田慧娟,陳 歡,王紅娟,侯宏衛(wèi),胡清源

(國家煙草質量監(jiān)督檢驗中心,中國河南鄭州450001)

煙堿是煙草中備受關注的致癮性物質,同時也是吸煙者持續(xù)使用煙草制品的主要原因之一,但煙堿成癮的作用機制尚未被完全揭示。煙堿隨卷煙煙氣吸入肺部,經肺泡血液交換迅速進入動脈循環(huán),透過血腦屏障后與中樞神經元表面的煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)結合,作用于中腦邊緣多巴胺系統(tǒng),進而產生獎賞效應[1]。在所有 nAChRs中,α4β2nAChRs和α7nAChR的表達豐度最高,分布最廣泛,普遍存在于神經元和非神經元細胞中,占大腦中nAChRs的90%以上。

α7nAChR是由5個相同亞基組成的五聚體跨膜寡蛋白[2～4],由502個氨基酸組成,相對分子質量約56 kD,其N-端結構域含有胞外二硫鍵,可以產生1個半胱氨酸環(huán),形成半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道[5～6],對鈣離子高度敏感,參與調節(jié)細胞間信號轉導和神經遞質釋放[7]。作為大腦中最豐富的乙酰膽堿受體,α7nAChR與α4β2nAChRs在分布位置、功能特性(例如激活動力學、脫敏和脫敏恢復)及鈣離子滲透性等方面都存在較大區(qū)別。首先,α7nAChR的5個亞基系屬相同類型,而α4β2*nAChRs則是異源五聚體,并且有可能再與其他亞基相結合(符號“*”表示可能存在其他亞基);其次,α7nAChR在神經系統(tǒng)中大多位于突觸前,而α4β2nAChRs則大多是突觸后定位[5,8～9];第三,α7nAChR對鈣離子具有更強的通透性,鈣離子可以引發(fā)谷氨酸的釋放,而α4β2nAChRs具有更強的鈉、鉀、氯離子通透性[5];第四,突觸前定位的α7nAChR主要通過下列方式發(fā)揮作用:煙堿等與乙酰膽堿結構類似的激動劑與受體結合后通過軸突-軸突型突觸改變突觸前膜的結構,打開鈉、鈣離子通道,陽離子進入細胞進一步激活電壓依賴性鈣通道,從而允許更多的鈣離子進入,進入神經元細胞的鈣離子促進谷氨酸等神經遞質的釋放,實現突觸傳遞的變化[10～14](圖1)。而突觸后定位的α4β2nAChRs發(fā)揮作用則是由興奮的中間神經元末梢釋放γ-氨基丁酸等神經遞質,這些神經遞質與突觸后膜受體結合,增加其對鉀、氯離子的通透性,產生突觸后電位,實現超極化現象[5];第五,與α4β2nAChRs相比,α7nAChR的脫敏速度和脫敏恢復速度均較慢[15],因此早期被認為與煙堿的親和力低,對煙堿致癮作用的貢獻度有限。

圖1 α7nAChR結合煙堿借由鈣離子調控谷氨酸釋放Fig.1 α7nAChR binds nicotine to regulate glutamate release through calcium ion

相關證據顯示,α7nAChR在精神分裂癥[16～18]、認知障礙[19]、阿爾茨海默病等神經退行性疾病[20]以及學習記憶[21]等方面發(fā)揮著重要作用。α7nAChR在神經系統(tǒng)中的重要性主要體現在兩個方面:1)其在外周免疫細胞和負責學習、記憶腦區(qū)的神經元中表達,可通過信號轉導調節(jié)學習、記憶[22]和疼痛反應,并通過抑制炎癥來發(fā)揮神經保護作用[23～24];2)α7nAChR可調節(jié)γ-氨基丁酸、谷氨酸、多巴胺等多種神經遞質的釋放,在突觸前神經遞質釋放的短期變化以及突觸后樹突可塑性的信號轉導中具有重要意義。近年來,α7nAChR在煙堿成癮過程中發(fā)揮的重要作用逐漸受到關注[7,16,25]。課題組前期成功構建了煙堿條件性位置偏愛(conditioned place preference,CPP)模型,該模型包括煙堿成癮的獲得、消退和重建3個階段,以模仿吸煙成癮、戒煙和復吸[26]。通過對比不同階段大鼠中腦腹側被蓋區(qū)的α7nAChR表達量,發(fā)現大鼠中腦腹側被蓋區(qū)的α7nAChR表達量在CPP成癮階段未發(fā)生顯著變化,但在消退階段顯著下調,提示α7nAChR在煙堿成癮和戒斷過程中可能發(fā)揮重要作用(尚未發(fā)表)。大量研究顯示,調控α7nAChR對實驗動物煙堿成癮模型的構建和戒斷均產生重要影響,這里將針對α7nAChR在煙堿成癮不同階段所起的作用進行詳細綜述,并闡述其潛在作用機理。

