葉子煜，張 翔，朱睿睿，謝國勇，趙玉成，秦民堅

(中國藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，江蘇 南京 211198)

粗毛豚草素又稱高車前素(Hispidulin)，是一種天然的類黃酮化合物，能夠通過誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制細胞周期、影響血管生成和轉(zhuǎn)移來抑制癌細胞的生長，已成為預(yù)防和治療癌癥的一種重要補充藥物[1]。癌癥是世界范圍內(nèi)的一個重要的公共健康問題，據(jù)估計，到2050年癌癥死亡人數(shù)將增加到1750萬[2]，對癌癥藥物的需求也將急劇增加。雖然粗毛豚草素廣泛存在于多種中草藥，但是由于藥用植物來源受地域、季節(jié)、自然環(huán)境等因素的限制，且粗毛豚草素在植物中含量較低，天然來源的粗毛豚草素?zé)o法滿足臨床上日益增長的需求。研究人員也試圖開發(fā)粗毛豚草素的化學(xué)合成方法，卻由于其可行性和產(chǎn)率較低，一直沒有取得理想的效果[3-8]。因此，代謝工程成為提高粗毛豚草素產(chǎn)量的理想手段之一。本研究對粗毛豚草素生物合成途徑及相關(guān)酶基因的研究進展進行綜述，為進一步利用代謝工程生產(chǎn)粗毛豚草素或提高其產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。

1 粗毛豚草素的合成

1.1 粗毛豚草素

粗毛豚草素(4′,5,7-三羥基-6-甲氧基黃酮)是天然存在的多酚類化合物，在植物界分布廣泛，主要分布于菊科、唇形科、馬鞭草科、玄參科和鳶尾科植物的地上部分，如荔枝草(Salviaplebeia)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、新疆雪蓮(Saussureainvolucrate)[9]。近年來，粗毛豚草素因其廣泛的生物活性受到了國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，包括抗炎、抗菌、抗骨質(zhì)疏松，尤其是抗癌活性[5]。大量研究表明，粗毛豚草素對結(jié)腸癌[10]、卵巢癌[11]、胃癌[12]、膽囊癌[13]、腎癌[14]、肝細胞癌[15]等多種人類癌細胞系都有較好的活性。另外，粗毛豚草素與多種抗癌藥物聯(lián)合使用可顯著增強抗癌藥物對癌細胞的細胞毒性[13,16]。

1.2 粗毛豚草素的化學(xué)合成

為了獲得更多粗毛豚草素，已有文獻報道了一些合成方法。一種是通過保護黃芩素C-7位和C-4′位上的羥基，使C-6位羥基發(fā)生甲基化從而形成粗毛豚草素[3,4,7]，另一種是從簡單的原料2,4,6-三羥基苯乙酮或2,4,6-三羥基苯甲醛出發(fā)，通過底物設(shè)計合成粗毛豚草素[5,8,17]。但是無論采用哪一種方法都無法實現(xiàn)粗毛豚草素的大規(guī)模制備。一方面是因為從植物中分離純化黃芩素的過程十分繁瑣，另一方面是因為合成過程中羥基選擇性保護和脫保護效果不佳，同時化學(xué)合成常常伴隨著高能耗和環(huán)境污染。因此，很有必要開發(fā)如代謝工程這種更經(jīng)濟有效的生產(chǎn)粗毛豚草素的方法。

