馮 潔，郭曄紅*，朱文娟，安 青，陳 彬，焦 鵬

(1. 甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070； 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉(CistanchesdeserticolaY. C. Ma)或管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa(Schenk) Wight)干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，亦稱(chēng)大蕓[1]，是我國(guó)名貴的中藥材，也是甘肅省道地藥材之一，主要活性成分為苯乙醇苷類(lèi)和可溶性多糖[2-5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，肉蓯蓉具有助陽(yáng)通便、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用[6-13]，主要用于陽(yáng)痿、不孕、腸燥便秘等[1,4]。

肉蓯蓉傳統(tǒng)寄主植物為藜科植物梭梭(Haloxylonammodendron(C. A. Mey.) Bunge)和白梭梭(HaloxylonpersicumBunge ex Boiss. et Buhse)，具有耐旱、耐寒、耐鹽堿、耐貧瘠等特性[15]，以梭梭為寄主植物種植肉蓯蓉已經(jīng)獲得了成功，但梭梭年生長(zhǎng)量較小，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低[15-16]。為了解決傳統(tǒng)寄主植物的弊端，甘肅地區(qū)技術(shù)人員成功種植以四翅濱藜(Atriplexcanescens(Pursh) Nutt. )為寄主植物的肉蓯蓉，四翅濱藜和梭梭都屬于藜科屬植物，兩者基源相同，這為接種肉蓯蓉提供了科學(xué)依據(jù)，四翅濱藜生物量大，接種成功可為肉蓯蓉提供更多的養(yǎng)分，有益于肉蓯蓉的生長(zhǎng)，研究表明，四翅濱藜在高鹽堿地的造林成活率明顯高于紅柳、多枝檉柳、梭梭等抗鹽堿樹(shù)種[17]，不同寄主植物生長(zhǎng)的肉蓯蓉，產(chǎn)地、采收期的不同也會(huì)使肉蓯蓉的有效成分含量存在差異[18-20]。2015年版《中國(guó)藥典》只規(guī)定了以松果菊苷和毛蕊花糖苷2種苯乙醇苷成分作為指標(biāo)成分，而中醫(yī)理論研究表明，中藥藥效的發(fā)揮是多種有效成分共同作用的結(jié)果，有效成分含量的多少將直接影響中藥藥效，因此僅以2種苯乙醇苷成分并不足以全面反映肉蓯蓉的整體質(zhì)量[21-22]。

由于對(duì)四翅濱藜寄生肉蓯蓉研究較少，而為了探究這種新型寄主植物對(duì)肉蓯蓉的藥效成分的影響，本研究以春、秋2個(gè)采收期的四翅濱藜寄生肉蓯蓉為研究對(duì)象，以梭梭寄生肉蓯蓉為對(duì)照，基于5種有效成分—松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷、可溶性多糖對(duì)肉蓯蓉質(zhì)量進(jìn)行較全面考察和分析，進(jìn)一步揭示了肉蓯蓉整體質(zhì)量特征和道地性品質(zhì)內(nèi)涵。同時(shí)研究甘肅不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉功效成分的差異性，旨在為肉蓯蓉道地產(chǎn)區(qū)和采收季節(jié)的確定提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

梭梭寄生肉蓯蓉分別采收于甘肅省民勤縣、景泰縣、靖遠(yuǎn)縣肉蓯蓉種植基地，四翅濱藜寄生肉蓯蓉采收于甘肅省民勤治沙綜合試驗(yàn)站。樣品經(jīng)流水洗凈，去除泥沙，蒸制軟化，切片，再于70℃烘干，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，備用。

1.2 儀器與試劑

試驗(yàn)儀器：Waters Acquity液相色譜儀，PDA檢測(cè)器，Empower色譜工作站及四元溶劑管理系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；AL104分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；超聲波清洗機(jī)(深圳市得康科技有限公司)；超純水器-優(yōu)普系列(成都優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司)；DK-Ⅱ數(shù)顯恒溫水浴鍋(天津伊若達(dá)儀器設(shè)備有限公司)；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(東莞市宏誠(chéng)光學(xué)制品有限公司)。

