于 哲 吳莉芳 李 良 朱 瑞

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學技術(shù)學院, 長春 130118; 2. 吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院,動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室, 長春 130118)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展, 各種重金屬及其類似物廢水直接或間接地排入江河湖海之中, 對水環(huán)境造成了不可恢復的污染[1—3]。銅是水體中主要的重金屬污染物之一, 也是維持生命正常發(fā)育和新陳代謝所必需的重要微量元素。以魚類為主的水生生物對銅有一定的富集和積累能力, 然而過量的積累將擾亂水生動物的正常生命活動, 造成其急、慢性中毒甚至死亡[4,5]。生物絮團技術(shù)(BFT)是近年來發(fā)展起來的一種環(huán)境友好型養(yǎng)殖模式, 它的基本原理主要是循環(huán)利用剩余的營養(yǎng)物質(zhì), 以產(chǎn)生微生物生物量, 這些微生物生物量既可以用來就地喂養(yǎng)養(yǎng)殖的魚類, 也可以作為動物飼料的一種成分進行收獲和加工[6—8]。同時, BFT不僅可以作為微生物的載體, 還能通過調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池中微生物的組成, 利用微生物之間的相互作用, 轉(zhuǎn)化對系統(tǒng)中生物有很高毒性的氨氮和亞硝酸鹽, 來實現(xiàn)控制水質(zhì)的目的[9,10]。目前, 關(guān)于重金屬銅對水體污染的研究較少, 主要體現(xiàn)在介紹銅對水生生物的危害上, 如: 組織積累、氧化應激、炎癥反應及免疫抑制等[11—13]; 關(guān)于生物絮團的研究, 主要集中在: BFT對水生生物(魚、蝦等)營養(yǎng)與免疫的研究[7,9]、對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的研究[8]、對腸道菌群的研究[14]及關(guān)于生物絮團C/N的研究[15—17]。而關(guān)于不同C/N生物絮團對急性銅暴露洛氏鱥的免疫、抗氧化酶活性及炎癥反應的影響則鮮有研究。

本實驗甄選病害少, 抗逆性強, 味道鮮美, 無肌間刺, 營養(yǎng)價值高, 深受廣大養(yǎng)殖人員與消費者喜愛的我國土著雜食性小型名貴淡水經(jīng)濟魚類——洛氏鱥(Rhynchocypris lagowskiiDybowski)[2,18,19],探討不同C/N行成的生物絮團對急性銅暴露洛氏鱥免疫抑制、炎癥反應與氧化應激的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

洛氏鱥購于九臺區(qū)泉源魚苗養(yǎng)殖場, 飼養(yǎng)于吉林農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)研究室玻璃水族箱中, 暫養(yǎng)2周使其適應環(huán)境, 期間投喂商品日糧(通威飼料有限公司, 粗蛋白36%、粗脂肪8.0%、粗纖維4.0%和粗灰分6.4%)使其適應基礎(chǔ)料。根據(jù)我們課題組之前發(fā)表[2,18—20]培養(yǎng)生物絮團與調(diào)節(jié)C/N的方法, 選擇無水葡萄糖粉(99.97%)為外加碳源, 按照C/N不同設(shè)置4個實驗組: 對照組(C/N 10.8∶1)、Ⅱ組(C/N 15∶1)、Ⅲ組(C/N 20∶1)和Ⅳ組(C/N 25∶1)。

1.2 飼養(yǎng)管理

在實驗開始前, 停食24h, 選取480尾規(guī)格一致,體質(zhì)健壯的洛氏鱥幼魚(10±0.15) g, 隨機分入12個玻璃缸中(100 L水), 每缸40尾, 期間水溫控制(18±2)℃, 按2%—3%投餌率日投喂2次(9:00和18:00), 每日19:00向魚缸中添加葡萄糖粉。24h不間斷曝氣充氧, 每周測量溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽和總磷等, 確保各項水質(zhì)指標均符合洛氏鱥的生長條件。在8周飼養(yǎng)實驗結(jié)束后, 進行96 h的急性攻毒脅迫實驗, 根據(jù)前期研究, 銅暴露洛氏鱥的半致死濃度為1.03 mg/L[2], 向各實驗組添加調(diào)配好濃度的無水硫酸銅(CuSO4)。攻毒期間的實驗條件與飼養(yǎng)實驗條件一致, 但是并未投喂。

