吳蓮鳳，吳程力，王霄霞（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江溫州35000；.溫州醫(yī)科大學(xué)仁濟(jì)學(xué)院，浙江溫州35000）

瘧疾是嚴(yán)重危害人類健康的寄生蟲病之一，與艾滋病、結(jié)核病一起被WHO列為全球三大公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)WHO報(bào)道，2019年全球仍有87個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行瘧疾，有2.29億新發(fā)病例，約40.9萬(wàn)人死于瘧疾［1］。隨著國(guó)際交流及出國(guó)旅行等不斷增多，導(dǎo)致境外感染輸入瘧疾較常見。瘧疾不僅嚴(yán)重危害我國(guó)人民的身體健康和生命安全，也對(duì)鞏固我國(guó)消除瘧疾成果構(gòu)成嚴(yán)重威脅。血涂片鏡檢法既是WHO推薦的瘧原蟲檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)，也是我國(guó)基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾控部門最直接、最常用的檢測(cè)方法［2］。特別是在厚血膜上鏡檢瘧原蟲，因其瘧原蟲數(shù)量多、分布密集、檢出率高成為血涂片鏡檢瘧原蟲的重要環(huán)節(jié)。但是目前使用的厚血膜法操作較繁瑣，且經(jīng)常出現(xiàn)血膜脫落、溶血不徹底、影響蟲體形態(tài)等問(wèn)題，在很大程度上影響了臨床瘧原蟲的檢出。因此，我們對(duì)厚血膜染色法做了一定程度的改良，其操作簡(jiǎn)單、效果佳，現(xiàn)與同行分享。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新鮮EDTA-K2抗凝外周血，瘧原蟲陽(yáng)性的新鮮EDTA-K2抗凝外周血，潔凈玻片，瑞吉染液（珠海貝索公司），瑞氏染液（自配），吉姆薩染液（自配），蒸餾水、緩沖液（6.64 g/L磷酸二氫鉀、6.45 g/L磷酸氫二鈉，pH 6.6～6.8）及Nikon ECLIPSE 50i型光學(xué)顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 選擇最適稀釋比例染液 將瑞吉染液和緩沖液按1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20比例配制成待用染液。用加樣槍取瘧原蟲陽(yáng)性新鮮EDTA-K2抗凝血5μL，滴加在干凈玻片上并制成直徑約為1 cm左右、厚薄均勻的圓形厚血膜，每組按照不同稀釋比例分別制作3張，血膜充分干透后，分別加入上述比例待用染液，染色30 min后用蒸餾水輕輕將染液沖走，晾干玻片待檢。在油鏡下，通過(guò)觀察紅細(xì)胞的溶血程度、背景是否干凈、蟲體及細(xì)胞染色情況進(jìn)行綜合評(píng)估，選擇最佳染色效果的稀釋比例染液。

1.2.2 用3種染色方法染色 取瘧原蟲陽(yáng)性的新鮮EDTA-K2抗凝外周血，制作厚血膜方法同1.2.1，制成150張厚血膜片，每50張分為一組，分別按改良染色法（瑞吉染液與緩沖液按1∶15混合，染色30 min）、傳統(tǒng)厚血膜染色法［3］（先用蒸餾水對(duì)厚血膜進(jìn)行溶血處理，后用緩沖液將吉姆薩染液染色30 min）及文獻(xiàn)報(bào)道染色法［4］（瑞氏染液與蒸餾水按1∶5混合，染色10 min）進(jìn)行染色，晾干玻片待檢。通過(guò)肉眼分別觀察3種染色方法染色后厚血膜脫膜的數(shù)量及程度，在油鏡下觀察蟲體染色后結(jié)構(gòu)清晰度及背景干凈程度。

1.3 可重復(fù)性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 隨機(jī)選取5名實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和5名實(shí)習(xí)生接受此染色方法培訓(xùn)后，每人均用已知瘧原蟲陽(yáng)性和陰性EDTA-K2抗凝血標(biāo)本制備厚血膜各2張，并采用改良后染色法進(jìn)行染色，制得40張厚血膜片，將此40張片改變順序交由另兩位形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員油鏡下檢查并評(píng)價(jià)，以評(píng)估此染色方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行。計(jì)量資料結(jié)果以百分率表示，兩組樣本比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同比例瑞吉染液、緩沖液混合染液的染色效果比較 見圖1。瑞吉染液與緩沖液按照1∶15比例混合制成待染液進(jìn)行染色，紅細(xì)胞溶血效果好、背景清晰，瘧原蟲蟲體結(jié)構(gòu)染色清楚、染色效果最佳，見圖1D、E。