試驗(yàn)試劑：蒽酮、濃硫酸、乙醇、對(duì)照品松果菊苷(批號(hào)82854-37-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)、肉蓯蓉苷A(批號(hào)93236-42-1，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%)、毛蕊花糖苷(批號(hào)61276-17-3，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)均購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；管花苷A(批號(hào)112516-05-9，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水葡萄糖購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；甲酸(德國(guó)Merck公司，色譜純)；甲醇(德國(guó)Merck公司，色譜純)；超純水，其他試劑均為分析純。

2 測(cè)定方法

2.1 苯乙醇苷成分的測(cè)定

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為0.57、0.16、0.016、0.048 mg·mL-1混合溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備

稱(chēng)定樣品粉末1.0 g，置100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱(chēng)定，浸泡30 min，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)40 min，待冷卻至室溫，稱(chēng)定，加50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.1.3 色譜條件

色譜柱Waters Symmetry C18(50 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫梯度0～5 min，15%～20%A；5～12 min，20%～45%A；12～16 min，45%～55%A；16～20 min，55%～35%A；20～22 min，35%～15%A；22～24 min，15%A；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。對(duì)照品和供試品的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)和供試品(B)HPLC圖Fig.1 HPLC Chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B)注：1.松果菊苷； 2.肉蓯蓉苷A； 3.管花苷A ；4.毛蕊花糖苷。

2.1.4 線性關(guān)系考察

分別取上述混合對(duì)照品溶液0.5、5、10、15、20 μL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為松果菊苷Y=1×106X+44933，r=0.999 8，線性范圍0.285～11.4 μg；肉蓯蓉苷AY=1×106X-4454.9，r=0.999 9，線性范圍0.08～3.2 μg；管花苷AY=2×106X-9819.9，r=0.999 2，線性范圍0.008～0.32 μg；毛蕊花糖苷Y=1×106X-12 989，r=0.999 4，線性范圍0.024～0.96 μg。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4種對(duì)照品各自的峰面積，結(jié)果松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面積RSD值分別為0.20%、0.18%、2.10%、1.45%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批肉蓯蓉樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。計(jì)算得到松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷的RSD值分別為0.08%、0.40%、1.11%、0.81%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批肉蓯蓉樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、12、24 h進(jìn)樣，記錄松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A和毛蕊花糖苷峰面積，RSD值分別為0.45%、1.68%、1.89%、1.05%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的肉蓯蓉樣品0.5 g，精密稱(chēng)取6份，分別加入適量對(duì)照品溶液，加50%甲醇補(bǔ)足至50 mL，按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得松果菊苷、肉蓯蓉苷A、管花苷A、毛蕊花糖苷平均加樣回收率分別為103.24%、103.54%、97.67%、101.01%，RSD分別為4.18%、3.89%、3.90%、3.32%，加樣回收率良好。

2.1.9 含量測(cè)定

按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品，分別精密吸取供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀測(cè)定。

2.2 可溶性多糖測(cè)定

2.2.1 供試品溶液制備

取干燥后的肉蓯蓉粉末1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入95%乙醇50 mL，超聲30 min，趁熱過(guò)濾，重復(fù)提取1次，濾渣揮干乙醇后加水50 mL，超聲處理30 min，重復(fù)提取1次。合并濾液，加活性炭吸附脫色，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，密塞，搖勻，取1 mL溶液至50 mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，即得可溶性多糖供試液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)定葡萄糖對(duì)照品12.3 mg，加蒸餾水溶解并定容至100 mL棕色量瓶中。吸取1、3、5、7、8、9 mL分別置于10 mL量瓶中，蒸餾水定容至刻度線，即得到不同濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.3 含量測(cè)定

以蒸餾水做空白對(duì)照，取蒸餾水與供試品各2 mL，冰水浴中緩慢加硫酸-蒽酮試液5 mL，搖勻，沸水浴10 min，冷卻，于626 nm波長(zhǎng)下測(cè)定。

2.2.4 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)RSD值為0.65%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD值為4.55%，表明供試品在2 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；重復(fù)性試驗(yàn)RSD值為0.05%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行方差分析。