1.3 粗毛豚草素的生物合成

類黃酮化合物是一類廣泛存在于植物中的重要次生代謝物，已通過遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等途徑在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、黃芩(Scutellariabaicalensis)、玉米(ZeamaysL.)、紅花(CarthamustinctoriusL.)等多種植物中得到了廣泛的研究。粗毛豚草素是植物類黃酮生物合成途徑的產(chǎn)物，位于苯丙素生物合成途徑的下游。苯丙素生物合成途徑是植物最重要的次生代謝途徑之一，一切含苯丙烷骨架的化合物都由該途徑直接或間接形成，其下游支路的產(chǎn)物類黃酮化合物在植物繁殖和發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮作用，并作為生物環(huán)境的信號分子參與抵御各種生物和非生物脅迫[18]。如圖1所示，苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是煙草中生產(chǎn)苯丙素化合物的限速酶[19]，由初生代謝產(chǎn)物苯丙氨酸(Phenylalanine)生成次生代謝產(chǎn)物的關(guān)鍵酶，也是催化粗毛豚草素合成的第一個酶。PAL通過非氧化脫氨反應(yīng)將苯丙氨酸變成肉桂酸(Cinnamic acid)，且催化過程中不需要輔助因子的參與。隨后肉桂酸在肉桂酸4-羥化酶(Cinnamate 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酰輔酶A連接酶(4-Coumarate:coenzyme A ligase, 4CL)的作用下生成查爾酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)的前體化合物——4-香豆酰輔酶A(4-Coumaroyl-CoA)。查爾酮合酶是黃酮類化合物合成的起始酶，其產(chǎn)物柚皮素查爾酮(Naringenin chalcone)通過查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)轉(zhuǎn)化為二氫黃酮-柚皮素(Naringenin)，隨后在黃酮合成酶(Flavone synthase, FNS)的作用下生成黃酮芹菜素(Apigenin)。芹菜素是一種常見的膳食類黃酮，已被證明對多種癌細胞系具有生長抑制作用[20]，在黃酮6-羥化酶(Flavone 6-hydroxylase, F6H)和黃酮6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(Flavone 6-O-methyltransferase, F6OMT)的作用下芹菜素最終被轉(zhuǎn)化為粗毛豚草素。此外，Kyndt等人于2002年首次從莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)中發(fā)現(xiàn)的微生物酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase, TAL)，能夠?qū)⒗野彼?Tyrosine)直接轉(zhuǎn)化為4-香豆酸(4-Coumaric acid)[21]，因其步驟簡單、效率高常被應(yīng)用于工程菌中生產(chǎn)次生代謝物。

雖然我們根據(jù)不同物種中類黃酮的生物合成途徑推測了參與粗毛豚草素生物合成的全部基因，但是目前該化合物在植物體中完整的生物合成過程還沒有被報道。因此對該途徑中相關(guān)酶基因的研究進展進行匯總比較，不僅有利于研究粗毛豚草素在植物體中的生物合成過程，更能夠進一步為利用代謝工程生產(chǎn)粗毛豚草素或提高其產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)。

2 粗毛豚草素生物合成相關(guān)基因

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，藥用植物的活性成分及其生物合成途徑的基因研究已引起越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前已經(jīng)在擬南芥、芹菜、黃芩等植物中發(fā)現(xiàn)了柚皮素、芹菜素、野黃芩素等前體化合物的生物合成途徑，編碼該途徑的PAL、CHS、FNS等酶的基因也被充分鑒定出來，利用生物和非生物脅迫以及代謝工程來調(diào)控這些基因的表達水平可以直接影響特定代謝物的產(chǎn)生和含量的變化。

2.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)

PAL是粗毛豚草素合成的首個啟動酶和限速酶，其發(fā)揮功能的主要區(qū)域為丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)組成的活性位點(MIO)[22]。自1961年首次從大麥(HordeumvulgareL.)中分離出PAL蛋白[23]，迄今為止PAL已被證明廣泛存在于單子葉植物、雙子葉植物以及裸子植物中。不同植物中PAL基因的數(shù)量差異很大，虎眼萬年青(Ornithogalumcaudatum)和覆盆子(RubusidaeusL.)中僅發(fā)現(xiàn)了兩條PAL基因[24-25]，而水稻(OryzasativaL.)基因組包含了9個PAL基因[26]，玉米中PAL基因更是高達20條[27]。但是在粗毛豚草素分布最廣泛的矢車菊屬(Centaurea)、大翅薊屬(Onopordon)和鼠尾草屬(Salvia)植物中并沒有很多關(guān)于PAL的報道。與PAL不同，TAL廣泛分布于微生物中，雖然玉米中的PAL已被證明能夠同時催化苯丙氨酸和酪氨酸進行脫氨[28]，高等植物中還是很少有TAL的存在。TAL以組氨酸(His-89)殘基為單一的活性位點，負責(zé)與酪氨酸反應(yīng)。研究表明，用苯丙氨酸(Phe)取代其活性位點，可以將其底物選擇性從酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼?，從而轉(zhuǎn)化為高活性的PAL，當(dāng)PAL發(fā)生相應(yīng)突變時，PAL也可獲得相應(yīng)的TAL活性[29]。