1 煙堿暴露對α7nAChR表達量的影響

多重證據顯示,煙堿暴露將引起各個腦區(qū)α7nAChR表達量的變化。相關研究對大鼠進行煙堿皮下暴露(6 mg·kg-1·d-1)14 d后,制備腦冷凍切片,并進行[125I]-銀環(huán)蛇毒素定量放射自顯影,結果顯示慢性煙堿暴露導致所有腦區(qū)的α7nAChR表達量上調[27～28]。在Slotkin等[29]的研究中,對大鼠進行煙堿皮下暴露(6 mg·kg-1·d-1)15 d后,不同腦區(qū)α7nAChR表達量上調程度依次為:紋狀體區(qū)域＞腦干區(qū)域＞小腦區(qū)域。Small等[30]在大鼠煙堿靜脈暴露(5 mg·kg-1·d-1)8～10 d的實驗中利用放射自顯影的手段發(fā)現,小鼠腦部海馬區(qū)域的α7nAChR表達量升高。Pakkanen等[31]在電子顯微鏡下觀察到,通過飲水實施煙堿暴露8周的大鼠(前3周:50 μg/mL;3～7 周:350 μg/mL;7～8 周:500 μg/mL),其腹側被蓋區(qū)α7nAChR的免疫標記增加,α7-nAChR表達量增加。另外,含煙堿的卷煙煙氣和電子煙氣溶膠暴露也可以引發(fā)腦區(qū)α7nAChR表達量的變化。Small等[30]在卷煙煙氣暴露的研究中借助放射自顯影發(fā)現,卷煙煙氣暴露28 d可以增加小鼠海馬CA2/3區(qū)域和角質層中的α7nAChR表達量。Alasmari等[32]利用蛋白質印跡法發(fā)現,吸入電子煙氣溶膠6個月后小鼠紋狀體中α7nAChR的表達量上調。

此外,停止煙堿暴露也會相應引發(fā)α7nAChR表達量的變化。Slotkin等[29]對大鼠進行煙堿皮下暴露(6 mg·kg-1·d-1)7 d后,停止煙堿暴露3 d,放射自顯影結果顯示α7nAChR水平恢復至正?；蚵缘陀谡Ｋ?且直到停止煙堿暴露30 d后都沒有進一步變化。在煙堿戒斷24 h后,Borkar等[33]利用熒光顯微鏡發(fā)現在小鼠海馬神經元上α7nAChR共標記抗體的免疫應答增強,α7nAChR表達量增加。Barik等[34]將大鼠煙堿皮下暴露(4 mg·kg-1·d-1)14 d后,戒斷3 d,免疫熒光染色結果顯示,與對照組相比α7nAChR表達量短暫性上調;戒斷7 d后,α7nAChR表達量回落至與對照組相同的水平,α7nAChR的短暫上調伴隨著實驗大鼠戒斷反應的增強,提示下調α7nAChR的表達量可能有助于煙堿戒斷。

上述文獻表明,煙堿暴露后實驗動物不同腦區(qū)的α7nAChR表達量都存在一定程度的上調,煙堿戒斷后α7nAChR的表達量又恢復正常水平。這種α7nAChR表達量水平隨煙堿暴露情況改變而變化的現象,暗示α7nAChR可能與煙堿暴露密切相關。此外,α7nAChR表達量上調不僅在煙堿單獨暴露時發(fā)生,在卷煙煙氣、電子煙氣溶膠等含煙堿的復雜成分暴露中也存在,這意味著α7n-AChR對于煙堿成癮甚至煙草依賴都可能有著重要意義。

2 α7nAChR參與煙堿成癮

2.1 調控α7nAChR對煙堿成癮模型構建的影響

研究發(fā)現,在構建煙堿成癮動物模型的過程中,采用特異性抑制劑或基因敲除等相關手段抑制α7nAChR的功能,對煙堿成癮模型的構建無明顯負面影響。Stolerman等[35]在對野生型和煙堿型乙酰膽堿受體α7亞基基因CHRNA7(α7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor gene)敲除小鼠的對比中發(fā)現,CHRNA7的缺失并不影響小鼠對煙堿的獲取,CHRNA7敲除小鼠同野生型小鼠一樣都可以成功構建煙堿自身給藥成癮模型(0.4 mg/kg、0.8 mg/kg)。Walters等[36]使用 5.0 mg/kg、10.0 mg/kg兩種不同劑量α7nAChR拮抗劑甲基烏頭堿(methyllycaconitine,MLA)對實驗小鼠進行皮下注射(subcutaneous,sc)預處理,發(fā)現其和CHRNA7敲除小鼠均可成功構建煙堿(0.5 mg/kg,sc)CPP模型。Liu[37]借助MLA的腹腔注射(intraperitoneal,ip)預處理(2.5 mg/kg、10 mg/kg)和煙堿自身給藥模型(0.03 mg/kg)證明了下調α7nAChR的功能并不阻礙煙堿自身給藥模型的構建。Pons等[9]的實驗結果也表明,CHRNA7敲除的大鼠在煙堿自身給藥方式(8.7～52.6 μg/kg)下,仍可表現出煙堿急性獎賞效應。Brunzell等[38]通過大鼠靜脈注射煙堿自身給藥模型(0.03 mg/kg)發(fā)現,敲除CHRNA7或施予拮抗劑減弱α7nAChR的功能之后,實驗大鼠仍可成功構建煙堿成癮模型,且相較于對照組提升了煙堿自身給藥的動機。

