王 霞 劉 琴 周澤華 劉國平 孟光榮 孟小鵬

顱腦損傷(Craniocerebral Injury，CI)是神經(jīng)外科常見的一種創(chuàng)傷性疾病，重癥CI患者易發(fā)生遲發(fā)性顱內(nèi)血腫(Delayed Traumatic Intracranial Hematoma，DTIH)，對重癥CI患者的生命安全及生存質(zhì)量構成極度威脅[1]。目前CI并發(fā)DTIH發(fā)生機制尚無定論，因此，尋找CI并發(fā)DTIH的相關因素，對CI并發(fā)DTIH具有一定臨床指導意義。有研究發(fā)現(xiàn)CI發(fā)生后，患者外周血中微小RNA(MicroRNA，miRNA)存在異常表達，且CI患者腦組織常伴有缺血缺氧或腦血管自身調(diào)節(jié)功能障礙，易引發(fā)DTIH[2,3]。微小RNA-126(MicroRNA-126，miR-126)在脊髓損傷后表達下調(diào)，可影響血管生成和炎癥反應過程，進而在脊髓損傷中發(fā)揮重要作用[4]。血管細胞黏附分子-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1,VCAM-1)與腦損傷繼發(fā)性腦損害的炎癥反應有關，其在重度CI患者呈高表達，經(jīng)重組人促紅細胞生成素治療后，VCAM-1表達水平降低，VCAM-1有望成為重度CI患者康復指標[5]。但miR-126和VCAM-1在重癥CI并發(fā)DTIH患者血清中的表達情況鮮有報道?；诖?，本研究初步探究miR-126、VCAM-1在CI患者、CI并發(fā)DTIH患者血清中的表達水平，分析兩者與CI患者并發(fā)DTIH的關系，以期為臨床早期防治CI并發(fā)DTIH提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組

選擇2015-03-2019-02本院收診的重癥CI患者289例，所有患者診斷均符合《現(xiàn)代顱腦損傷學》重癥CI的相關標準[7]。參考文獻[8]進行DTIH判定。依據(jù)是否發(fā)生DTIH，將患者分為DTIH組(102例)和非DTIH組(187例)；DTIH組中男62例，女40例；年齡31-62歲，平均年齡(46.64±10.81)歲。非DTIH組中男95例，女92例；年齡30-61歲，平均年齡(45.96±10.72)歲。選取本院同時間段內(nèi)135例體檢健康者為對照組，其中男69例，女66例；年齡30-63歲，平均年齡(46.25±10.77)歲。三組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例納入和排除標準

納入標準：(1)經(jīng)頭顱螺旋CT確診為重癥CI者或重癥CI并發(fā)DTIH；(2)所有患者入院進行格拉斯哥昏迷評分(Glasgow Coma Scale，GCS)，GCS范圍為3-8分；(3)患者受傷至入院時間<24h；(4)所有受試者家屬自愿參與該項研究，且中途未退出。排除標準：(1)合并嚴重四肢、胸、腹損傷者；(2)合并近期手術、急/慢性感染、凝血功能障礙或免疫系統(tǒng)疾病者；(3)合并臟器功能衰竭、惡性腫瘤者；(4)近期接受心肺復蘇、抗凝治療者。

所有受試者家屬簽署知情同意書，且本研究獲得本院倫理委員會批準，研究所用方法符合《赫爾辛基宣言》。

1.3 主要試劑與方法

TRIzol試劑(貨號：GMS12279)購買于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(貨號：04655877001)購買于上海易匯生物科技有限公司，TaqMan Human MicroRNA Assay(貨號：4398965)購買于上海恪敏生物科技有限公司，Taqman Universal master mix(貨號：4347166)購買于上海賓智生物科技有限公司。引物購買于上海基康生物技術有限公司，各引物序列見表1。紫外分光光度計(型號：DU-800)購買于上海智巖科學儀器有限公司，實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)儀(型號：SimpliAmp)購買于賽默飛世爾科技。

