靳思涵,張書睿,李婉明

(中國醫(yī)科大學生命科學學院衛(wèi)生部細胞生物學重點實驗室醫(yī)學細胞生物學教育部重點實驗室細胞生物學教研室,中國遼寧沈陽110122)

1953年,Watson和Crick提出著名的DNA雙螺旋結構模型[1],人類對DNA的研究開啟了一個新紀元。1982年,紐約大學的Seeman教授首次提出DNA納米技術這一概念,即利用堿基之間的互補配對(A-T,C-G)原則將DNA的經典線性組裝成三維晶體結構[2]。Seeman教授設計的四臂連接體是利用兩個DNA片段單鏈末端的序列互補發(fā)生雜交而成,這個簡單的構想逐漸成為了DNA自組裝的主要策略。隨后,越來越多的研究者設計出各種各樣的DNA納米結構,如四邊形DNA納米結構[3]、DNA雙交叉瓦片[4]、DNA張力三角形結構[5]、DNA 折紙術[6]、DNA“樂高”積木[7]等,推動了DNA納米技術的蓬勃發(fā)展,同時也使得DNA納米結構在不同的研究領域得到廣泛的應用。核酸適配體(aptamer,Apt)是一類能夠高親和力、高特異性地與靶標發(fā)生結合的寡核苷酸序列,其獨特的優(yōu)勢使其近年來成為腫瘤研究的理想工具[8]。將核酸適配體的特異性識別特性與DNA納米結構相結合形成的核酸適配體-DNA納米結構,可以為腫瘤診斷和治療提供更加有效的、低毒副作用的方法[9]。本文主要介紹了DNA納米結構和核酸適配體的特點與優(yōu)勢,總結了核酸適配體-DNA納米結構用于腫瘤特異性檢測、靶向成像及診療新策略等方面的研究進展。

1 DNA納米結構

DNA納米結構是以DNA片段作為基本材料,利用堿基互補配對原則進行自組裝,進而雜交形成具有特定形狀及功能的空間結構,如三鏈結構、離子橋聯(lián)配合物、i-motif、G-四鏈體以及發(fā)卡結構等[10]。由于DNA的空間結構具有較高的可控度和精密度,所以組裝成的DNA納米結構具有許多獨特的優(yōu)點:生物相容性和無毒性、不易被核酶降解、良好的可設計性和高滲透性等,這使得DNA納米結構具有優(yōu)越的生物醫(yī)學應用前景[11～14]。Liu等[12]設計出一個具有高選擇性的DNA納米探針,可用于線粒體中pH值和Ca2+的定量分析以及細胞的實時成像。Raniolo等[13]利用設計的葉酸-DNA納米籠對兩種獨特的由內化途徑介導的細胞攝取過程進行了研究。此外,還有研究者設計了能在特定DNA軌道上行走的DNA納米小人,其可在DNA互補雜交的熱動力學效應產生的能量推動下實現納米尺度下的物質輸送[14]。隨著DNA納米技術的快速發(fā)展,不同維度、多種形狀和大小各異的DNA納米結構被組裝出來(圖1),并且基于其易于修飾的特征,功能化的DNA納米結構由于兼具DNA納米結構和特異性功能分子的特性,在生物檢測和成像、藥物輸送等領域應用廣泛[14]。

圖1 不同維度的DNA納米結構Fig.1 DNA nanostructures in different dimensions

2 核酸適配體

核酸適配體是一段短的寡核苷酸片段(ssDNA或RNA),通過一種指數富集的配體系統(tǒng)進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)在一個人工構建的隨機寡核苷酸文庫中篩選獲得。核酸適配體能夠折疊形成特定的三維空間結構(如G-四鏈體、發(fā)夾和假結等),與靶物質發(fā)生高親和力、高特異性的結合[15],因此被稱為“化學抗體”(圖2)。與蛋白質類抗體相比,核酸適配體具有靶物質廣泛、相對分子質量小、穩(wěn)定性高、免疫原性低、易于化學修飾、特異性與親和力更高等優(yōu)勢,因此在生物醫(yī)學領域具有廣泛的應用價值[16～17]。利用核酸適配體與靶物質的特異性識別特性,結合不同的修飾基團或納米材料,可以設計出多種多樣的具有靶向性的分子探針,在活細胞靶向成像、腫瘤診斷及治療、藥物遞送等領域都有著良好的應用前景[18～20]。比如:作為特異性識別單元構建的熒光探針或傳感器,可以快捷、靈敏地對細胞內或細胞表面的物質進行檢測和定量分析;與抗腫瘤藥物相結合構建的主動靶向藥物載體可以實現藥物的靶向傳遞,并有效地降低對周圍正常組織的毒副作用。因此,核酸適配體是腫瘤靶向診斷和治療的一類理想工具。

