張 笑，李志強(qiáng)，岳 芹，鄒艷敏，歐陽(yáng)臻，韓邦興，魏 淵* *

(1. 江蘇大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012； 3. 皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012； 4. 皖西學(xué)院 金融與數(shù)學(xué)學(xué)院，安徽 六安 237012 )

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛，是蘭科石斛屬的草本植物，主產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽省霍山等地區(qū)?；羯绞闹仓臧?，長(zhǎng)3～9 cm，莖直立由下向上逐漸變細(xì)，呈圓錐狀，形似米粒，花呈淡黃綠色，具有獨(dú)特的地理分布、形態(tài)特征、遺傳結(jié)構(gòu)及藥理活性[1-2]?！侗静菡x》中記載“若老人虛人，胃液不足，而不宜大寒者，則霍山石斛為佳。”[3]?，F(xiàn)代研究表明，霍山石斛含有石斛多糖、生物堿、酚酸、微量元素、氨基酸等多種藥用成分[4-7]，具有抗氧化、抗炎、抗肝損傷、抗腫瘤及抗疲勞等藥理作用[8-12]。

霍山石斛具有良好的抗炎作用，有研究報(bào)道以脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為炎癥模型，觀察霍山石斛多糖的抗炎作用，發(fā)現(xiàn)霍山石斛多糖能抑制炎癥細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，并且半仿生提取方法得到的霍山石斛多糖抗炎作用更佳[13]。霍山石斛的抗炎作用與TNF-α、IL-1、IL-2、IL-1b和IFN-γ等炎癥因子的降低相關(guān)[14-16]，且與抑制NF-κB、MAPK及Akt通路的活化有關(guān)[17]。

霍山石斛也具有一定的抗癌活性，可抑制胃癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與c-myc基因和p53基因的表達(dá)有關(guān)[18-19]。同時(shí)，霍山石斛能抑制荷宮頸癌小鼠腫瘤組織的生長(zhǎng)，抗癌機(jī)制與細(xì)胞因子IFN-γ和CD8 +T細(xì)胞的活性相關(guān)[20]。鮑麗娟等[21]研究發(fā)現(xiàn)霍山石斛水提物對(duì)人宮頸癌HelaS3細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞均有不同度的抑制作用。

由于野生霍山石斛的生長(zhǎng)條件苛刻，且對(duì)濕度和光照的要求很高，自然繁殖率低，加上過(guò)度采摘，導(dǎo)致野生霍山石斛瀕臨滅絕[22]。目前人工栽培霍山石斛已逐漸代替野生霍山石斛，其采收期多為每年的秋冬季。然而鮮有不同生長(zhǎng)年限的霍山石斛成分含量與藥效的差異報(bào)道，開展霍山石斛采收期相關(guān)研究可保障藥材質(zhì)量，促進(jìn)霍山石斛產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。《中國(guó)藥典》2020年版對(duì)霍山石斛采收期做出規(guī)定，為每年的11月至翌年的3月采收，但并未對(duì)采收年限做出要求。中藥材的化學(xué)成分復(fù)雜，中藥產(chǎn)生的療效并非某一種成分的單獨(dú)作用效果，而是多組分、多靶點(diǎn)之間共同作用，因此藥材的采收期將直接影響藥材的藥效。多糖為石斛類藥材含量較多的成分之一，其合成過(guò)程受到多種酶的影響，例如磷酸葡糖異構(gòu)酶、GDP-葡萄糖焦磷酸化酶、蔗糖合成酶和淀粉合成酶等[23-24]，多糖的積累與種質(zhì)、產(chǎn)地、生理年齡等因素有關(guān)[25-27]。次生代謝產(chǎn)物的合成途徑多樣，遺傳、環(huán)境以及激素調(diào)控等因素都可能影響其含量，次生代謝產(chǎn)物的積累與藥材質(zhì)量密切相關(guān)，是保證藥材安全、有效、穩(wěn)定的基礎(chǔ)[28-30]。

通過(guò)研究不同生長(zhǎng)年限藥材的物質(zhì)成分含量，可以對(duì)不同生長(zhǎng)年限藥材整體化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，結(jié)合藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及整體藥用價(jià)值，可為藥材的采收期提供更明確的指導(dǎo)。已有不少關(guān)于生長(zhǎng)年限影響藥材藥效成分的研究。彭焱等[31]研究不同生長(zhǎng)年限(2年和3年)的白及5種藥效成分含量差異，綜合其藥用部位(塊莖)產(chǎn)量與藥效成分含量考慮,建議白及采收以其生長(zhǎng)年限3年及以上為宜。夏琴等[32]發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地、不同商品規(guī)格及生長(zhǎng)年限豬苓藥材中麥角甾醇及多糖的含量存在較大差異，麥角甾醇以四年生豬苓樣品含量最高。薛雪等[33]發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)方式及年限的防風(fēng)飲片外觀性狀、內(nèi)在質(zhì)量和療效有明顯差異，并呈現(xiàn)野生防風(fēng)優(yōu)于多年生栽培防風(fēng)優(yōu)于一年生栽培防風(fēng)的變化規(guī)律。