1.3 樣品收集及測定方法

水質(zhì)指標與水體中銅濃度實驗期間使用多參數(shù)水質(zhì)測試儀YSI556測定水質(zhì)指標; 絮團體積采用 Imhoff 錐形管法測定; 總體懸浮物使用TOYO定量濾紙抽濾發(fā)測定; 在銅暴露實驗結(jié)束前后, 分別從每個魚缸中取5 mL養(yǎng)殖水體與10 mL濃硝酸(65%HNO3)混合, 經(jīng)消化作用72h后, 4℃離心10min(12000×g), 最后, 取上清液用AA-6300原子吸收光譜儀測定銅的濃度。

生長性能在飼養(yǎng)實驗結(jié)束后, 停食24h, 每桶隨機選取洛氏鱥10尾, 測其體長和體質(zhì)量, 用于各項指標的測。特定生長率、增重率、存活率和飼料轉(zhuǎn)化率的測試方法參考Long等[8]和Yu等[18—20]。

免疫、抗氧化與炎癥反應指標在脅迫實驗結(jié)束后, 從每缸隨機取洛氏鱥10尾, 經(jīng)MS-222(200 mg/L)麻醉后用2.0 mL肝素鈉注射器尾靜脈采血, 血樣 4℃離心10min(5000 r/min)收集血清,–20℃保存待測。

AKP、ACP(對硝基苯磷酸鹽法)、LSZ(比濁法)、NOS(硝酸還原酶法)、C3、C4、IgM(免疫比濁法); CAT(可見光測定法)、ASA(比色法)、SOD(黃嘌呤氧化酶法)、T-AOC(ABTS速測法)、GSHPX(二硫代二硝基苯甲酸法)、GR(紫外分光光度法)和MDA(TBA法); TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6采用雙抗體夾心ELISA 法, 具體參照Yu等[2,19,20]。以上試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。

1.4 統(tǒng)計分析

結(jié)果以平均數(shù)±標準差表示。采用SPSS(20.0)軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA), 以確定顯著性差異, 再用Tukey’s多極差檢驗比較均值(P＜0.05), 確定差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同C/N生物絮團對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

如表 1所示, 各組水溫、脅迫后CuSO4濃度無顯著差異(P＞0.05); Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組pH、溶解氧、氨氮和亞硝酸鹽顯著低于對照組(P＜0.05), 且各組之間差異不顯著(P＞0.05); Ⅲ和Ⅳ組總磷與透明度顯著低于對照組(P＜0.05), 其互相之間差異不顯著(P＞0.05)。相反的是: Ⅲ和Ⅳ組絮團體積與總體懸浮物顯著高于對照組(P＜0.05), 而Ⅲ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長性能的影響

如表 2所示, Ⅲ和Ⅳ組末體質(zhì)量、特定生長率和增重率顯著高于對照組, 而飼料轉(zhuǎn)化率顯著高低于對照組(P＜0.05), 且Ⅲ和Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05); Ⅱ和Ⅲ組的存活率顯著高于對照組與Ⅳ組(P＜0.05)。

2.3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫酶活力的影響

由圖 1可知, 生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫抑制具有一定的緩解作用, 其中: Ⅲ組各項免疫酶活力均顯著高于對照組(P＜0.05), Ⅳ組的ACP和補體C3, Ⅱ組的ACP、補體C4與IgM含量也顯著高于對照組(P＜0.05)。LSZ與AKP活力在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組之間差異不顯著(P＞0.05); NOS活力在Ⅱ和Ⅳ組和對照組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.4 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥炎癥因子的影響