相反,采用特異性激動劑等手段上調α7n-AChR功能,將對煙堿成癮動物模型的構建產生負面影響。Zhou等[39]發(fā)現,煙堿暴露后的大鼠因運動強度(久坐、高強度、中等強度和低強度)不同大腦中α7nAChR和下游信號分子的表達量出現差異,而α7nAChR和下游信號分子的表達量與Go/NoGo準確性和水迷宮(Morris water maze,MWM)測試性能呈正相關,與CPP評分呈負相關。Brunzell等[16,38]向大鼠腦部伏隔核區(qū)局部顯微注射α7-nAChR激動劑,以揭示其在煙堿成癮構建中的潛在作用,結果顯示在自身給藥模型中大鼠單次輸注煙堿的能力降低(0.03 mg/kg),上調α7nAChR的功能與煙堿強化和獎賞之間存在反比關系。Jackson等[40～41]在小鼠煙堿CPP模型中使用正變構調節(jié)劑(positive allosteric modulator,PAM)(0.5 mg/kg)驗證了上調α7nAChR功能可引起煙堿CPP評分顯著降低,導致小鼠煙堿CPP模型構建時長增加?？傊?多重證據顯示,煙堿成癮模型構建的難度與α7nAChR的表達量呈反比關系,α7nAChR的表達量越高,實驗動物自主獲取煙堿的能力越弱,煙堿依賴的程度越低。

通過不同調控手段對α7nAChR的功能進行抑制或增強,所得到的研究結論并不一致(表1)。當采用基因敲除或特異性抑制劑下調α7nAChR的功能時,并不影響煙堿成癮模型的構建,因此有學者認為α7nAChR在煙堿成癮構建過程中并不是必不可少的,其作用和貢獻可以被其他乙酰膽堿受體替代;當使用特異性激動劑上調α7nAChR的功能時,實驗動物的煙堿成癮模型構建受到了阻礙,構建時長明顯增加或者難以構建煙堿成癮模型,因此部分學者認為α7nAChR對煙堿成癮的構建并非毫無貢獻,上調α7nAChR是解決煙堿依賴問題的一種有前景的手段。

2.2 調控α7nAChR對煙堿成癮戒斷和重建的影響

戒斷和重建是煙堿成癮過程中的重要階段,對于探究煙堿成癮機制具有重要意義。研究者普遍使用拮抗劑或激動劑調控α7nAChR的表達,發(fā)現α7nAChR在煙堿暴露后的戒斷和重建過程中同樣起著重要作用。

在煙堿戒斷過程中,通過下調和上調α7n-AChR的功能發(fā)現,α7nAChR與煙堿戒斷癥狀密切相關,α7nAChR的下調可以減弱戒斷癥狀,利于實驗動物完成戒斷,而α7nAChR的上調可以加重戒斷癥狀。Salas等[42]以 24 mg·kg-1·d-1的劑量實施煙堿皮下暴露,成功構建煙堿成癮模型后開展煙堿戒斷實驗,發(fā)現無論是CHRNA7敲除小鼠還是α7nAChR特異性拮抗劑MLA預處理(7.5 mg/kg)的小鼠,在停止煙堿暴露后,梳理毛發(fā)、抓撓、咀嚼、搖晃、曠場移動距離等戒斷反應均明顯減少。Jackson 等[43]以 36 mg·kg-1·d-1的劑量實施煙堿暴露14 d后停止暴露,發(fā)現CHRNA7敲除小鼠相較于野生型小鼠的戒斷反應減少(如搖頭、爪子震顫、身體震顫、后退、眼瞼下垂、毛發(fā)卷起和跳躍等),同時,通過十字迷宮評價的焦慮樣行為也有所減輕。此外,相關研究報道,非選擇性nAChRs拮抗劑美卡拉明(3.5 mg/kg,ip)可通過抑制所有乙酰膽堿受體功能減弱實驗小鼠的戒斷癥狀,而在此基礎上再給予α7nAChR的完全激動劑PNU-282987(1 mg/kg、3 mg/kg、9 mg/kg,sc),可通過僅上調α7nAChR的功能逆轉這種作用效果,加強戒斷癥狀[41]。