圖1 粗毛豚草素可能的生物合成途徑Fig. 1 The possible biosynthetic pathway of hispidulin

在高等植物中，PAL表達水平的變化是控制苯丙素生物合成的關(guān)鍵因素[30]。在水母雪蓮花(Saussureamedusa)中，谷胱甘肽和茉莉酸甲酯能夠通過誘導(dǎo)PAL的活性提高懸浮培養(yǎng)細胞中粗毛豚草素的含量[31,32]。在大豆(Glycinemax)中，病原體可以通過PAL途徑誘導(dǎo)水楊酸的生物合成[33]。作為連接初生代謝物和次生代謝物的關(guān)鍵酶，PALs和TALs也被廣泛應(yīng)用于異源宿主中生產(chǎn)含苯丙烷骨架的化合物。但是由于參與4-香豆酸合成的C4H(肉桂酸4-羥化酶)需要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，不利于在大腸桿菌等原核生物中進行活性表達，因此TAL常常作為C-4′位有羥基的黃酮類化合物合成的起始酶[34]。Kawai等人將類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)的TAL(RsTAL)構(gòu)建到變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)中，使其能夠以培養(yǎng)基中的葡萄糖或纖維二糖為碳源生產(chǎn)4-香豆酸[35]。Tantong等人的研究表明，表達了TAL的集胞藻(Synechocystis)PCC 6803在Ptrc1O啟動子的作用下能夠顯著提高4-香豆酸的產(chǎn)量，且培養(yǎng)基中酪氨酸濃度為0.5 mM時其轉(zhuǎn)化率最高[36]。

2.2 查爾酮合成酶(CHS)

CHS是類黃酮途徑的起始酶，是第一個被發(fā)現(xiàn)的Ⅲ型植物聚酮合酶(Polyketide synthases, PKS)，負責(zé)催化一系列脫羧、縮合和環(huán)化反應(yīng)。自1983年Reimold等人率先從培養(yǎng)的歐芹(Petroselinumcrispum)細胞中分離出第一個具有代表性的CHS基因之后[37]，已分離出近20個功能不同的CHS超家族，并對其進行了鑒定[38]。目前，除了金魚草(AntirrhinummajusL.)和距花山姜(AlpiniacalcarataRoscoe)中的CHS基因含有兩個內(nèi)含子，虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)中的一個CHS基因含有3個內(nèi)含子外，大多數(shù)植物CHS基因在保守位置均為兩個外顯子包含一個內(nèi)含子，該內(nèi)含子大多長度不等，但多位于第65位半胱氨酸(Cys)密碼子的A、C堿基之間，兩個外顯子分別編碼60和340個左右的氨基酸，在進化過程中相對保守[39-42]。CHS為同型二聚體，每個單體都有深藏在其內(nèi)部的活性位點，而保守的三元催化殘基(Cys-164, His-303, Asn-336)則位于其頂部。在催化過程中Cys-164是親核反應(yīng)的活性位點和聚酮中間體的附著位點，而His-303和Asn-336在丙二酰輔酶A的脫羧作用中發(fā)揮重要作用。其他保守的CHS殘基(Phe-216)可能在聚酮鏈增長的過程中有助于底物在活性位點的定位[43]。除了4-香豆酰輔酶A之外，來自紫苜蓿(Medicagosativa)的CHS還能接受阿魏酰輔酶A、苯乙酰輔酶A、苯甲酰輔酶A、丁基輔酶A等輔酶A連接的硫酯化合物作為底物[44]。