3 結(jié)果及分析

3.1 不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉苯乙醇苷含量

以甘肅省民勤治沙綜合試驗(yàn)站采收的四翅濱藜寄生肉蓯蓉和甘肅省民勤縣采收的梭梭寄生肉蓯蓉為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉苯乙醇苷含量的測(cè)定可以看出(表1)，不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉苯乙醇苷含量存在差異。秋季采收的不同寄主肉蓯蓉中，寄主在四翅濱藜上的肉蓯蓉中松果菊苷、肉蓯蓉苷A和管花苷A含量均高于寄主在梭梭上肉蓯蓉各成分含量，且差異顯著(P<0.05)，分別高出了49.05%、49.31%、59.39%。春季采收的不同寄主肉蓯蓉中，四翅濱藜寄生肉蓯蓉松果菊苷、肉蓯蓉苷A和毛蕊花糖苷含量分別高出了梭梭寄生肉蓯蓉73.50%、49.29%、50.95%，且差異顯著。而以4種苯乙醇苷成分含量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，不論是秋季采收還是春季采收，均以四翅濱藜寄生肉蓯蓉苯乙醇苷成分含量高。

春季采收的梭梭寄生肉蓯蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量都高于秋季采收的肉蓯蓉，分別高出了29.06%、89.44%、90.77%，且差異顯著，而肉蓯蓉苷A含量差異不顯著。春季采收的四翅濱藜寄生肉蓯蓉中松果菊苷、管花苷A和毛蕊花糖苷含量顯著高于秋季采收的肉蓯蓉，分別高出了63.10%、68.67%、95.03%，而肉蓯蓉苷A含量差異不明顯。通過(guò)對(duì)兩種不同寄主植物春秋兩季采收肉蓯蓉中4種苯乙醇苷成分含量進(jìn)行分析，總體來(lái)看，以春季采收的質(zhì)量較好。

表1 不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉苯乙醇苷含量

3.2 不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉可溶性多糖含量

以甘肅省民勤治沙綜合試驗(yàn)站采收的四翅濱藜寄生肉蓯蓉和甘肅省民勤縣采收的梭梭寄生肉蓯蓉為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉可溶性多糖含量的測(cè)定可以看出(表2)，秋季采收的不同寄主肉蓯蓉中，四翅濱藜寄生肉蓯蓉可溶性多糖含量高于梭梭寄生肉蓯蓉，高出了24.73%；春季采收的不同寄主肉蓯蓉中，梭梭寄生肉蓯蓉可溶性多糖含量顯著高于四翅濱藜寄生肉蓯蓉(P<0.05)，高出了84.97%。不同季節(jié)采收的梭梭寄生肉蓯蓉中，春季采收的肉蓯蓉可溶性多糖含量顯著高于秋季采收的肉蓯蓉；不同季節(jié)采收的四翅濱藜寄生肉蓯蓉中，秋季采收的肉蓯蓉可溶性多糖含量顯著高于春季采收的肉蓯蓉(P<0.05)。

表2 不同寄主和不同采收季節(jié)肉蓯蓉可溶性多糖含量

3.3 不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉苯乙醇苷含量

通過(guò)對(duì)甘肅省不同產(chǎn)地4種苯乙醇苷含量的測(cè)定可以看出(表3)，不同產(chǎn)地的肉蓯蓉樣品中4種苯乙醇苷類(lèi)含量存在差異，這可能是由于不同產(chǎn)地藥材種植環(huán)境差異較大，甘肅民勤肉蓯蓉松果菊苷含量為最高，達(dá)19.463 mg·g-1，分別高出了甘肅靖遠(yuǎn)和甘肅景泰74.62%、26.15%，且差異顯著(P<0.5)。甘肅景泰肉蓯蓉肉蓯蓉苷A含量相比其他兩個(gè)產(chǎn)地較高，達(dá)到了5.239 mg·g-1，且顯著高于甘肅靖遠(yuǎn)72.09%。甘肅民勤肉蓯蓉管花苷A含量最高為0.260 mg·g-1，高出了甘肅靖遠(yuǎn)54.74%。甘肅靖遠(yuǎn)肉蓯蓉毛蕊花糖苷含量最高，達(dá)到了1.898 mg·g-1。通過(guò)對(duì)3個(gè)產(chǎn)地肉蓯蓉4 種苯乙醇苷含量分析，整體來(lái)看還是以甘肅民勤的質(zhì)量最優(yōu)。