在煙堿成癮的重建過程中,下調α7nAChR表達量可阻礙煙堿成癮重建。Liu等[25,37]采用自身給藥系統(tǒng)對實驗大鼠實施煙堿暴露(0.03 mg/kg),成功構建煙堿自身給藥模型后停止給藥,完成戒斷后,恢復攝入煙堿和自身給藥系統(tǒng)中提示信號的聯系,發(fā)現α7nAChR特異性拮抗劑MLA預處理(10 mg/kg)的大鼠尋求煙堿反應減弱,戒斷后重建失敗。

綜上可知,α7nAChR在煙堿戒斷和重建階段行使了一定的功能,下調α7nAChR的表達可以減弱煙堿戒斷階段的戒斷反應,降低重建的可能性;相反,通過α7nAChR激動劑上調α7nAChR的功能,將加重戒斷癥狀,增加重建的可能性(表1)。

表1 調控α7nAChR對煙堿成癮形成、戒斷和重建的影響Table 1 Effects of regulating α7nAChR on the acquisition,withdrawal and reinstatement of nicotine addiction

2.3 α7nAChR在煙堿暴露中的調控與環(huán)境線索有關

環(huán)境線索對于藥物成癮尤其是煙堿成癮有著重要意義,環(huán)境線索是煙堿成癮重要且不可或缺的因素之一,因為吸煙行為相較于其他濫用藥物要包含更多的環(huán)境線索。近年來,研究者不斷認識到環(huán)境線索暴露在戒煙后復吸中的重要性,但相關神經生物學機制還知之甚少。通過對α7nAChR的表達量實施調控,目前已證實α7nAChR的功能與煙堿成癮過程中的環(huán)境線索特異性相關。

Liu等[37,44]在構建大鼠煙堿自身給藥模型(0.03 mg/kg)的過程中,將煙堿輸注與聽覺/視覺刺激進行關聯,所述聽覺/視覺刺激包括5 s聲音刺激和20 s活動杠桿上方的光照射,完成關聯訓練后,對大鼠腹腔施與不同劑量的α7nAChR特異性拮抗劑MLA(2.5 mg/kg、10 mg/kg)以下調 α7n-AChR的表達,結果顯示實驗大鼠在環(huán)境線索誘導下的煙堿覓藥行為顯著減弱,戒斷后重建失敗,下調α7nAChR的表達可抑制環(huán)境線索誘導的煙堿覓藥行為。研究者提出調控α7nAChR的表達量有望成為減少由環(huán)境線索誘導復吸的一種手段,且指出同樣高表達的α4β2nAChRs并不具備這種特性[25,37,44]。在該項對比研究中,Liu等[37]認為α4-β2nAChRs和α7nAChR在煙堿成癮中發(fā)揮著不同的作用,α4β2nAChRs更多地參與煙堿引起的長時程增強作用,而α7nAChR則更多地調控煙堿線索誘導的條件增強作用。這兩種不同亞型的乙酰膽堿受體在煙堿成癮方面的神經生物學機制是不同且相互獨立的,分別是煙堿的增強作用和煙堿線索誘導的增強作用。

3 α7nAChR在煙堿成癮中的作用機制

3.1 α7nAChR通過谷氨酸調控多巴胺釋放

煙堿與乙酰膽堿受體結合介導釋放多巴胺是煙堿成癮的關鍵環(huán)節(jié)[45]。大量釋放多巴胺是煙堿引起愉悅感的主要原因,并被認為是引發(fā)和維持煙堿成癮的關鍵機制。研究發(fā)現α7nAChR可以影響多巴胺的釋放。Waeiss等[46]直接將3 μL煙堿顯微注射到大鼠后腹側被蓋區(qū),利用高效液相色譜-電化學檢測對微透析結果進行分析,發(fā)現煙堿可刺激伏隔核中的多巴胺釋放,α7nAChR是后腹側被蓋區(qū)中多巴胺能活性的有效調節(jié)劑。Neves等[17]研究發(fā)現,α7nAChR激動劑PNU120596可增加正常大鼠中腹側被蓋區(qū)活躍多巴胺神經元的數量,進而導致多巴胺的釋放量顯著增加。

