黃玲，伍細言，江利，李蘇萍，陸金春（.郴州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南郴州4000；.湖南省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，長沙40008；.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，南京007）

國內(nèi)將3次或3次以上在妊娠28周之前的胎兒丟失定義為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），同時提出應(yīng)重視連續(xù)發(fā)生2次的流產(chǎn)并予評估［1］。RSA病因復(fù)雜多樣，包括已知的遺傳、解剖、內(nèi)分泌、感染、免疫因素和血栓前狀態(tài)。此外，仍有約三分之一的患者病因不明，為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）［2］。對URSA病因?qū)W研究通常以女性因素為主，關(guān)注男性因素的研究較少。研究表明，對于不孕不育夫婦，男性因素約占40%～50%［3］。精液常規(guī)分析是目前判斷男性不育的最常用指標，因其只能反映最基本的精液質(zhì)量、各參數(shù)波動的范圍又較大［4］，故不能準確反映精子是否有正常的受精力，也不能預(yù)測精子受精及胚胎發(fā)育潛能。有學(xué)者［5-6］認為精子DNA損傷可能影響胚胎發(fā)育并導(dǎo)致流產(chǎn)。目前，臨床上主要通過精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentation index，DFI）來反映精子DNA損傷。本研究擬通過精子染色質(zhì)擴散法（sperm chromatin dispersion，SCD）檢測精子DFI以探討男性因素與URSA發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年8月至2020年12月來我院就診的59例URSA患者的配偶作為研究對象（實驗組）。男方年齡25～49歲，中位年齡38歲；女方年齡27～40歲，中位年齡36歲；夫妻雙方染色體正常，女方與同一配偶發(fā)生連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)。排除以下流產(chǎn)因素：生殖系統(tǒng)解剖異常，內(nèi)分泌代謝異常，免疫功能異常，腫瘤，生殖道感染，近6個月內(nèi)有放、化療史。另收集53例有正常生育能力的男性志愿者作為對照組，男方年齡28～51歲，中位年齡39歲；女方年齡28～40歲，中位年齡36歲；女方近一年內(nèi)有正常生育史且無流產(chǎn)史。兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對象均簽署知情同意書，該研究獲得我院倫理委員會批準（批準文號：2021008）。

1.2 主要試劑與儀器 SCD檢測試劑盒購自深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程公司，CX33型普通光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 標本采集及精液常規(guī)分析 研究對象禁欲2～7 d，院內(nèi)手淫取精，獲取標本后于37℃溫箱內(nèi)液化，參照《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）對精子濃度、活力和精子形態(tài)進行分析［7］。同時留取至少100μL新鮮精液存放于-20℃環(huán)境中用作精子DFI檢測。

1.4 精子DNA完整性檢測 用SCD法按照試劑盒說明書檢測精子DNA的完整性。用普通光學(xué)顯微鏡觀察400個染色的精子，分為大、中、小、無暈環(huán)和退化5個等級（染色質(zhì)較完整的精子，能觀察到深染的精子頭部，且有明顯的核暈環(huán)，呈中暈環(huán)或大暈環(huán)；而染色質(zhì)斷裂較多的精子，染色后僅能觀察到深染的精子頭部，看不到暈環(huán)或僅有少量的核暈存在）。精子DNA完整率=（大暈環(huán)+中暈環(huán)）精子/被觀察精子總數(shù)×100%。精子DFI（%）=1-精子DNA完整率。精子DFI增高，表明精子DNA損傷增加，精子DNA完整性降低。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行。計數(shù)資料用百分率描述，組間比較采用卡方檢驗。符合正態(tài)分布的定量資料用±s描述，組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗；非正態(tài)分布的定量資料用M（P25，P75）描述，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI的比較 實驗組和對照組正常形態(tài)精子百分率、禁欲天數(shù)、精液量、精子濃度及前向運動精子百分率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），但精子DFI差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。進一步對實驗組精子DFI與年齡、流產(chǎn)次數(shù)及精液常規(guī)參數(shù)進行Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，其與男方年齡、女方年齡及流產(chǎn)次數(shù)呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.288、0.239和0.230（P＜0.05）；與PR呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.265（P＜0.05）；而與禁欲天數(shù)、精液量、精子濃度及正常形態(tài)精子百分率均無相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)分別為0.013、0.075、0.036及-0.082，P＞0.05）。

表1 實驗組和對照組精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI結(jié)果比較

2.2 不同精子DFI分組間URSA發(fā)生率的比較 對精子DFI按≤10%、11%～20%、21%～30%和＞30%分組，其URSA的例數(shù)分別為6、30、10、13，非URSA的例數(shù)分別為16、28、6、3，見表2。隨著精子DFI的增高，URSA的發(fā)生率增加，不同精子DFI分組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.009）。