圖2 核酸適配體結合靶標的示意圖Fig.2 Schematic diagram of a nucleic acid aptamer binding its target

3 核酸適配體-DNA納米結構

近年來,將核酸適配體的序列結構鑲嵌到自組裝的DNA納米骨架中構建的核酸適配體-DNA納米結構(圖3),既具有核酸適配體的靶向特性,又具有DNA納米結構良好的生物相容性和可編程性,因此在分離分析、生物傳感器、生物成像和藥物精準輸送等領域得以廣泛的研究與應用[21～24]。其作用機制是在核酸適配體靶物質存在的情況下,通過與核酸適配體的特異性識別作用引起自組裝體中DNA分子骨架的結構變化,進一步引起光譜性質的改變或自組裝體內物質的釋放,從而實現生物特異性檢測、靶向成像及疾病治療的目的[21]。Rinker等[22]利用DNA納米結構的精確尋址性控制與凝血酶不同區(qū)域結合的兩個核酸適配體Apt-A和Apt-B之間的間距,從而操縱二者與凝血酶結合的能力,這是首例利用核酸適配體-DNA納米結構人工模擬控制生物大分子相互作用的報道。Tang等[23]將PfLDH(plasmodium falciparum lactate dehydrogenase)核酸適配體整合到DNA納米結構中用作瘧疾治療,通過蛋白質識別觸發(fā)核酸適配體的構象改變,從而打開DNA折紙納米盒,釋放盒內的藥物,進行靶標特異性治療。隨著以細胞為靶標的SELEX(cell-SELEX)技術的發(fā)展,越來越多的腫瘤特異性核酸適配體被篩選出來,基于核酸適配體的DNA納米結構有望成為腫瘤靶向診斷和治療的理想工具。

圖3 基于核酸適配體的DNA納米結構Fig.3 DNA nanostructures based on nucleic acid aptamers

4 核酸適配體-DNA納米結構在腫瘤診斷中的應用

發(fā)展能夠高靈敏、高特異性地檢測和分析腫瘤細胞的新方法或新策略,對腫瘤的預測及早期發(fā)現具有重要意義。近幾年,越來越多的研究者設計多種多樣的核酸適配體-DNA納米結構用于腫瘤細胞的檢測[25～28],有望為腫瘤診斷提供更加便捷、快速和靈敏的新策略(表1)。

表1 核酸適配體-DNA納米結構在腫瘤診斷中的應用Table 1 Application of aptamer-DNA nanostructures in tumor diagnosis