大量研究探討了α7nAChR調控谷氨酸進而影響多巴胺釋放的分子機制。谷氨酸是大腦中一種關鍵的興奮性神經遞質,在藥物依賴的發(fā)展和維持過程中起著重要作用,如強化、致敏、渴求和復吸[47],谷氨酸能神經元的可塑性變化也介導藥物依賴的強化[32,48]。研究表明,煙堿與α7nAChR結合,開啟離子通道,鈣離子流入[10～13]。進入細胞的鈣離子進一步激活電壓依賴性鈣通道,從而允許更多的鈣離子流入,進而引起谷氨酸的釋放[34,49～51]。同時,鈣離子濃度的增加,也會引發(fā)α7nAChR的上調[14],這解釋了為何煙堿暴露后大腦中α7nAChR的表達量上調。眾多研究表明,煙堿暴露會增加中腦皮質[32]、紋狀體[47,52]和腹側被蓋區(qū)[53]等區(qū)域內谷氨酸的濃度。Ryu等[54]使用實時谷氨酸生物傳感器和開放式行為評估,研究大鼠在卷煙煙氣冷凝物(cigarette smoke condensate,CSC)重復暴露下背側紋狀體中谷氨酸水平的變化與行為變化的關系,發(fā)現將實驗大鼠重復暴露于包含0.4 mg煙堿(1.0 mL·kg-1·d-1,sc)的 CSC 中 14 d,大鼠背側紋狀體區(qū)域細胞外谷氨酸濃度顯著增加。現已有研究證實,長期暴露于煙堿可通過刺激α7nAChR加強煙堿的長時程增強作用,從而導致腹側被蓋區(qū)、伏隔核、前額葉皮層和海馬等腦區(qū)的谷氨酸釋放量大量增加[55]。通過對α7nAChR表達量的調控,研究者進一步驗證了α7nAChR對谷氨酸釋放的調控作用。Jiang等[56]在野生型小鼠和CHRNA7敲除小鼠的對比研究中發(fā)現,煙堿暴露使谷氨酸能突觸傳遞增強,其中α7nAChR發(fā)揮促進谷氨酸能傳遞的作用。Ryu等[47]報道,通過在大鼠背側紋狀體顯微注射MLA的方式下調α7nAChR的功能后,實驗大鼠中煙堿誘導的紋狀體區(qū)域細胞外谷氨酸濃度和神經元活動水平顯著降低。與此類似,Howe等[57]使用谷氨酸生物傳感器以高時間精度監(jiān)測大鼠背側紋狀體中谷氨酸的釋放,證實α7nAChR增加了谷氨酸的釋放量。

同時,谷氨酸能的傳遞將引發(fā)多巴胺能神經元興奮[58],使其釋放大量多巴胺[59],從而帶來愉悅、欣快感[8,60～63]。Spanos等[64]利用快速掃描循環(huán)伏安法證明,乙酰膽堿和谷氨酸協同作用于腹側被蓋區(qū)中的多巴胺神經元,以調節(jié)腹側被蓋區(qū)、伏隔核的多巴胺能輸出。McGehee等[11,65]利用CHRNA7敲除大鼠和電生理技術證實,煙堿通過結合中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)腹側被蓋區(qū)α7nAChR,增強谷氨酸能輸入,促進谷氨酸釋放,同時,腹側被蓋區(qū)顯微注射谷氨酸受體拮抗劑DNQX可以可逆性地阻斷多巴胺神經元超極化所激發(fā)的電流,這證明谷氨酸對多巴胺能神經元具有激活作用,可誘導其興奮性的長時程增強,促進多巴胺的釋放。Stoker等[66]認為煙堿通過激活位于腹側被蓋區(qū)多巴胺能神經元突觸后的谷氨酸能神經元末端的α7nAChR,增加谷氨酸能傳遞,激活從腹側被蓋區(qū)到伏隔核的多巴胺能投射(圖2)。綜上可知,α7n-AChR主要通過谷氨酸能和多巴胺能的傳遞實現對多巴胺釋放的調控,進而影響煙堿成癮。

圖2 煙堿結合α7nAChR釋放谷氨酸進而調控多巴胺釋放的示意圖Fig.2 Schematic diagram showing nicotine binding to α7nAChR to release glutamic acid and then to regulate dopamine release

另外,對于α7nAChR在煙堿戒斷過程中的調控作用,Barik等[34]聚焦于α7nAChR對去甲腎上腺素的調控,認為α7nAChR通過對谷氨酸釋放的調控影響腎上腺素的水平,而腎上腺素的釋放與γ-氨基丁酸密切相關,γ-氨基丁酸作為一種抑制性神經遞質與煙堿戒斷密切相關。

3.2 α7nAChR參與神經突觸可塑性改變

煙堿慢性、反復作用將導致獎賞系統(tǒng)、學習記憶環(huán)路中一系列神經適應性變化,其中的重要機制是神經突觸可塑性改變[67]。煙堿成癮涉及煙堿所引發(fā)的突觸可塑性的細胞和分子水平的病理變化[68],形態(tài)表現為樹突分支和樹突棘密度的增加,功能上表現為突觸傳遞的長時程增強和長時程抑制等變化。有研究證實α7nAChR參與了神經突觸可塑性的改變。研究者利用免疫熒光染色和共聚焦顯微成像等手段發(fā)現,CHRNA7敲除小鼠海馬區(qū)的谷氨酸能神經元突觸減少,同時膜片鉗記錄也顯示谷氨酸能輸入減少,這說明α7nAChR可以引發(fā)谷氨酸能突觸可塑性變化,并在谷氨酸能神經元的形態(tài)和功能成熟中起著重要作用[69～70]。在此之前,有研究利用單細胞記錄法等手段證實,全身性的煙堿暴露通過α7nAChR增強突觸前和突觸后的谷氨酸功能,并引發(fā)谷氨酸能神經元的突觸可塑性變化[53,71]。此外,基于CHRNA7基因敲除小鼠的研究發(fā)現,CHRNA7缺失的小鼠在發(fā)育期間皮質N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體的表達和谷氨酸能神經元突觸的形成減少[48]。Morel等[72]利用體外電生理等手段也證實,α7nAChR激動劑和煙堿一樣都可以激活谷氨酸能神經元并使其產生可塑性變化。