表1 引物序列

1.4 觀察指標和方法

1.4.1一般臨床資料收集：收集患者性別、年齡，入院時收縮壓、舒張壓、血漿凝血酶原時間、GCS評分等臨床基本資料。

1.4.2qRT-PCR法檢測血清中miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平：收集所有研究對象入院空腹外周血6-7ml，室溫自然凝集30min，4℃、3 500g/min離心12min，收集上層血清，分裝于無RNA酶凍存管中，保存于-80℃冰箱中，待樣本集齊后集中檢測。檢測前取出凍存于-80℃冰箱中的血清樣本，冰上解凍，無菌環(huán)境下，根據(jù)TRIzol試劑說明書抽提所有血清樣本總RNA，測定RNA純度及濃度，并驗證RNA完整性。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，應用Transcriptor One-Step RT-PCR Kit合成cDNA。按照TaqMan Human MicroRNA Assay、Taqman Universal master mix說明書流程將所得cDNA進行擴增、PCR檢測血清miR-126、VCAM-1、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)相對表達水平。miR-126以U6為內(nèi)參，VCAM-1、VEGF、TNF-α以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組基本臨床指標比較

對照組、非DTIH組和DTIH組三組間收縮壓、舒張壓差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，血漿凝血酶原時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與非DTIH組相比，DTIH組患者血漿凝血酶原時間明顯延長(P<0.01)，GCS評分明顯升高(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組基本資料比較

2.2 各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平比較

各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。與對照組相比，非DTIH組、DTIH組血清miR-126表達水平明顯降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平均明顯升高(t均>4.793，P均<0.01)；與非DTIH組相比，DTIH組血清miR-126表達水平明顯降低，VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平均明顯升高(t均>11.528，P均<0.01)。詳見表3。

表3 各組血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α表達水平比較

2.3 重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α水平的相關性

Pearson法分析顯示，重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126表達水平與VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈負相關(r=-0.489、-0.375、-0.575，P均<0.01)，VCAM-1與VEGF、TNF-α均呈正相關(r=0.360、0.418，P均<0.01)。

2.4 Logistic回歸分析重癥CI并發(fā)DTIH的影響因素

以重癥CI并發(fā)DTIH為因變量，以血漿凝血酶原時間、GCS評分、miR-126、VCAM-1、VEGF、TNF-α為自變量，進行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示血漿凝血酶原時間、VCAM-1、VEGF、TNF-α為重癥CI并發(fā)DTIH的獨立危險因素(P<0.01)，miR-126為重癥CI并發(fā)DTIH的獨立保護因素(P<0.01)。詳見表4。

表4 重癥CI并發(fā)DTIH的Logistic回歸分析

3 討 論

CI可引發(fā)腦組織水腫、腦梗死、DTIH等繼發(fā)性CI，具有較高致殘率和致死率，嚴重威脅患者生活質(zhì)量及生命[8]。因此，尋找有效評估CI并發(fā)DTIH指標，對CI患者進行實時監(jiān)控，及時防治DTIH，可有效提高CI患者生存率。