由圖 2可見, 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥的炎癥反應具有不同的緩解效果, 其中Ⅲ組和Ⅳ組TNF-α與IL-1β含量顯著低于對照組, 且這兩組之間差異不顯著(P＞0.05); IL-6含量在各實驗組(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)中均顯著低于對照組(P＜0.05), 且Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05); 關(guān)于IL-2的含量, Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中Ⅲ組含量最高, Ⅱ和Ⅳ組之間無顯著差異(P＞0.05)。

表 1 不同C/N生物絮團對養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響Tab. 1 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on aquaculture water quality

表 2 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長性能的影響Tab. 2 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on growth performance of R. lagowskii

2.5 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥抗氧化酶的影響

由圖 3可見, 生物絮團對銅暴露洛氏鱥氧化應激具有一定的緩解作用, 其中: Ⅲ和Ⅳ組SOD、GR和GSH-PX活性均顯著高于對照組(P＜0.05), 然而它們之間無顯著差異(P＞0.05)。與對照組相比,Ⅱ組的T-AOC和ASA含量差異不顯著(P＞0.05), 但是Ⅲ和Ⅳ組顯著升高, 且Ⅲ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組(P＜0.05); 各實驗組(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組)中的CAT活性均顯著高于對照組(P＜0.05), 其中Ⅲ組呈最大值, Ⅱ組與Ⅳ組無顯著差異(P＞0.05); MDA含量隨著碳氮比的升高, 呈下降趨勢, 當C/N 15(Ⅲ組)時達到最低值, 之后略有回升。與對照組相比,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組均顯著下降(P＜0.05), 但是Ⅱ和Ⅳ組差異不顯著, Ⅲ和Ⅳ組也無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

3.1 不同C/N生物絮團對洛氏鱥生長及養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響

大量研究表明, 生物絮團可促進養(yǎng)殖動物的生長, 凈化養(yǎng)殖水體, 當C/N適當時, 魚類表現(xiàn)出最佳的生長趨勢[6,8,16,17]。本實驗結(jié)果顯示, 隨著C/N的升高, 洛氏鱥的增重率和特定生長率呈上升趨勢,說明在本實驗條件下, 高碳氮比形成的生物絮團有效地促進了洛氏鱥的生長; Ⅲ組飼料轉(zhuǎn)化率顯著低于對照組, 表明C/N20:1時形成的絮凝物可作為洛氏鱥的天然餌料, 并且可以連續(xù)在原位獲得額外的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素, 以加快生長進度,與Wang等[17]所得結(jié)果基本吻合。Ⅳ組雖然在末體重、增重率與特定生長率上都出現(xiàn)最高值, 但在存活率上卻與對照組不相上下, 究其原因可能是C/N過高, 導致異養(yǎng)菌大量增殖, 總體懸浮物含量過飽和, 堵塞魚鰓, 不利于魚類呼吸。

Avnimelech[21]研究表明, 當水體C/N為15.75以上時, BFT能顯著凈化水質(zhì)污染問題。從本文結(jié)果來看: 隨著C/N的升高, 溶解氧、pH、氨氮、亞硝酸鹽、總磷、透明度及脅迫后CuSO4濃度均呈下降趨勢。溶解氧下降是由于微生物繁殖生長消耗大量氧氣[16]; pH下降可能是洛氏鱥和微生物生長,呼吸放出的CO2增多, 導致廢物累積和酸敗[22];Hari等[23]指出額外添加碳源可有效降低水體里的氨氮、亞硝酸鹽與總磷的濃度, 原因可能是生物絮團對含氮污染物的快速異養(yǎng)轉(zhuǎn)化[16], 與本文結(jié)果相似; 透明度持續(xù)下降是因為飼料的不斷投入與異樣菌大量繁殖[19]; 攻毒后CuSO4濃度下降, 可能是絮團對水體中銅的吸附、沉降等作用引起的[2]。

圖 1 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清免疫酶的影響Fig. 1 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum immune enzymes of R. lagowskii in waterborne copper exposure

圖 2 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清炎癥因子的影響Fig. 2 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum inflammation factors of R. lagowskii in waterborne copper exposure