4.1 用于膜蛋白標志物的檢測

細胞膜表面蛋白質被認為是腫瘤的候選生物標志物,因此靈敏而準確地對腫瘤細胞表面的膜蛋白進行定量分析,對腫瘤的發(fā)現和預測具有重要意義。Tan課題組通過cell-SELEX技術篩選出的一系列能夠特異性識別腫瘤膜蛋白的核酸適配體探針可應用于多種腫瘤細胞的檢測。比如,將特異性識別膜蛋白蛋白質酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7,PTK7)受體的Sgc8c適配體設計成一種可激活型的熒光分子探針,用于腫瘤細胞的特異性檢測[25],遺憾的是其靈敏度未能達到腫瘤早期檢測的要求。雜交鏈式反應(hybrid chain reaction,HCR)是一種基于DNA鏈取代反應的等溫信號放大技術。在HCR體系中,靶分子引發(fā)兩種DNA莖環(huán)交替開環(huán),自組裝得到包含大量重復單元的線性雙鏈DNA納米結構,具有恒溫、免酶、效率高等優(yōu)點。Tan課題組首次在細胞膜上利用HCR構建DNA納米結構,并提出該結構可以用于細胞監(jiān)測和細胞活性研究等[26],提供了一種可以在細胞膜上通過DNA自組裝的方式進行信號放大的策略。但是,腫瘤細胞表面的膜蛋白標志物往往不是特異性只表達在腫瘤細胞上的,因此,利用單一分子標志物進行檢測會導致無法準確判斷出早期的疾病,而利用多種分子標志物同時多重檢測能夠有效地提高疾病診斷的準確性[29]。為進一步提高檢測的特異性和準確性,Tan課題組利用前期cell-SELEX篩選獲得的3個核酸適配體:Sgc8c、Sgc4f和TD05,設計了基于DNA的設備——納米爪;結合DNA適配體鏈置換反應的特殊結構轉換特性,當細胞膜表面同時存在這3種核酸適配體結合的靶標時,該納米爪能夠對多種癌細胞表面標志物進行基于自主邏輯的分析,并相應地產生診斷信號[28]。

4.2 用于腫瘤成像

腫瘤的靶向成像在腫瘤的診斷治療過程中具有重要意義。以惡性腫瘤特異性表達的分子作為靶點,利用與其特異性識別的核酸適配體結合DNA納米結構,可以特異性區(qū)分腫瘤組織和正常組織,這在腫瘤的早期診斷及手術精確切除中具有明顯的優(yōu)勢。Zhu等[26]構建了基于核酸適配體的自組裝熒光DNA納米裝置(self-assembled fluorescent DNA nanodevices,aptNDs),利用核酸適配體Sgc8與PTK7的特異性識別,引起aptNDs在細胞膜表面的自組裝,并發(fā)生熒光能量共振轉移,實現靶腫瘤細胞的原位成像。Liu等[27]構建了一種雙靶向的DNA-四面體藥物載體,用于乳腺癌細胞的靶向成像和靶向藥物傳遞?？苫罨酿さ鞍?(mucin 1,MUC1)探針是由熒光基團標記的MUC1適配體序列與DNA四面體頂點延伸的帶有淬滅基團的互補序列雜交形成。當存在MUC1陽性細胞時,MUC1適配體與細胞發(fā)生結合,引起探針的構象發(fā)生改變,釋放帶有淬滅基團的互補序列并導致熒光恢復,該過程不僅可對細胞膜上的MUC1蛋白進行成像分析,而且可成功地對MUC1陽性細胞和MUC1陰性細胞進行區(qū)分。

5 核酸適配體-DNA納米結構在腫瘤治療中的應用

目前的癌癥療法通常缺乏選擇性,且吸收率低、藥物排泄迅速,因此,制定可以靶向到達腫瘤細胞并減輕對正常組織不良反應的藥物傳遞系統(tǒng),一直是癌癥領域的研究重點。利用核酸適配體-DNA納米結構構建的主動靶向遞送系統(tǒng)(表2),能夠將藥物精準地遞送至腫瘤部位,顯著增強藥物治療的效果[30～38]。

表2 核酸適配體-DNA納米結構構建的藥物靶向遞送系統(tǒng)Table 2 Targeted drug delivery system constructed by aptamer-DNA nanostructures