CHS主要在花中表達，通過異構(gòu)化和官能團的替換影響黃酮醇、黃酮和花青素的合成，從而改變?nèi)~、花和果實的顏色[45]，其表達水平既可以被紫外誘導(dǎo)，也能夠響應(yīng)植物病原體、誘導(dǎo)子以及不同部位傷害的脅迫，從而提高黃酮類化合物的產(chǎn)量[43]。Chen等人在煙草中過表達CHS不僅提高了下游黃酮類化合物的產(chǎn)量，還提高了對鹽脅迫的抵抗力[46]。劉秀明等人從紅花中分離出了與水母雪蓮花親緣關(guān)系最近的CHS，并在擬南芥中進行過表達，也獲得了高黃酮含量的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株[47]。Ali等人用10-5M的水楊酸處理姜(ZingiberofficinaleRoscoe)后可提高CHS 的活性，從而顯著提高了柚皮素的含量，奇怪的是芹菜素的含量卻顯著降低[48]。這可能與先前研究發(fā)現(xiàn)的芹菜素在體外對黑麥(SecalecerealeL.)CHS有明顯的抑制作用有關(guān)[49]。雖然還沒有直接證據(jù)表明這種抑制作用也在體內(nèi)發(fā)生，但似乎黃酮類化合物在細胞質(zhì)中會積累到阻止CHS活性的水平，從而避免代謝物對植物的毒性作用[50]。CHS是形成中心代謝物柚皮素的關(guān)鍵酶，而柚皮素是合成粗毛豚草素的關(guān)鍵中間體。目前在利用微生物將芳香族化合物轉(zhuǎn)化為柚皮素的研究中，柚皮素的生物合成多數(shù)是依靠來自不同植物或細菌功能基因的重組表達[51-52]。而維持供體特異性蛋白-蛋白相互作用可以改善途徑動力學(xué)和特異性的假設(shè)表明，同一來源的基因的異源共表達有利于柚皮素的產(chǎn)生[53]。如圖2所示，Koopman等人構(gòu)建了來自單一物種擬南芥中柚皮素生物合成相關(guān)基因的表達譜，從中選擇了最優(yōu)基因?qū)脶劸平湍?Saccharomycescerevisiae)，并對該工程菌進行改造及優(yōu)化，首次實現(xiàn)了以葡萄糖為唯一碳源生產(chǎn)超過400 μM的柚皮素[54]。該菌株通過減輕酵母3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶的反饋抑制作用增加了苯丙氨酸的合成，并通過消除競爭性苯丙酮酸脫羧酶的活性減少副產(chǎn)物的形成，是生產(chǎn)粗毛豚草素的理想平臺。

2.3 黃酮合成酶(FNS)

FNS通過在底物黃烷酮的C-2和C-3之間引入雙鍵來形成黃酮化合物，分為FNS Ⅰ和FNS Ⅱ兩種類型。FNS Ⅰ為可溶性Fe2+/2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶(2-ODD)，與黃烷酮3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase, F3H)、黃酮醇合成酶(Flavonol synthase, FLS)和花青素合成酶(Anthocyanidin synthase, ANS)等2-ODD家族其他酶的同源性較高，都有兩個相同的保守結(jié)構(gòu)域(DIOX_N和2OG-Fell_Oxy)，因此僅從蛋白序列上很難進行區(qū)分[55]。FNS Ⅰ于1981年首次被發(fā)現(xiàn)于傘形科植物歐芹，隨后定點突變結(jié)果表明該FNS Ⅰ很可能是F3H演變而來，在FNS Ⅰ被發(fā)現(xiàn)于水稻、玉米等單子葉植物之前，F(xiàn)NS Ⅰ一直被認為是傘形科植物所特有的[56]。與FNS Ⅰ不同，F(xiàn)NS Ⅱ為依賴分子氧和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的細胞色素P450單加氧酶，是一種膜結(jié)合蛋白，在含有黃酮類代謝物的植物中分布廣泛。所有已表征的FNS Ⅱ酶都屬于P450 CYP93家族，大部分FNS Ⅱ可以直接將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃酮，沒有任何中間產(chǎn)物[57]。然而，來自雙子葉植物刺甘草(Glycyrrhizaechinata)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的CYP93B家族的成員，以及來自單子葉植物高粱(Sorghumbicolor)和水稻的CYP93G家族的成員在重組酶分析中顯示出黃烷酮2-羥化酶活性，并且只能在酸處理后的反應(yīng)產(chǎn)物中檢測到黃酮。這些酶參與2-羥基柚皮素或黃酮碳苷的生物合成，實際上屬于黃烷酮2-羥化酶(Flavanone 2-hydroxylase)[58-61]。此外，來自苔蘚植物鈍鱗紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)的FNS Ⅰ也被發(fā)現(xiàn)能夠?qū)㈣制に剞D(zhuǎn)化為芹菜素和2-羥基柚皮素，同源性建模和定點突變結(jié)果表明其Tyr-240殘基是合成2-羥基黃烷酮的關(guān)鍵[62]。