3.2 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥免疫抑制的緩解作用

免疫指標是監(jiān)測環(huán)境危害對魚類健康潛在影響的重要參數(shù), 作為抵御病原微生物的第一道防線,非特異性免疫與先天免疫系統(tǒng)在保護魚類健康方面起著至關(guān)重要的作用[2,24—26]。LSZ作為非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分, 能水解病原菌中的黏多糖, 分解細菌細胞壁上肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-(1, 4)糖苷鍵, 在清除侵襲性病原體和細菌方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[27],AKP和ACP是參與動物免疫的一種重要水解酶, 在免疫應答過程中能增強血細胞識別異物, 改變病原體表面結(jié)構(gòu)[19,20]。NOS能幫助巨噬細胞對抗免疫系統(tǒng)中的病原體[2]。在本實驗中, 第Ⅲ組中的LSZ、AKP、ACP和NOS活力顯著高于對照組, 表明當養(yǎng)殖水體中C/N為20∶1時, 能顯著緩解銅暴露洛氏鱥的免疫抑制, 增強其對環(huán)境脅迫的抗性。而當C/N為15∶1與25∶1時, LSZ、AKP和NOS活力與對照組無顯著差異, 這可能是由于低C/N絮團或過高C/N絮團對銅暴露洛氏鱥的免疫酶影響不大。Liu等[28]研究生物絮團增強羅非魚擁擠脅迫耐受能力, 結(jié)果顯示C/N20∶1組顯著提高了LSZ和AKP活力, 與本實驗結(jié)果大致吻合。補體C3和C4是參與體液免疫的大分子, 可以通過溶解免疫球蛋白復合物殺死病毒和細菌, 促進炎癥反應[29]。IgM是衡量魚類體液免疫功能的重要指標[30]。在本實驗中, 在不同C/N生物絮團對洛氏鱥補體C3、C4和IgM的影響略有不同, 但總體趨勢皆為先升高后趨于平緩。與對照組相比, 第Ⅲ組中的補體C3、C4和IgM水平顯著升高。以上結(jié)果可能是由于, 魚類攝食或生存于不同C/N形成的生物絮團環(huán)境中, 而一定范圍之內(nèi), 高C/N生物絮團內(nèi)含有多種微生物、益生菌和生物活性物質(zhì), 可以提高魚類免疫酶活性, 并通過次生代謝產(chǎn)物使宿主受益[31,32]。同時, 它們的細胞成分或代謝物(類胡蘿卜素等)可以作為免疫刺激劑, 改善先天免疫系統(tǒng)并提供對宿主的保護[2,9]。此外, 高C/N生物絮團還能通過促進魚類生長, 誘導其消化道微生物區(qū)系的變化, 獲得提高免疫力和抵御環(huán)境應激的能力[20]。

圖 3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥血清抗氧化酶的影響Fig. 3 Effects of different C/N ratios formed bioflocs on serum antioxidant enzymes of R. lagowskii in waterborne copper exposure

3.3 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥炎癥反應的緩解作用

魚類的免疫功能與炎癥密切相關(guān), 炎癥是由細胞因子介導和啟動的, 已有實驗表明重金屬銅可誘導頭腎免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和細胞應激反應的改變[33]。細胞因子是一組多肽類細胞調(diào)節(jié)物質(zhì), 包括白細胞介素、腫瘤壞死因子和細胞刺激因子等, 主要由外周免疫細胞合成。眾所周知, IL-1β和TNF-α是2種強大的促炎因子, 可通過調(diào)節(jié)其他細胞因子的表達來誘導炎癥反應[34]。IL-2可促進T淋巴細胞增殖和分化, 誘導和增強致死性T細胞、單核細胞和巨噬細胞的活性; IL-6和IL-1共同促進T細胞增殖并參與炎癥和發(fā)熱[35]。在本研究中, 當C/N≥20∶1時, BFT顯著降低了銅暴露洛氏鱥血清的IL-1β、IL-6和TNF-α水平, 升高了IL-2水平。這表明高C/N生物絮團能有效緩解洛氏鱥銅暴露所引起的炎癥反應, 與Yu等[18]利用BFT緩解氨脅迫引起的洛氏鱥炎癥反應結(jié)果相似。究其結(jié)果可能是由于高碳氮比BFT系統(tǒng)中能形成大量有益菌群, 有益菌群通過產(chǎn)生有機酸、細菌素或爭奪營養(yǎng)物質(zhì)抑制有害菌的繁殖, 還可抑制有害菌產(chǎn)生內(nèi)毒素和致癌物質(zhì), 降低炎癥因子水平, 從而實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[2,9]。同時, BFT中的益生菌(芽孢桿菌、乳酸菌和丁酸梭菌等)能進入魚類腸道, 通過代謝物或表面抗原刺激魚類免疫體系, 與有害菌競爭營養(yǎng)和附著位點, 保護魚類免受病原菌侵染, 進而增強魚類非特異性免疫力[36,37]。此外, BFT系統(tǒng)中水生微生物的微生態(tài)平衡可以有效控制氨氮和亞硝酸鹽, 降低條件性病原微生物致病的幾率[38]。