5.1 用于化療藥物的運輸

阿霉素(doxorubicin,Dox)是臨床廣泛使用的抗腫瘤藥物,但Dox沒有選擇性,具有嚴重的毒副作用,這限制了其在臨床上對腫瘤的療效。Chang等[30]構建了一個核酸適配體共軛的DNA二十面體作為化療藥物Dox的納米載藥體系(aptamer-conjugated doxorubicin-intercalated DNA icosahedra,Doxo@Apt-DNA-icosa),實現了Dox藥物的靶向攝入并特異性殺傷乳腺癌細胞的目的。這是最早關于核酸適配體-DNA納米結構作為藥物載體的報道之一。Li等[31]利用HCR構建了基于核酸適配體Zy1的多價DNA納米蜈蚣結構,這個結構表現出高的載藥量和藥物的選擇性輸送;Zy1能夠靶向人肝癌細胞SMMC-7721,與SMMC-7721細胞發(fā)生結合后將裝載的Dox釋放至細胞內發(fā)揮毒性作用,同時Zy1對人正常肝細胞L02并沒有靶向和給藥的作用。Zhu等[32]利用核酸適配體Sgc8構建了自組裝的DNA納米火車(aptamer-tethered DNA nanotrains,aptNTrs),aptNTrs能夠將藥物轉運至靶細胞并誘導選擇性的細胞毒性,同時可增強非靶細胞的最大耐受劑量;小鼠的體內實驗證實通過aptNTrs遞送的藥物具有強大的抗腫瘤功效,并大大降低了毒副作用。Wei等[33]通過簡單的一步法自組裝方式將由pH響應的imotif序列和靶向MUC1適配體-免疫佐劑(cytosine-phosphate-guanine,CpG)融合序列(CpG-MUC1)組裝成十字形DNA,并整合至DNA納米水凝膠中,構建成一個具有靶向、免疫刺激和化療療法的智能DNA納米系統(tǒng);將Dox插入CpG-MUC1水凝膠的堿基對中,在酸性條件下其會分解并釋放Dox和CpG。研究結果表明,該系統(tǒng)具有精確的靶向遞送功能、強大的免疫刺激活性以及相當高的誘導細胞凋亡效率,且?guī)缀鯖]有副作用。

5.2 用于核酸藥物的運輸

為了克服多藥耐藥的問題,Wu等[34]將MDR-1(multidrug resistance 1)的反義核苷酸(antisense,AS)裝載在KK1B10核酸適配體修飾的多功能DNA納米組裝體(aptamer-based DNA nanoassembly,Apt-NA),用于選擇性殺傷耐藥性骨髓性白血病細胞。研究報道,當KK1B10核酸適配體特異性識別耐藥細胞系K562/D時,AptNA被選擇性攝入細胞內,此時特異性抑制P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表達的MDR-1-AS就會被釋放,并通過降低細胞的耐藥性發(fā)揮作用。實驗結果證實AptNA對靶腫瘤細胞具有特異性的細胞毒性作用。這種多功能的、可編程的、基于核酸適配體的DNA納米組裝體是一種理想的生物醫(yī)學研究工具,有望為癌癥的靶向治療提供新的思路。

5.3 用于蛋白質藥物的運輸

目前,疫苗、免疫球蛋白等藥物在癌癥的治療中已被廣泛使用,然而其靜脈注射的給藥方式缺乏特異性,且細胞穿透性較差,這使其藥效受到影響。Douglas等[35]設計了一個利用核酸適配體的構象變化人為控制開關的DNA六面桶狀納米結構,抗體藥物被裝載在DNA納米結構的桶內,只有當兩個核酸適配體同時與其靶標受體相結合時,DNA六面桶狀納米結構才能被打開,內部裝載的抗體藥物才能被釋放出來發(fā)揮作用。研究證實,該結構系統(tǒng)不僅提高了對靶腫瘤細胞的選擇性,還成功實現了抗體藥物的可控釋放,有效地抑制了白血病細胞的增殖生長。這種基于DNA自組裝結構構建的邏輯門控制藥物釋放的方法使得藥物的輸送和釋放具有很強的可控性,顯著提高了藥效。

5.4 用于金屬絡合藥物的運輸

有些藥物只有進入細胞核內才能發(fā)揮抗癌作用,比如部分金屬絡合藥物,但核膜的屏障作用使得細胞質中的藥物只有極少量(1%～5%)能夠擴散至細胞核中發(fā)揮毒性作用[39]。為了增加進入細胞核中的藥物劑量,Tian等[36]制備了一種基于雙靶向DNA四面體的抗癌金屬絡合物載藥系統(tǒng)Apts-DNA@Ir,將識別MUC1的核酸適配體和識別核仁素的核酸適配體AS1411分別連接在DNA的5′末端。實驗結果表明,在MUC1核酸適配體的靶向識別作用下,Apts-DNA@Ir能夠特異性識別膠質瘤細胞,同時在AS1411靶向識別核仁素的作用下,Apts-DNA@Ir能夠逐漸進入膠質瘤細胞核內并釋放抗癌金屬絡合物IrPP([Ir(ppy)2phen]﹢PF6),從而抑制細胞的生長和侵襲,而游離的IrPP由于細胞核的屏障作用幾乎不能進入到細胞核內。該研究為更加高效精確地治療膠質瘤提供了新的思路,同時也提示采用這種雙靶向設計的DNA納米結構能很好地解決一些藥物難以擴散至細胞核的問題。

