止痛的作用[18]。

本研究通過TCMSP、Uniprot 數(shù)據(jù)庫篩選潛在的抗炎鎮(zhèn)痛活性成分，得出槲皮素、β-谷甾醇、茵陳色原酮、異鼠李素等23 個(gè)黃酮類、甾體類成分。這些成分與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分相符[19-22]。其中，共有成分槲皮素為黃酮類化合物，有研究表明槲皮素對(duì)炎癥反應(yīng)具有良好的抑制作用，對(duì)化學(xué)刺激疼痛模型和熱刺激疼痛模型均有顯著的鎮(zhèn)痛作用[23]。共有成分β-谷甾醇為甾體類化合物，具有類似于氫化可的松的抗炎活性，其抗炎機(jī)制主要是通過局部免疫調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗炎作用[24]。

通過OMIM 數(shù)據(jù)庫、STRNG 數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件構(gòu)建抗炎鎮(zhèn)痛靶標(biāo)蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)，揭示茵連痛風(fēng)顆粒通過多靶點(diǎn)起到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。本研究共得到PTGS2、TNF、IL-6、IL-10 等37 個(gè)茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶PTGS），又稱為環(huán)氧合酶（COX），存在兩個(gè)亞型，即COX-1 和COX-2[25]。PTGS2 產(chǎn)生炎癥性前列腺素，參與炎癥的發(fā)生，同時(shí)與其他預(yù)測所得出的靶點(diǎn)都有密切聯(lián)系[26-27]。TNF[28]、IL-6有致痛和痛覺增敏的作用，IL-10 有活性較強(qiáng)的抗炎作用，除具抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生外，還能促進(jìn)其他抗炎因子的產(chǎn)生、下調(diào)促炎因子受體的表達(dá)[29]。PTGS2 等靶點(diǎn)是抗炎鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)，在炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)等生物過程中起著至關(guān)重要的作用。

KEGG 富集結(jié)果表明，茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛關(guān)鍵靶點(diǎn)基因顯著富集在TNF 信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、核轉(zhuǎn)錄因子B 信號(hào)通路等。茵陳中的黃酮類成分具有重要的抗炎活性，其潛在的抗炎機(jī)制可能與其對(duì)NF-κB 和MAPK 信號(hào)通路的抑制有關(guān)[6]。研究表明[30]，茵陳色原酮通過JNK 途徑激活轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）及其下游靶標(biāo)血紅素加氧酶1（HO-1）水平，減弱LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，也可有效抑制MyD88 和Toll/IL-1 接頭蛋白（TIRAP）介導(dǎo)的信號(hào)通路，進(jìn)而抑制LPS 誘導(dǎo)的NF-κB、蛋白激酶B（Akt）和MAPK 激活的炎癥基因活化，從而發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對(duì)茵連痛風(fēng)顆粒抗炎鎮(zhèn)痛的多成分、多靶點(diǎn)和多信號(hào)通路進(jìn)行相關(guān)性研究，初步揭示了茵連痛風(fēng)顆粒中三味中藥的抗炎鎮(zhèn)痛分子機(jī)制，為進(jìn)一步開展和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證茵連痛風(fēng)顆?？寡祖?zhèn)痛作用機(jī)制提供理論依據(jù)。