圖2 柚皮素在釀酒酵母中的合成途徑Fig. 2 Synthesis pathway of naringenin in S. cerevisiae注：Aro3/Aro4為3-脫氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶。

關(guān)于FNS在植物體內(nèi)的作用機理及調(diào)控其表達水平的研究不及PAL和CHS豐富。Tan等人在轉(zhuǎn)基因芹菜(ApiumgraveolensL.)中過表達FNS可顯著增加芹菜葉柄中芹菜素的含量[63]。芹菜素是FNS的催化產(chǎn)物，也是合成粗毛豚草素的重要前體化合物。芹菜素在植物中分布廣泛，對正常細胞的內(nèi)在毒性較低，并能誘導(dǎo)植物的抗氧化防御系統(tǒng)。最近的一項研究表明，來自黃絲瓜蘚(Pohlianutans)的FNS Ⅰ主要分布在細胞質(zhì)中，在擬南芥中過表達PnFNS Ⅰ可促進芹菜素的合成，提高活性氧清除酶的活性，同時減輕柚皮素引起的生長抑制，增強了轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫和紫外線輻射的抵抗力[64]。Lam等人通過敲除水稻中的FNS Ⅱ發(fā)現(xiàn)突變體中類黃酮合成基因的表達水平?jīng)]有顯著變化，但是細胞壁中芹菜素等黃酮類化合物大量減少[65]。Jiang等人在大豆中利用RNA干擾沉默F(xiàn)NS Ⅱ基因抑制了芹菜素的合成，同時顯著提高了異黃酮染料木素的含量[66]。這是由于在植物體中黃酮和異黃酮合成途徑競爭同一底物柚皮素，因此在植物體中抑制異黃酮合成酶(Isoflavone synthase, IFS)、FLS、F3H等與FNS存在競爭關(guān)系的酶，也是提高粗毛豚草素產(chǎn)量的有效手段之一。此外，近年關(guān)于利用工程菌合成芹菜素的研究主要集中于大腸桿菌(Escherichiacoli)、白色鏈霉菌(Streptomycesalbus)等原核生物。由于FNS Ⅱ為細胞色素P450依賴型單加氧酶，不僅需要與細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，還需要NADPH-細胞色素P450還原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase, CPR)提供電子，而原核生物中沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，因此來自歐芹的不需要與膜結(jié)合的PcFNS Ⅰ在構(gòu)建生產(chǎn)芹菜素的工程菌中備受青睞[67]。而大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的外膜含有內(nèi)毒素，對人體不利且不易去除，所以白色鏈霉菌等革蘭氏陽性菌成為了工業(yè)上生產(chǎn)粗毛豚草素理想的生物反應(yīng)器[68]。Laura等人已利用PcFNS Ⅰ等來自不同物種的基因在白色鏈霉菌中成功構(gòu)建了芹菜素的合成途徑[69]。