圖1 瑞吉染液與緩沖液按不同比例稀釋后染色效果（×1 000）

2.2 改良染色方法與傳統(tǒng)染色方法、文獻(xiàn)報(bào)道染色方法的比較

2.2.1 3種染色方法的脫膜實(shí)驗(yàn)比較 肉眼觀察3種染色方法所染色厚血膜的脫膜情況，見圖2，改良染色方法血膜固定效果更好，更不易脫膜，優(yōu)于其他2種方法。改良染色方法的脫膜率低于傳統(tǒng)染色方法（P＜0.05），而改良染色方法與文獻(xiàn)報(bào)道染色方法相比，脫膜率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與傳統(tǒng)方法相比，改良染色方法脫膜面積較小，多數(shù)為+和2+；而傳統(tǒng)染色方法脫膜面積較大，多數(shù)為3+和4+，脫膜程度明顯，見表1。

圖2 3種染色法染色后的脫膜效果

表1 3種染色法染色后脫膜程度及脫膜率比較

2.2.2 3種染色方法的染色效果比較 見圖3。傳統(tǒng)染色法因采用蒸餾水溶血，造成蟲體結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)分散不完整，同時(shí)在溶血沖水過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致瘧原蟲丟失，背景雜質(zhì)偏多，特別在瘧原蟲數(shù)量不多的情況下，對(duì)瘧原蟲的檢出增加難度。文獻(xiàn)報(bào)道染色法由于采用蒸餾水與瑞氏染液混合后染色，因其染色環(huán)境偏堿，蟲體特別是瘧原蟲胞核染色較淡，背景呈藍(lán)色云霧狀，干擾瘧原蟲的檢出。改良方法染色效果佳，易于觀察，特別對(duì)瘧原蟲感染率較低時(shí)，因結(jié)構(gòu)完整、結(jié)構(gòu)清晰更有優(yōu)勢(shì)，易于檢出。

圖3 3種染色方法的鏡下染色效果（×1 000）

2.3 改良染色方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性評(píng)估結(jié)果 隨機(jī)選取5名本實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員和5名實(shí)習(xí)學(xué)生采用此改良方法進(jìn)行厚血膜染色，陰、陽(yáng)性標(biāo)本均染出了背景清晰、易于辨認(rèn)的合格的厚血膜片；表明此染色方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，易于掌握。

3 討論

鏡檢瘧原蟲是診斷瘧疾的金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前國(guó)內(nèi)外通用的最直接、最重要的檢測(cè)方法，特別是厚血膜的鏡檢［5-7］。但是傳統(tǒng)厚血膜染色方法，需要先用蒸餾水溶血再染色，溶血過(guò)程容易脫膜從而造成漏檢，操作過(guò)程復(fù)雜費(fèi)時(shí)，對(duì)于新手操作要求比較高，較難染出一張背景干凈、蟲體清晰的厚血膜片。也曾有同行嘗試改良染色方法，其中有文獻(xiàn)報(bào)道［5］，先用瑞氏染液與蒸餾水按照患者血紅蛋白的量選擇合適比例制成待染液，染色后鏡檢。我們按相應(yīng)操作重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該方法脫膜現(xiàn)象不明顯但背景不干凈，影響蟲體辨認(rèn)；此外，瑞氏染液對(duì)胞核染色欠佳，蟲體胞核著色普遍偏淡。

鑒于傳統(tǒng)染色、文獻(xiàn)報(bào)道染色法存在不足，以及厚血膜片染色對(duì)臨床診斷的重要性，我們對(duì)厚血膜片的染色做了進(jìn)一步改良發(fā)現(xiàn)，以1∶15的瑞吉染液與緩沖液混合后染色30 min效果最佳。首先，此改良方法優(yōu)勢(shì)首先在緩沖液的pH 6.6～6.8環(huán)境下，不但可以對(duì)紅細(xì)胞起到很好的溶血作用，而且在一定程度上保持瘧原蟲蟲體完整性，并且結(jié)構(gòu)清晰、背景干凈。其次，使用改良染色法省略了蒸餾水溶血的過(guò)程，簡(jiǎn)化了染色步驟，減少溶血及沖水過(guò)程中瘧原蟲的丟失，與傳統(tǒng)染色方法比較，脫膜率明顯降低。再者，該染色操作過(guò)程簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，僅需把瑞吉染液與緩沖液進(jìn)行簡(jiǎn)單稀釋后染色即可，此改良方法中所用的染液，其本質(zhì)為瑞吉染液，其對(duì)瘧原蟲染色效果好，染色時(shí)間適中，臨床上應(yīng)用廣泛，并且為商品化試劑，使用方便。

瘧原蟲厚血膜改良染色方法在一定程度上簡(jiǎn)化了染色過(guò)程，提高了瘧原蟲厚血膜的染色效果，但在染色過(guò)程中需要注意幾個(gè)操作關(guān)鍵點(diǎn)：首先，制片時(shí)選用的玻片需要清洗后使用，防止脫膜；其次，厚血膜制備好，須做到充分干燥，可借助37℃溫箱縮短干燥時(shí)間，以防止染色和沖水過(guò)程導(dǎo)致脫膜；另外，制備好的厚血膜要在48 h內(nèi)完成染色，防止放置過(guò)久因血紅蛋白變性而影響溶血效果。