α7nAChR在興奮性信號輸入中參與谷氨酸能神經元突觸可塑性變化的形成和對多巴胺能神經元的長時程增強作用,進而在學習和記憶控制中發(fā)揮作用,這也解釋了α7nAChR在線索誘導的成癮模型中的特有影響。

3.3 α7nAChR的作用隨煙堿暴露時間不同而顯現出差異

隨煙堿暴露時間的延長,α7nAChR對實驗動物行為的調控會發(fā)生變化。Levin等[73]在CHRNA7敲除小鼠的煙堿長期暴露研究中發(fā)現,α7nAChR在煙堿暴露全過程不同階段顯現出不同的作用,在煙堿暴露的最初幾周內,CHRNA7敲除小鼠與野生型對照小鼠沒有顯著差異,并不影響煙堿成癮模型的構建,但在之后的較長時間內,CHRNA7敲除小鼠的煙堿自主消耗急劇下降,而且在整個研究的5個月期間,CHRNA7敲除引起的煙堿消耗減少持續(xù)存在。該長期對照實驗提示,在煙堿暴露初期,下調α7nAChR功能并未影響煙堿成癮模型的構建和自主獲取煙堿的行為;但當煙堿暴露時間加長時,下調α7nAChR的功能則會對自主獲取煙堿行為產生負面影響。

另外,在煙堿急性暴露和長期暴露的條件下,α7nAChR對谷氨酸釋放的調節(jié)作用不同。通常,α7nAChR引起谷氨酸釋放[34,49～51],α7nAChR特異性激動劑PAM可以增加α7nAChR介導的谷氨酸釋放[74]。但是,急性煙堿暴露不會通過α7nAChR增加谷氨酸釋放量。Pons等[9]的實驗結果表明,CHRNA7敲除大鼠與對照組大鼠在煙堿急性暴露(8.7～52.6 μg/kg)下并無差異,煙堿不會使腹側被蓋區(qū)中谷氨酸能軸突上的α7nAChR脫敏,進而釋放多巴胺并改變多巴胺能神經元的放電模式。Ryu等[47]證實煙堿急性暴露不會引起細胞外谷氨酸濃度變化。在一項卷煙煙氣冷凝物暴露的動物實驗中,Ryu等[54]借助谷氨酸生物傳感器發(fā)現,長期煙堿暴露(1.0 mL·kg-1·d-1,sc)的大鼠相較于煙堿暴露1 d的大鼠,谷氨酸能神經元超敏化時間延長,背側紋狀體區(qū)域細胞外谷氨酸濃度顯著增加。這是基于α7nAChR對谷氨酸能神經元可塑性的影響,隨著煙堿暴露時間延長,α7nAChR對谷氨酸能神經元的影響逐漸加強,新的神經回路形成,故其對谷氨酸釋放量的調控也隨之變化。

隨著煙堿暴露時間的變化,α7nAChR對多巴胺的調控也會發(fā)生改變。Besson等[75]利用自身給藥系統(tǒng)和微透析等手段,在野生型和CHRNA7基因敲除大鼠的對比研究中發(fā)現,煙堿誘導的多巴胺釋放受α7nAChR調控,隨著暴露時間延長,細胞外多巴胺水平升高,而后逐漸降低。

綜上可知,在煙堿暴露的過程中煙堿的作用不斷加強,并通過α7nAChR影響谷氨酸能神經元的可塑性,逐漸構建α7nAChR通過谷氨酸介導釋放多巴胺的神經回路,因此α7nAChR對谷氨酸、多巴胺的調控會隨煙堿暴露時長的變化而調整,實驗動物在行為學上也會隨之表現出不同。

