李永格

肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國發(fā)病率非常高，居所有惡性腫瘤的第2位。肝癌的治療多通過手術切除、肝臟移植以及化療等綜合療法，雖然取得了一定進展但預后還是很差，導致其5年生存率不足5%[1，2]。中草藥在防治肝癌復發(fā)、轉移，延長生存期方面具有明顯優(yōu)勢。香菇多糖(Lentinan，LNT)是從香菇分離出來的最有效的活性物質，有研究表明其對肝癌細胞有明顯的直接抑制作用[3]，但具體機制不清。本課題擬通過不同濃度LNT體外作用于HepG2肝癌細胞系，觀察肝癌細胞增殖變化；western-blot檢測軸突導向蛋白4C(Sema4C)和G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(GIT1)表達，分析其作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株人肝癌細胞系HepG2購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 藥品及試劑LNT購自武漢勝天科技有限公司，(批號：1541023)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma公司；10%胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)；抗體(武漢博士德)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人肝癌細胞系HepG2采用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基作常規(guī)培養(yǎng)，其中培養(yǎng)溫度保持37 ℃、CO2含量5%，取生長良好并處于對數(shù)生長期的細胞用于下述實驗。

1.2.2 MTT法檢測LNT對細胞增殖抑制率的影響LNT采用完全培養(yǎng)基配置成6.25、12.5、25、50、100 μg/ml濃度。根據(jù)不同濃度LNT將肝癌細胞分為以下幾組：①對照組：完全培養(yǎng)基作用5 h；②6.25 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合6.25 μg/ml LNT作用5 h；③12.5 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合12.5 μg/ml LNT作用5 h；④25 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合25 μg/ml LNT作用5 h；⑤50 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合50 μg/ml LNT作用5 h；⑥100 μg/ml LNT組：完全培養(yǎng)基聯(lián)合100 μg/ml LNT作用5 h。將細胞按每孔5×105個接種于96孔板中，各組分別設置5個重復孔，加入不同濃度LNT處理5 h后洗去上清液，然后加入完全培養(yǎng)基，向每孔中加入20 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml，用PBS配)，37 ℃培養(yǎng)4 h后吸去上清，加入200 μl DMSO溶液，振蕩20 min，使細胞充分溶解，在OD 490 nm處通過酶標儀檢測其吸光值并記錄。參照上述方法，每隔24 h檢測1次細胞增殖情況，共計3次。

1.2.3 western-blot檢測GIT1蛋白、Sema4C蛋白在肝癌細胞株中表達根據(jù)MTT結果選取100 μg/ml LNT組肝癌細胞與對照組細胞進行western-blot實驗。參照試劑盒說明書裂解細胞，提取總蛋白并進行蛋白定量。灌制10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣30 μg，250 V轉移至聚偏二氟乙烯膜，于37 °C置5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h。滴加一抗，4 °C孵育過夜，37 °C下與HRP標記的二抗孵育1 h，洗滌后ECL曝光。同樣的方法對β-actin進行檢測并作為內參對照。所得圖像用凝膠成像系統(tǒng)進行分析，以目的基因灰度值/內參β-actin灰度值半定量計算蛋白含量。

2 結果

2.1 不同濃度LNT對HepG2細胞增殖影響不同濃度LNT對HepG2細胞增殖都有明顯抑制作用且表現(xiàn)為量效、時間依賴性，100 μg/ml LNT作用48 h后，細胞生長出現(xiàn)半抑制，故選擇100 μg/ml LNT作用48 h來進行后續(xù)研究。見表2。

表1 不同濃度LNT對HepG2細胞的抑制作用 (例，

2.2 western-blot檢測LNT作用后HepG2細胞Sema4C、GIT1蛋白表達應用western-blot檢測100 μg/ml LNT對HepG2細胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白表達的影響，結果顯示：100 μg/ml LNT組HepG2細胞Sema4C蛋白、GIT1蛋白相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)，提示100 μg/ml LNT下調HepG2細胞Sema4C蛋白與GIT1蛋白表達。見表2、圖1、圖2。

圖1 GIT1蛋白表達電泳圖

圖2 Sema4C蛋白表達電泳圖

表2 Sema4C、GIT1蛋白相對表達量

3 討論

多糖是構成生物體的重要組成部分，具有增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老等作用[4，5]，尤其是抗腫瘤的作用成為現(xiàn)在研究的熱點。目前關于多糖抗腫瘤的作用機制還不清楚，多數(shù)研究集中在免疫調節(jié)方面。本實驗室前期體外實驗研究發(fā)現(xiàn)LNT能夠抑制肝癌細胞的生物學行為[6，7]，說明LNT抗腫瘤作用可能通過其他途徑產(chǎn)生。本實驗通過MTT法檢測肝癌細胞增殖，發(fā)現(xiàn)不同濃度LNT對Huh7.5.1細胞增殖有明顯抑制作用且表現(xiàn)為量效、時間依賴性，與前期研究結果相符。

Sema4C為SemaⅣ亞族一員，有報道表明常見惡性腫瘤乳腺癌、子宮內膜癌和前列腺癌組織和細胞水平上均見Sema4C較強表達，且腫瘤細胞轉移潛能不同，Sema4C蛋白表達的強弱是有差別的[8]。因此，推測Sema4C在人類惡性腫瘤的表達可能具有普遍意義，并且與惡性腫瘤的侵襲和轉移密切相關。G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein1，GIT1)為GIT家族分子，被N-α-乙酰轉移酶10(N-α-acetyltransferase10，NAA10)干擾作用后，抑制腫瘤的轉移[9]，提示GIT1蛋白可能是腫瘤轉移的促進因子。通過western-blot研究發(fā)現(xiàn)LNT組肝癌細胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)，說明LNT下調肝癌細胞Sema4C蛋白和GIT1蛋白表達。

綜上所述，LNT抑制肝癌細胞增殖，其機制可能通過下調SEMA4C蛋白和GIT1蛋白表達來發(fā)揮作用，為LNT治療肝癌作用機制提供新思路。