研究不同生長(zhǎng)年限霍山石斛活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異，通過(guò)二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn)探究不同生長(zhǎng)年限霍山石斛的抗炎作用。還比較了不同生長(zhǎng)年限霍山石斛對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，為霍山石斛采收年限提供更充足的依據(jù)，并為霍山石斛抗炎藥效的探究及在腫瘤防治中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

試驗(yàn)選取健康的八周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠，80只，雄性，體重20±2 g，購(gòu)自江蘇大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0053)。12 h明暗交替周期飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，購(gòu)買后正常適應(yīng)性飼養(yǎng)一周用于試驗(yàn)。

試驗(yàn)細(xì)胞為人宮頸癌HeLa細(xì)胞(批號(hào)：CBP60232)，購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑

霍山石斛(D.huoshanense)由皖西學(xué)院韓邦興教授提供和鑒定。

蘆丁(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180324)；石斛酚(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：180924)；石斛堿(北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號(hào)181226)；無(wú)水葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180620)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；胰酶消化液(碧云天生物技術(shù)公司)；青霉素、鏈霉素(美國(guó)Sigma公司)；5-FU(上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；DMEM 培養(yǎng)基(以色列Biological Industries公司)；二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；地塞米松(浙江仙琚制藥有限公司)。

1.3 主要儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent Eclipse plus C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm )色譜柱(美國(guó)Agilent公司)；Spectra Max 190型酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)；SK-1快速混勻器(江蘇中大儀器廠)；TE601-L電子天平(北京Sartorius儀器系統(tǒng)有限公司)；Pic017臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Model 754型紫外分光光度計(jì)(上海現(xiàn)科儀器有限公司)；3111 CO2孵箱(美國(guó)Thermo公司)；1300 SERIES A2超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)；TS110倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BSA1245電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；7mm耳腫脹打孔器(上海泰坦科技股份有限公司)；BuchiR-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；SHB-III循環(huán)水多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

2 方 法

2.1 霍山石斛榨汁液及水提物的提取

霍山石斛榨汁液的制備：將石斛新鮮莖的雜質(zhì)去除，洗凈，剪成小段，稱取10 g放入榨汁機(jī)中榨汁，濾布過(guò)濾，定容至100 mL，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

霍山石斛水提物制備方法為：精密稱取不同生長(zhǎng)年限霍山石斛粉末各5 g，加水200 mL，加熱回流2 h，趁熱過(guò)濾，濃縮后凍干得不同生長(zhǎng)年限霍山石斛水提物。

2.2 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗炎作用

2.2.1 分組及給藥

將 C57BL/6小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、陽(yáng)性組、一年生霍山石斛低劑量組(生藥1.25 g·kg-1，參照《中國(guó)藥典》石斛用量)、一年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)、二年生霍山石斛低劑量組(含生藥1.25 g·kg-1)、二年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)、三年生霍山石斛低劑量組(生藥1.25 g·kg-1)和三年生霍山石斛高劑量組(生藥7.5 g·kg-1)。各給藥組連續(xù)灌胃給藥7 d，每24 h灌胃給藥，空白對(duì)照組給予等量的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予5 mg·kg-1地塞米松。

2.2.2 二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳腫脹

末次給藥1 h后，用移液槍在小鼠右耳的耳中部?jī)蓚?cè)均勻滴30 μL二甲苯致炎，左耳不做處理作為空白對(duì)照，1 h后將小鼠CO2窒息法處死，用打孔器將小鼠兩耳重疊打孔，精密稱量，計(jì)算腫脹度和腫脹抑制率。

腫脹度=右耳重量-左耳重量

2.3 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗腫瘤作用

2.3.1 試驗(yàn)細(xì)胞分組

試驗(yàn)分為陽(yáng)性對(duì)照組(5-FU，50 μg·mL-1)、空白對(duì)照組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的一年生霍山石斛水提物組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的二年生霍山石斛水提物組、濃度分別為(2、4、6、8、10 mg·mL-1)的三年生霍山石斛水提物組。

2.3.2 細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

2.3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

快速?gòu)囊旱奕〕黾?xì)胞凍存管，37℃水浴快速解凍，加到10 mL無(wú)菌離心管中并加入6 mL含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，輕吹混勻，1200 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3.2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，吸除舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液清洗2次，加適量胰蛋白酶消化液消化2 min，加入含10%血清的培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞吹打分散，1000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入適量含10%血清的培養(yǎng)基，置37℃，5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。

2.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(5×104/mL，每孔100 μL)，在CO2孵育箱(37℃，5% CO2)中進(jìn)行培養(yǎng)。分別加入不同濃度的不同生長(zhǎng)年限霍山石斛水提物，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后棄上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)3 h后于450 nm處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

細(xì)胞增殖抑制率(%)=(A0-A1)/A0

注：A0為陰性對(duì)照組，A1為給藥組OD值。

2.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行多成分配對(duì)檢驗(yàn)等處理，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示差異有重要統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛主要成分含量