3.4 α7nAChR在多巴胺調控中的維穩(wěn)作用

α7nAChR在中樞神經中的表達量雖然很高,但是卻不是調控多巴胺釋放的唯一因素。Besson等[75]發(fā)現在缺乏α7nAChR的情況下,煙堿在腹側被蓋區(qū)內多巴胺能神經元的長時程增強作用減弱,但仍然存在。Liu等[76]也借助MLA的預處理和煙堿自身給藥模型(0.03 mg/kg)證明,在煙堿成癮構建階段主要是α4β2nAChRs而不是α7nAChR介導了煙堿的長時程增強作用。Parikh等[77]的研究發(fā)現,煙堿所誘發(fā)的膽堿能和谷氨酸能變化是瞬變的衰減而不是振幅衰減,α7nAChR對谷氨酸能和多巴胺能的調控是減緩其變化速率。Wickham等[78]通過在腹側被蓋區(qū)內微注射特異性拮抗劑MLA下調α7nAChR的功能,評估α7nAChR對多巴胺釋放的調控,結果證實α7nAChR調節(jié)伏隔核中多巴胺的階段性釋放,放緩多巴胺的釋放速度,避免多巴胺瞬時劇烈變化。Mameli-Engvall等[79]則認為,在中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)的煙堿和內源性乙酰膽堿所介導的多巴胺能神經元調節(jié)過程中,β2*nAChRs做直接性調節(jié),α7nAChR則更精細地調節(jié)這些神經元的反應。激活β2*nAChRs可將多巴胺能神經元從靜止狀態(tài)轉變?yōu)榧ぐl(fā)狀態(tài),而激活α7nAChR可以很好地調節(jié)激發(fā)狀態(tài)下多巴胺能神經元的狀態(tài),且這種調節(jié)只有當β2*n-AChRs激活多巴胺神經元之后才起作用。同時,當腹側被蓋區(qū)中的煙堿濃度顯著增加時,對煙堿具有低親和力的其他nAChRs可能被激活并補償α7nAChR 的缺乏[75]。Brunzell等[38]還發(fā)現,上調α7nAChR的功能對β2*nAChRs的功能產生負面影響。α7nAChR的功能上調可彌補其他nAChRs功能下調帶來的多巴胺釋放量不足,下調則可以減弱其他nAChRs功能上調引發(fā)的多巴胺過量釋放,進而使nAChRs的多巴胺總調控能力保持在一定的水平,因此敲除CHRNA7或使用α7nAChR特異性抑制劑等手段并不能阻礙煙堿成癮模型的構建。

α7nAChR在成癮過程中對多巴胺的調控作用主要是維持多巴胺釋放的穩(wěn)態(tài)[80]。α7nAChR的維穩(wěn)作用與其親和力低、脫敏速度慢等特點相關,也與其減緩多巴胺釋放速率的特性相關。由于α7nAChR對谷氨酸、多巴胺的調控作用隨煙堿暴露時間不同而不同,且其在成癮不同階段對多巴胺釋放起到維穩(wěn)作用[81],因此在成癮、戒斷等不同階段對α7nAChR實施調控,可能引發(fā)實驗動物行為學表征結果的差異。在煙堿成癮模型構建階段,為了維持多巴胺穩(wěn)態(tài),α7nAChR的表達量會上調,以控制多巴胺的釋放速度和釋放總量,減緩多巴胺大量且長時間釋放帶來的沖擊,因而在這個時候下調α7nAChR的功能,對煙堿成癮模型的構建并無負面影響,但是上調α7nAChR的功能卻無法成功構建煙堿成癮模型。隨著煙堿暴露時間延長,α7nAChR會影響谷氨酸能神經元的突觸可塑性,可以借由谷氨酸能傳遞興奮引發(fā)多巴胺能神經元興奮,使機體釋放大量多巴胺。在此時進行煙堿戒斷,α7nAChR為了維持體內穩(wěn)態(tài),會出現短暫性的上調,使機體釋放大量谷氨酸進而釋放大量多巴胺,彌補煙堿不足引發(fā)的多巴胺缺口,所以在戒斷階段下調α7nAChR的功能,避免了大量多巴胺釋放帶來的強烈興奮,因而無法完成重建。

3.5 α7nAChR與學習記憶環(huán)路密切相關

煙堿成癮涉及的神經環(huán)路與學習記憶環(huán)路密切相關,且有很大部分重疊。煙堿引發(fā)的突觸可塑性的細胞和分子水平的病理變化主要發(fā)生在獎賞和學習記憶的神經環(huán)路,如腹側被蓋區(qū)、伏隔核、前額葉皮層、海馬CA1腦區(qū)等[67～68]。

有證據顯示α7nAChR在學習記憶方面發(fā)揮著重要作用。Wright等[22]將α7nAChR特異性拮抗劑MLA(6.7 μg)顯微注射于大鼠的腹側海馬中以下調α7nAChR的功能,結果顯示,與正常大鼠相比,下調α7nAChR的功能致使大鼠無法完成阿片類藥物CPP的重建,提示α7nAChR在檢索并喚起藥物記憶中發(fā)揮特定作用。Zhou等[39]的研究顯示,不同程度的運動致使煙堿暴露(0.5 mg/kg)的大鼠α7nAChR的表達量不同,而實驗大鼠的兩項學習記憶行為評價范式Go/NoGo和MWM測試性能與α7nAChR表達量呈正相關,α7nAChR的高表達使實驗大鼠的學習記憶能力明顯提高。另外,Young等[82]通過對野生型和CHRNA7敲除小鼠實施對比訓練證實,煙堿成癮和學習記憶存在密切聯系,CHRNA7的缺失并不影響實驗小鼠對煙堿的獲取,也不影響空間記憶任務的完成,但是隨著任務難度的加大,CHRNA7敲除小鼠與野生型小鼠相比,如果要獲得相同的完成度則需要更久的時間。