5.5 本身作為藥物發(fā)揮作用

AS1411是一種靶向核仁素的DNA核酸適配體,研究表明其對人類急性骨髓性白血病和實體瘤均具有抑制腫瘤細胞增殖的作用,目前正處于Ⅱ期臨床試驗階段[40]。Bermudez等[37]將AS1411適配體懸掛在DNA四面體的3個頂點構建DNA納米結構;實驗研究顯示,在不使用轉染試劑的情況下,與單一的AS1411適配體和DNA四面體相比,AS1411-DNA納米結構更容易被細胞攝取并選擇性抑制癌細胞的生長,而對非癌細胞的生長卻幾乎沒有作用。此外,該研究發(fā)現AS1411-DNA納米結構對核酸酶的降解具有更大的抵抗性,提示這種DNA自組裝納米結構在癌癥治療中具有更大的應用潛力,為輸送多種生物活性分子實現協(xié)同作用提供了參考。Ma等[38]將抗人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)適配體(anti-HER2 aptamer,HApt)連接在DNA四面體(tetrahedral framework nucleic acid,t-FNA)構建DNA納米機器人HER2-HApt-tFNA,該HER2-HApt-tFNA可以靶向HER2陽性的乳腺癌細胞,并特異性誘導膜蛋白HER2的溶酶體降解。體內實驗表明,將HER2-HApt-tFNA注射到小鼠模型中,tFNA的存在增強了HApt的穩(wěn)定性并延長了其血液循環(huán)時間,提示HER2-HApttFNA可以更高效地驅動HER2溶解酶的降解,進而誘導細胞凋亡并阻止細胞生長。這種新穎的DNA納米機器人為乳腺癌精準治療提供了針對性靶向蛋白質降解的新思路。總的來講,這些DNA納米結構既具有對腫瘤細胞的靶向功能,又具有獨特的細胞毒性特征,還具有能夠將活化的有效載荷攜帶和釋放到靶標的能力,為腫瘤的靶向治療提供了新手段。

6 結語與展望

DNA納米結構經過幾十年的發(fā)展,實現了從一維、二維再到三維的組裝模式,其精確的可控性、良好的生物相容性和低毒性的特點,使其在生物醫(yī)學領域具有巨大的應用潛力[41]?；诤怂徇m配體的DNA納米結構在核酸適配體的靶向識別基礎上,可更好地發(fā)揮其生物成像、特異性檢測和藥物主動遞送等作用,從而達到靶向綜合診療的效果。尤其在腫瘤靶向藥物輸送方面,核酸適配體-DNA納米結構實現了化療藥物、核酸藥物、蛋白質藥物和金屬絡合藥物等的主動性靶向運輸,既解決了抗腫瘤藥物缺乏選擇性的難題,也提高了藥物的載量和抗腫瘤效果。因此,多功能的核酸適配體-DNA納米結構已經成為越來越重要的分子工具。除了用作靶向腫瘤診療的平臺之外,核酸適配體-DNA納米結構在生物醫(yī)學領域還可以擁有更為廣泛的應用空間,例如生物傳感、組織工程和仿生學等方面。隨著針對不同分子靶標的核酸適配體的出現,更多的核酸適配體-DNA納米結構將被設計制備出來并應用于不同的研究領域。然而,雖然DNA納米技術發(fā)展快速,但其仍處于發(fā)展的初級階段,依然面臨諸多問題,比如更高級和有效的結構的設計、細胞的攝取和代謝效率、體內的安全性評估等。因此,該領域的發(fā)展仍需研究人員不斷努力。相信在不久的將來,核酸適配體-DNA納米結構可以真正地實現從實驗室走向臨床實踐。