課題組前期測(cè)定不同生長(zhǎng)年限霍山石斛多糖、總黃酮、總生物堿和石斛酚含量如表1所示[34]。不同生長(zhǎng)年數(shù)霍山石斛的4種化學(xué)成分含量差異較大，其中霍山石斛黃酮和生物堿含量隨年份增加而增加，3年生含量最高，1年生含量最少。而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。

表1 不同生長(zhǎng)年數(shù)霍山石斛4種成分平均含量

3.2 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

與空白組相比，不同生長(zhǎng)年限霍山石斛水提物作用于HeLa細(xì)胞24 h后，質(zhì)量濃度在2-10 mg/mL范圍內(nèi)均可抑制HeLa細(xì)胞活力，且隨著濃度的升高，細(xì)胞增殖抑制作用增強(qiáng)。同一濃度下，3年生霍山石斛水提物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率均高于2年生霍山石斛，1年生霍山石斛對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制率最低，如圖1。

圖1 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛水提物對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 1 Proliferation of HeLa cells inhibited by water extracts of D. huoshanense of different growth years

3.3 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗炎作用比較

與模型組相比較，不同生長(zhǎng)年限霍山石斛低高劑量組均能降低二甲苯所致小鼠的耳腫脹度(P< 0.01)。1年生霍山石斛低高劑量組、2年生低劑量組和3年生低劑量組耳腫脹度抑制均高于地塞米松組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。2年生高劑量組和3年生高劑量組耳腫脹度與地塞米松組沒有顯著性差異(P> 0.05)，表明2年生和3年生高劑量組抗炎效果與陽(yáng)性組相近。各給藥組中，2年生高劑量組小鼠耳腫脹抑制率最高，達(dá)到58.80%，3年生高劑量組耳腫脹抑制率也較高，達(dá)到56.93%。結(jié)果見表2。

表2 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

3.4 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗腫瘤藥性配對(duì)t檢驗(yàn)

為判斷不同生長(zhǎng)年限石斛治療腫瘤是否具有顯著差異，分別提取了1年、2年和3年生的霍山石斛藥性，在不同濃度下分別利用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，表3給出檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示1年期和3年期，以及2年期和3年期配對(duì)檢驗(yàn)的P值都小于0.05，并且隨著濃度增大1年生和2年生之間也呈現(xiàn)顯著性差異，這充分說(shuō)明選擇不同年份的石斛治療腫瘤具有重要意義。

表3 不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗腫瘤藥性配對(duì)t檢驗(yàn)

4 討 論

本試驗(yàn)研究了不同生長(zhǎng)年限霍山石斛活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異以及不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗炎、抗腫瘤作用差異。研究發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)年限霍山石斛4種主要成分差異顯著，各成分含量與生長(zhǎng)年限并不完全成線性增長(zhǎng)關(guān)系。黃酮和生物堿含量隨著生長(zhǎng)年限增加而增加，3年生最高，1年生最低，而2年生多糖和石斛酚含量最高，3年生含量最低。本試驗(yàn)所得2年生霍山石斛多糖含量最高，鐵皮石斛[35]、疊鞘石斛[36]的多糖含量也是2年生最高，但金釵石斛[37]的多糖含量卻是1年生最高。由此可見，不同品種石斛多糖含量與生長(zhǎng)年限的變化規(guī)律并不一致，多糖的合成受多種因素的影響，霍山石斛不同生長(zhǎng)發(fā)育階段多糖含量產(chǎn)生差異有關(guān)的因素仍有待進(jìn)一步研究。

不同生長(zhǎng)年限霍山石斛對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹模型的抗炎作用的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)年限的霍山石斛均具有較好的抗炎作用，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳。4種成分含量測(cè)定結(jié)果顯示2年生霍山石斛多糖和石斛酚含量明顯高于3年生和1年生，有研究報(bào)道，霍山石斛多糖和石斛酚具有抗炎活性[38-41]，由此推測(cè)不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗炎藥效的不同主要與多糖和石斛酚有關(guān)。

不同生長(zhǎng)年限霍山石斛對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果顯示，3年生霍山石斛對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)。4種成分含量測(cè)定中，3年生霍山石斛黃酮和生物堿含量明顯高于其他年限?；羯绞飰A類具備養(yǎng)胃清熱[42]、降低血壓和心率[43]和抗氧化活性[44]。黃酮類物質(zhì)具有抑制肺癌細(xì)胞[45]、卵巢癌細(xì)胞[46]遷移和侵襲、保肝作用[47]。因此，可推測(cè)不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗腫瘤作用差異主要與黃酮類物質(zhì)有關(guān)，是否與生物堿有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本試驗(yàn)通過(guò)研究不同生長(zhǎng)年限霍山石斛4種活性成分多糖、黃酮、生物堿和石斛酚的含量差異以及不同生長(zhǎng)年限霍山石斛抗炎、抗腫瘤作用差異。結(jié)果顯示，2年生霍山石斛的抗炎作用最佳，3年生霍山石斛對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，霍山石斛抗炎藥效可能與多糖和石斛酚有關(guān)，霍山石斛抗腫瘤作用可能與黃酮有關(guān)。本研究為霍山石斛的合理選擇采收期和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的參考依據(jù)。