大腦中藥物暴露引發(fā)的神經突觸可塑性變化使機體對藥物和環(huán)境產生異常聯系,當再次暴露于相關環(huán)境就會檢索并喚起相關記憶,然后產生強迫性的用藥和心里渴求[83]。Stoker等[66]認為,線索誘導的煙堿覓藥行為主要是因為α7nAChR引發(fā)的伏隔核中的谷氨酸能傳遞,伏隔核中的谷氨酸能傳遞不但參與煙堿引發(fā)的中腦邊緣神經回路的長時程增強,在恢復線索誘導的煙堿覓藥行為中也起到重要作用,所以當α7nAChR功能缺失時,即便相關環(huán)境線索再次出現,但是谷氨酸能傳遞受其影響無法被激活,環(huán)境線索的記憶也因此無法被喚起,重建無法完成。

煙堿成癮神經環(huán)路和學習記憶環(huán)路密切相關,當前越來越多的研究者把煙堿成癮研究的關注點放在成癮記憶的編碼、儲存和提取上。α7nAChR在學習記憶方面發(fā)揮著重要作用,通過影響谷氨酸能等神經元的可塑性變化,使實驗動物對煙堿和環(huán)境因素產生關聯,進而調控煙堿暴露下環(huán)境線索記憶的編碼、儲存和提取[36]。環(huán)境線索記憶作為成癮記憶的重要組成部分,在煙堿成癮的獲得、戒斷、重建等不同階段都有著重要影響。

4 總結與展望

煙堿暴露引發(fā)大腦中α7nAChR表達量的變化,而上調和下調兩種調控α7nAChR功能手段的實施也驗證了α7nAChR在煙堿成癮形成、消退、重建(包括線索誘導的重建)過程中起著重要作用。在煙堿成癮構建階段,基因敲除或者抑制劑等手段并不阻礙煙堿成癮模型的構建,而使用α7nAChR激動劑反而會對煙堿的自主消耗和成癮模型的構建產生負面影響。在煙堿戒斷階段,抑制α7nAChR會促進實驗動物成功戒斷,阻礙重建,而使用激動劑上調α7nAChR功能則對實驗動物的戒斷癥狀無明顯影響,這與成癮階段α7nAChR所行使的功能相反。另外,在煙堿暴露過程中,下調α7nAChR功能致使線索誘導的煙堿尋求失敗,證實了α7nAChR在煙堿暴露中的調控與環(huán)境線索密切相關。再有,α7nAChR在煙堿暴露過程中的調控隨時間發(fā)生變化,這種變化依賴于α7nAChR對谷氨酸能神經元可塑性的影響,α7nAChR引發(fā)谷氨酸的釋放進而引發(fā)多巴胺的大量釋放,引起興奮,最終達到維持多巴胺穩(wěn)態(tài)的作用效果。

α7nAChR作為大腦中廣泛存在的乙酰膽堿受體之一,由于受其親和力低的說法所限,其機制研究尚不充分,研究手段也很局限。當前,對于α7nAChR上游調控機制的研究更偏向于基因敲除等手段,首先基因敲除的精準調控程度和無損程度較差,其次轉基因動物模型構建耗費時間長。另外,目前針對α7nAChR的RNA層面的調控研究還較少,隨著基因編輯和光遺傳等新興技術的興起與完善,研究層面從DNA調控轉變?yōu)镽NA調控或許對α7nAChR的深入研究更為有利。對于其下游調控機制的研究,目前更多的還是關注神經環(huán)路的探索及其對神經遞質釋放的影響,雖然國內外研究對于這些領域的探索還在不斷深入中,但是其已知功能機制的解釋還不夠明確,未知的功能和作用仍待挖掘。其中,α7nAChR對多巴胺的維穩(wěn)作用及其作用下神經回路的逐漸構建過程的神經生物學機制還不夠詳盡?，F有研究顯示,α7nAChR在線索誘導的煙堿尋求恢復中發(fā)揮重要作用,但其中詳細機理仍未闡明。α7nAChR發(fā)揮作用的核團和神經環(huán)路也尚未完全揭示,如對藥物成癮也具有重要意義的韁核、與記憶儲存喚起密切相關的海馬,且α7nAChR在煙堿戒斷階段的神經生物學機制是否與“戒斷因子”促腎上腺皮質激素釋放因子或γ-氨基丁酸和5-羥色胺等抑制性神經遞質相關還有待探索。同時,同源五聚體α7nAChR有5個功能性激動劑結合位點,通常需要兩個激動劑(乙酰膽堿、煙堿等激動劑)占用結合位點才能實現通道開放,獨特結構和子通道的脫敏或重新敏化速率所帶來的與其他乙酰膽堿受體功能上的不同仍有待挖掘。并且,α7nAChR的功能可以被其他乙酰膽堿受體所代償的具體機制也有待探索。最后,α7nAChR已知與多種復雜行為如學習、成癮、記憶密切相關,其功能、機制間如何相互影響也有待進一步探索。