表2 不同精子DFI分組間URSA發(fā)生率的比較

2.3 不同年齡分組男性精子DFI的比較 將研究對象按年齡＜30歲、31～35歲、36～40歲、41～45歲、＞45歲分為5組，精子DFI結(jié)果見表3，5組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），年齡越大其精子DFI越高。其中，≤30歲組精子DFI與36～40歲組、41～45歲組及＞45歲組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

表3 不同年齡段男性精子DFI的比較（±s）

表3 不同年齡段男性精子DFI的比較（±s）

注：*，與≤30歲組比較，P＜0.05。

年齡（歲） n 精子DFI（%）≤30 6 10.50±4.71 31～35 28 14.43±7.71 36～40 44 19.23±9.65*41～45 20 19.15±9.49*＞45 14 21.57±8.07*合計 112 17.84±9.11

2.4 實驗組和對照組≤35歲研究對象精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI的比較 表3示年齡是影響精子DFI的重要指標。男女雙方年齡均≤35歲的研究對象中，實驗組12例，對照組18例，實驗組精子DFI為（16.22±8.68）%，對照組為（10.75±4.60）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間其他各指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表4。

表4 實驗組和對照組≤35歲研究對象精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI結(jié)果（±s）

表4 實驗組和對照組≤35歲研究對象精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI結(jié)果（±s）

分組 女方年齡（歲）男方年齡（歲） DFI（%）禁欲天數(shù)（d）精液量（mL）精子濃度（×106/ml）前向運動精子百分率（%）實驗組（n=12） 30.9±2.3 31.7±1.9 16.22±8.68 4.72±1.23 2.92±0.69 33.17±12.85 29.44±8.77對照組（n=18） 30.6±2.2 30.7±2.7 10.75±4.60 4.08±1.51 2.87±0.66 30.83±15.58 25.33±8.15 t值 0.361 1.275 2.081 1.276 0.221 0.448 1.293 P值 0.721 0.213 0.047 0.212 0.827 0.658 0.207

3 討論

精液常規(guī)分析是臨床上評估男性生育力的一項基本檢測手段，從精液量、精子濃度與活力以及精子形態(tài)等方面反映精液質(zhì)量，對男性“少弱畸形精子癥”引起的不育具有診斷價值。本研究通過比較實驗組和對照組精液常規(guī)參數(shù)如精液量、精子活力、正常形態(tài)精子百分率發(fā)現(xiàn)，精液量、精子濃度、前向運動精子百分率以及正常形態(tài)精子百分率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），提示精液常規(guī)檢測參數(shù)與URSA沒有明顯相關(guān)性。

精子核DNA是一種被魚精蛋白緊密包裹著的高度折疊結(jié)構(gòu)［8］，是重要的遺傳物質(zhì)，其完整性是準確傳遞遺傳信息的基礎(chǔ)，能夠影響精子的受精能力、受精卵的分裂，并且在胚胎發(fā)育方面有著決定性作用［9］。本研究通過SCD法檢測URSA患者丈夫的精子DNA完整性，結(jié)果顯示實驗組與對照組精子DFI分別為17.00%（13.00%，28.00%）和12.00%（9.50%，18.00%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與Pu等［10］meta分析結(jié)論一致，即男方精子DFI與URSA呈正相關(guān)，可被應(yīng)用于RSA的評估，尤其是URSA。Bareh Gihan等［5］指出，RSA夫婦中男方精子DFI高于對照組，并推測RSA可能與父方基因表達影響胚胎植入、胎盤增殖及血管化，進而影響胎盤質(zhì)量等有關(guān)。這可能是由于精子DNA通常會由活性氧引發(fā)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)其單鏈或雙鏈斷裂。DNA受損的精子雖可與卵母細胞結(jié)合，但在后續(xù)的胚胎發(fā)育過程中因其基因組被激活后，父性相關(guān)基因調(diào)控失敗而誘發(fā)流產(chǎn)［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著男方年齡增加，精子DFI增加，與劉樹沅等［12］研究顯示的精子DFI與年齡呈正相關(guān)的結(jié)論一致。相關(guān)研究顯示［13-14］，當女性年齡≥35歲后，其自然流產(chǎn)風(fēng)險增加，妊娠率和活產(chǎn)率下降，各種妊娠合并癥、并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險不斷上升。為排除高齡原因?qū)е耈RSA的增加，本研究還分析了夫妻雙方年齡≤35歲年齡段的精液常規(guī)參數(shù)及精子DFI的差異，結(jié)果表明精子DFI差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而精液常規(guī)參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，精子DNA完整性檢測可被認為是一項能幫助評估RSA的指標。