2.4 其他基因

C4H屬于P450 CYP73家族，是粗毛豚草素合成途徑的第一個羥化酶，也是植物中第一個被鑒定的CYP450單加氧酶，目前已從擬南芥、大豆、地黃等多種植物中分離[70]。C4H定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，共包含兩個核心結(jié)構(gòu)域：一是N端螺旋狀的富含脯氨酸的疏水結(jié)構(gòu)域，是蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的錨點，二是C端半胱氨酸亞鐵血紅素結(jié)合域[71]。最近，Bixia等人分析了高粱C4H蛋白(CYP73A33)的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)C4H的結(jié)構(gòu)和功能特征與其他P450蛋白高度相似，利用Phe-107、Val-118、Phe-119、Val-301、Ala-302、ILe-367、Val-371和Phe-484的疏水側(cè)鏈與肉桂酸的苯丙烯部分結(jié)合[72]。研究表明C4H的過表達可以增加黃酮等酚類化合物的積累，從而增強植株對干旱、鹽、H2O2等脅迫的抗性[73-75]。4CL也是調(diào)節(jié)類黃酮等次生代謝產(chǎn)物生物合成的關(guān)鍵酶，在植物體中通常由多個基因編碼，同工酶大多分為兩類，Ⅰ型4CL與木質(zhì)素的生物合成有關(guān)，Ⅱ型4CL主要負責(zé)類黃酮的合成[76]。來自毛白楊(Populustomentosa)的4CL蛋白晶體研究表明，具有催化活性的氨基酸殘基Lys-438、GIn-443和Lys-523為4CL的活性位點，Tyr-236、Gly-306、Gly-331、Pro-337和Val-338負責(zé)底物識別。4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸都可以被4CL催化，而4CL的底物特異性由底物識別口袋的大小決定[77]。此外，4CL基因家族還包括腺苷酸形成酶——4CL-like基因，與具有兩個保守肽基序(AMP結(jié)合域，Box Ⅰ，SSGTTGMPKGV和催化活性中心，Box Ⅱ，GEICIRG)的真實4CL基因高度相似，只是4CL-like酶對4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等底物沒有活性，且大多數(shù)4CL-like酶的功能未知[78]。4CL在植物體中的調(diào)控可能與組織特異性表達、不同發(fā)育階段以及環(huán)境脅迫有關(guān)，其調(diào)控機理已在擬南芥、毛白楊、煙草、丹參等植物中得到研究[79-82]。

CHI是粗毛豚草素合成途徑中的另一限速酶，屬于類黃酮生物合成途徑，能夠使柚皮素查爾酮快速異構(gòu)形成柚皮素。雖然CHI不是柚皮素查爾酮異構(gòu)化的必要條件，但在有CHI的情況下柚皮素查爾酮異構(gòu)化的速率是其自發(fā)異構(gòu)化速率的3600萬倍[83-84]。目前發(fā)現(xiàn)的CHI家族基因分為四種類型，Ⅰ型CHI只對柚皮素查爾酮有活性；Ⅱ型CHI不僅作用于柚皮素查爾酮，還能催化異甘草素(6′-脫氧查爾酮)形成甘草素(5′-脫氧黃烷酮)，該酶被認為主要存在于豆科植物，近年發(fā)現(xiàn)在苔類、蕨類等植物中也有分布；Ⅲ型和Ⅳ型CHI不具有催化活性，前者在擬南芥中表現(xiàn)出脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid bindingprotein, FAP)的活性，影響脂肪酸在其胚胎發(fā)育過程中的合成及積累；后者可能影響類黃酮及花色素的合成[85-86]。紫苜蓿中CHI的晶體結(jié)構(gòu)表明，兩個水分子和Lys-97、Ala-49、Tyr-15、Tyr-106、Thr-48殘基構(gòu)成了催化中心[87]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)CHI是從沒有催化活性的蛋白演變而來，在進化過程中，催化中心的細微變化使以前不活躍的口袋產(chǎn)生活性，這與酶總是通過失去催化殘基演變成支架蛋白或調(diào)節(jié)蛋白的進化趨勢相反[88]。