3.4 不同C/N生物絮團對銅暴露洛氏鱥抗氧化應激的緩解作用

生物體具有復雜而又精密的抗氧化防御系統(tǒng),在一定范圍內(nèi), 可以及時有效地清除重金屬積累產(chǎn)生的活性氧(ROS), 減少脂質(zhì)變化引起的細胞損傷,保護細胞免受氧化應激的傷害[1—3,26]。眾所周知,內(nèi)源性抗氧化酶, 包括SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX、GR和ASA是抵御氧化應激的第一道防線[2,19,20,39]。Xu等[40]研究表明, 絮團組在血漿與肝胰臟中出現(xiàn)相對較高的SOD與T-AOC活性, 而GSH-PX活性與對照組差異不顯著。Chen等[15]研究結(jié)果顯示: 高C/N下生物絮團能顯著提高仿刺參體液SOD、CAT和GSH-PX活力。Yu等[20]研究表明,當C/N=20∶1時, 生物絮團能有效提高黃金鯽肝胰臟、腸道與腎臟中SOD、CAT、GSH-PX與T-AOC活性, 降低MDA水平。且在我們實驗組的前期發(fā)現(xiàn)中, C/N 20∶1形成的生物絮團對洛氏鱥各個組織(鰓、腦、腎、脾、肝和腸)的抗氧化酶活性均有不同程度的提高[19]。在本實驗中, 與對照組相比, 除MDA外, 銅暴露洛氏鱥血清抗氧化酶(Ⅲ和Ⅳ組)均顯著提高, 相反的是, MDA含量顯著降低。這表明在C/N≥20∶1情況下, BFT可以有效提高抗氧化酶活性, 降低脂質(zhì)變化引起的超氧化物損傷, 緩解洛氏鱥經(jīng)銅暴露而引起的一系列氧化應激反應。這個發(fā)現(xiàn)可能是由于高C/N形成的生物絮團降低了洛氏鱥的脂質(zhì)過氧化水平, 誘導洛氏鱥具有更強的抗氧自由基能力, 提高了其對抗環(huán)境脅迫的能力及成活率[2,16,25]。此外, BFT中含有大量的天然微生物和生物活性生長因子, 包括胡蘿卜素、葉綠素、植物甾醇、多酚、多糖、?；撬岷途S生素, 也能增強魚類的應激反應和抗氧化功能[19,20,22]。

4 結(jié)論

綜上, 在不同C/N水平下形成的生物絮團對銅暴露洛氏鱥的免疫抑制、炎癥反應與氧化應激有不同的影響。當C/N=20∶1時, 生物絮團能顯著提高銅暴露洛氏鱥免疫酶(AKP、ACP、LSZ、NOS、C3、C4和IgM)活力和抗氧化酶(CAT、ASA、T-AOC、SOD、GSH-PX和GR)活力, 降低MDA含量, 穩(wěn)定炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-2和IL-6), 從而有利于洛氏鱥緩解銅暴露引起的應激反應。