miRNA可在機體代謝、個體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、炎癥反應、血管生成等生理病理過程中起重要生物調(diào)節(jié)作用[9]。miRNA在腦梗死、腦水腫、CI、DTIH等疾病中表達異常，可作為缺血缺氧腦損傷相關疾病的診治靶標[10]。miR-191在急性缺血腦卒中表達異常，其可通過靶向血管內(nèi)皮鋅指蛋白1抑制血管生成，進而在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，miR-191可作為診治急性缺血腦卒中的生物靶標[11]。Di等[12]研究顯示，miR-425-5p在CI患者中異常表達，其可用于CI病情判斷及預后評估。以上研究證實，miRNA表達失調(diào)與腦損傷類疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。miR-126與血管生成、血管炎癥有關，在腦出血患者血清中呈低水平，且其成員miR-126-3p可緩解腦出血后引起的血腦屏障破壞、神經(jīng)元損傷及腦水腫，miR-126及miR-126-3p在腦損傷疾病發(fā)展過程中起重要作用[13]。miR-126可促進血管重塑，減少纖維化，缺血性腦卒中患者miR-126表達下調(diào)，其miR-126與腦卒中發(fā)病關系密切[14]。本研究中DTIH組患者血清miR-126表達水平明顯低于非DTIH組和對照組，提示低miR-126水平可能參與并影響重癥CI并發(fā)DTIH的進程。推測miR-126表達下降可能會加重患者血管纖維化和炎癥反應，從而增加重癥CI并發(fā)DTIH的發(fā)病率，影響預后。VCAM-1是血清黏附分子，可介導血管內(nèi)皮細胞黏附，影響血管壁完整性及組織缺氧引發(fā)的炎癥反應，VCAM-1在老年急性腦梗死患者中表達失調(diào)，與急性腦梗死發(fā)病有關[15]。局灶性腦缺血損傷患者VCAM-1表達水平升高，經(jīng)西洋參莖葉總皂苷治療后，其表達水平降低，炎癥和腦水腫減輕，提示VCAM-1可能在局灶性腦缺血損傷發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[16]。以上研究表明，VCAM-1可能與缺血性腦病炎癥反應過程有關。本研究中DTIH組患者血清VCAM-1水平均明顯高于非DTIH組和對照組，提示高表達VCAM-1在重癥CI并發(fā)DTIH疾病發(fā)生發(fā)展中起一定作用，推測高表達VCAM-1可能會加劇患者炎癥反應，進而影響重癥CI并發(fā)DTIH的發(fā)展。

VEGF是具有促進內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性、誘導血管生成等生物學功能的多功能細胞因子，對顱內(nèi)血管內(nèi)膜損傷異常敏感，VEGF在發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷后異常表達，與腦損傷發(fā)展過程密切相關[17]。TNF-α是機體免疫應答及炎癥反應的重要調(diào)節(jié)因子，其在急性CI中表達升高，CI發(fā)生后TNF-α可能激活水通道蛋白4，引起嚴重腦水腫，使腦組織嚴重缺血缺氧，TNF-α有助于評估CI嚴重程度[18]。本研究顯示，DTIH組患者血清VEGF、TNF-α表達水平明顯高于非DTIH組和對照組，提示VEGF、TNF-α可能與重癥CI并發(fā)DTIH發(fā)展過程相關。其原因可能是VEGF具有改變血管通透性、影響內(nèi)皮細胞增長及血管新生的作用，而TNF-α可調(diào)節(jié)免疫應答及炎癥反應，二者共同影響DTIH的發(fā)生和發(fā)展。

本研究中重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126表達水平與VEGF、TNF-α、VCAM-1均呈負相關，VCAM-1與VEGF、TNF-α均呈正相關，提示miR-126、VEGF、TNF-α與VCAM-1相互作用，從而共同影響重癥CI并發(fā)DTIH進展。進一步研究發(fā)現(xiàn)血漿凝血酶原時間、VCAM-1、VEGF、TNF-α是重癥CI并發(fā)DTIH的獨立危險因素，miR-126是重癥CI并發(fā)DTIH的獨立保護因素，提示血漿凝血酶原時間延長，VCAM-1、VEGF、TNF-α水平升高，miR-126水平降低，均可能增加重癥CI并發(fā)DTIH的幾率，實時監(jiān)測重癥CI患者血漿凝血酶原時間、miR-126、VEGF、TNF-α及VCAM-1水平，有助于早期評估重癥CI并發(fā)DTIH的幾率并及時控制疾病發(fā)展。

綜上所述，重癥CI并發(fā)DTIH患者血清miR-126低表達，VCAM-1高表達，miR-126、VCAM-1均可能是影響重癥CI并發(fā)DTIH的影響因素，兩者參與并影響重癥CI并發(fā)DTIH進程。但本研究樣本量較少，實驗結(jié)果可能會出現(xiàn)偏倚，后續(xù)將擴大樣本量進一步研究。

?