F6H和F6OMT分別負責(zé)粗毛豚草素C-6位的羥基化和氧甲基化，是形成粗毛豚草素必不可少的結(jié)構(gòu)基因。目前關(guān)于F6H的研究較少，可能來自兩類CYP450家族，一類是首次從大豆中發(fā)現(xiàn)的CYP71D9家族的類黃酮 6-羥化酶，黃烷酮、二氫黃酮醇等C-2,3位飽和的類黃酮化合物是其最優(yōu)底物，對黃酮、異黃酮的催化效率較低[89]；另一類是來自CYP82D家族的CYP82D33(羅勒，OcimumbasilicumL.)和CYP82D62(辣薄荷，MenthaxpiperitaL.)，只對C-5位羥基化和C-7位氧甲基化的底物有活性，對芹菜素的活性較低[90]。而近年發(fā)現(xiàn)的來自黃芩中的F6H(CYP82D1.1)對黃芩素、芹菜素等黃酮具有廣泛的特異性，因此也被用于代謝工程制備黃芩素及野黃芩素[91-92]。此外，Anzellotti等人從金腰屬植物(Chrysospleniumamericanum)中分離出了一種特別的F6H，只對黃酮醇3,7,4′-三甲基槲皮素有活性，與FNS Ⅰ等同屬于2-ODD家族[93]。植物中的OMTs主要依賴S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)提供甲基，根據(jù)其氨基酸大小分為兩類，Ⅰ型OMT以咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl-CoAO-methyltransferase, CCoAOMT)為主，約23-29 kDa，主要作用于鄰苯二酚類化合物的間位羥基，且與底物結(jié)合的過程需要Mg2+、Ca2+等二價陽離子參與；Ⅱ型OMT以咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeic acidO-methyltransferase, COMT)為主，約38～43 kDa，主要作用于黃酮、木質(zhì)素等化合物的對位羥基，且催化過程不需要金屬陽離子的參與，類黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶多屬于Ⅱ型OMT[94-97]。黃酮O-甲基轉(zhuǎn)移酶主要作用于A環(huán)的C-7位和B環(huán)的C-3′,4′,5′位，目前已鑒定出的F6OMT較少[98]。來自冰葉日中花(MesembryanthemumcrystallinumL.)的Ⅰ型OMT對含鄰二羥基結(jié)構(gòu)的化合物有廣泛活性，但不能特異性催化C-6位羥基[99]。此外，來自羅勒的FOMT3-6對野黃芩素的C-6位羥基也有催化作用，但對C-7位羥基具有更高的活性，且以7-甲基野黃芩素為底物時，其F6OMT活性被F4′OMT活性取代[100]。而柑橘(Citrusdepressa)中的Ⅱ型OMT不僅具有底物特異性，還具有區(qū)域選擇性，能夠催化單羥基黃酮，對C-3,5,6,7位羥基都有作用[101]。近年從苔蘚植物鈍鱗紫背苔中(P.appendiculatum)分離出了第一個對黃酮C-6位羥基基團表現(xiàn)出底物偏好性的Ⅰ型OMT，能夠?qū)ⅫS芩素和野黃芩素分別轉(zhuǎn)化為千層紙素A和粗毛豚草素，可用于生產(chǎn)粗毛豚草素或提高其含量[102]。

3 結(jié) 語

粗毛豚草素因其良好的抗癌活性受到了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。目前對其生物合成途徑中相關(guān)基因的研究十分豐富，但是參與合成的基因多來自不同植物，還沒有發(fā)現(xiàn)粗毛豚草素在單一植物中生物合成的相關(guān)報道，很多FNS、F6H、F6OMT的結(jié)構(gòu)也有待進一步研究。借助分子生物學(xué)手段研究藥用植物活性成分的生物合成及其調(diào)控機制，并利用代謝工程技術(shù)生產(chǎn)或提高活性成分的產(chǎn)量是現(xiàn)代藥用植物研究的熱點和趨勢。未來，基因工程和代謝工程的發(fā)展以及黃酮類化合物生物合成相關(guān)基因的研究將為粗毛豚草素的臨床研究與應(yīng)用提供堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。