表3 不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉苯乙醇苷含量

3.4 不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉可溶性多糖含量

通過(guò)對(duì)甘肅省不同產(chǎn)地可溶性多糖含量的測(cè)定可以看出(表4)，甘肅景泰肉蓯蓉中可溶性多糖含量最高為20.467 mg·g-1，與其他兩個(gè)產(chǎn)地的肉蓯蓉存在顯著差距(P<0.05)，3個(gè)產(chǎn)地肉蓯蓉可溶性多糖含量依次為甘肅景泰>甘肅民勤>甘肅靖遠(yuǎn)。

表4 不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉可溶性多糖含量

4 討論與結(jié)論

產(chǎn)地、品種及采收期對(duì)中藥材成分含量的影響一直是學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，如趙志紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉在不同產(chǎn)地種藥材的化學(xué)成分含量會(huì)產(chǎn)生變化；王雪媛等[12]研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉春季、秋季樣品中有效成分波動(dòng)差異較大。本研究結(jié)果顯示，不同寄主肉蓯蓉藥材中5種有效成分含量存在較大差異。四翅濱藜寄生肉蓯蓉藥材中苯乙醇苷和可溶性多糖的含量整體高于梭梭寄生肉蓯蓉，原因可能與不同寄主植物、生長(zhǎng)條件、水分等多種因素有關(guān)[24]。此外，因?yàn)樗某釣I藜本身生物量大，可能給肉蓯蓉提供了大量的養(yǎng)分，而到底是如何傳遞養(yǎng)分，需要后續(xù)的進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明?，F(xiàn)階段四翅濱藜寄生肉蓯蓉研究較少且樣本不夠多，可為開(kāi)發(fā)四翅濱藜寄生肉蓯蓉提供一定的參考價(jià)值，為后續(xù)肉蓯蓉的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。對(duì)于春秋兩季采收的肉蓯蓉，兩種不同寄主肉蓯蓉藥材苯乙醇苷含量均以春季采收的含量最高，梭梭寄生肉蓯蓉藥材可溶性多糖含量以春季最高，四翅濱藜寄生肉蓯蓉可溶性多糖含量以秋季最高。這可能與不同采收期環(huán)境中生態(tài)因素(如土壤溫度、空氣溫度、空氣濕度、光合有效輻射等)會(huì)發(fā)生不同程度的變化等有關(guān)[25-26]，而中國(guó)藥典規(guī)定松果菊苷和毛蕊花糖苷含量作為肉蓯蓉質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，可以得出肉蓯蓉以春季采收較好，為后續(xù)肉蓯蓉采收季節(jié)提供理論依據(jù)。甘肅不同產(chǎn)地梭梭寄生肉蓯蓉苯乙醇苷含量有較大差距，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)肉蓯蓉質(zhì)量有一定的影響，而不同產(chǎn)地肉蓯蓉中可溶性多糖含量無(wú)較大變化，綜合評(píng)價(jià)出甘肅民勤梭梭寄生肉蓯蓉質(zhì)量最優(yōu)。

研究結(jié)果顯示產(chǎn)地和寄主及采收季節(jié)均會(huì)影響肉蓯蓉中苯乙醇含量和可溶性多糖含量。苯乙醇苷類(lèi)成分，具有較強(qiáng)的補(bǔ)腎陽(yáng)和神經(jīng)保護(hù)作用，而肉蓯蓉含有豐富多糖，具有較強(qiáng)的抗衰老和潤(rùn)腸通便之功效[27-29]。由上述可知，肉蓯蓉寄主植物的不同對(duì)肉蓯蓉質(zhì)量有一定影響，且各成分含量存在較大差異性。新興發(fā)現(xiàn)的四翅濱藜寄生肉蓯蓉質(zhì)量較好，且春季采收明顯好于秋季采收，這需要后續(xù)研究學(xué)者對(duì)四翅濱藜寄生肉蓯蓉進(jìn)行大量研究，制定更加客觀統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。新興寄主植物四翅濱藜的成功引入對(duì)于提高肉蓯蓉資源以及開(kāi)發(fā)利用具有深遠(yuǎn)意義。