劉現(xiàn)穩(wěn),朱 舟,劉成龍,張立群,韋韓忠,唐 維

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

獼猴桃富含多種氨基酸、礦質(zhì)元素,營養(yǎng)豐富、風味獨特,被譽為“水果之王”[1]。獼猴桃大多屬于雌雄異株植物,不同品種獼猴桃的開花時間變異較大。開花時間的差異對獼猴桃生產(chǎn)、獼猴桃屬物種分化有著重要的影響。植物開花時期的差異一直是研究的熱點。獼猴桃開花時間調(diào)控的分子機制依然模糊。因此深入研究獼猴桃開花相關基因的功能以及分子調(diào)控機制有重要的生物學意義。

對模式植物擬南芥開花時間的研究表明:春化作用、溫度、赤霉素、自主途徑、光周期途徑相互作用共同控制開花[2]。在植物開花調(diào)控網(wǎng)絡中,LEAFY(LFY)基因是開花信號途徑中的最關鍵整合子,在花原基起始的早期表達,并激活花分生組織特征基因和花器官形態(tài)特征基因APETALA1(AP1)和CAULIFLOWER(CAL)的表達,從而決定了原基的花分生組織屬性。LFY基因不僅是植物成花途徑中的關鍵調(diào)控基因,而且是激活下游花分生組織屬性基因和花器官決定基因的關鍵調(diào)控因子[3]。

LFY基因結(jié)構(gòu)相對簡單,在進化過程中比較保守,都含有3個外顯子和2個內(nèi)含子,且內(nèi)含子的位置極為保守。LFY的同源基因編碼的氨基酸序列中一般具有5’端脯氨酸富集區(qū)、中央酸性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。擬南芥中LFY還含有與DNA結(jié)合的鋅指結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)表明LFY基因具有轉(zhuǎn)錄因子的特征[4]。在許多有花和無花植物中LFY同源基因已經(jīng)被分離克隆,功能研究表明其在植物生殖、生長過程中發(fā)揮重要作用[5]。但是在獼猴桃中LFY同源基因的研究并不多。

本文以毛花獼猴桃‘華特’為實驗材料,從花芽組織中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。將擬南芥LFY基因在‘紅陽’獼猴桃基因組數(shù)據(jù)庫[6-7](http://bioinfo.bti.cornell.edu/cgi-bin/kiwi/home.cgi)中進行比對,得到了獼猴桃的LFY基因同源序列,并以‘華特’獼猴桃cDNA為模板,用特異性引物擴增出目的基因,命名為AeLFY-like1。測序結(jié)果表明AeLFY-like1基因序列全長2 432 bp,有3個外顯子與2個內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個氨基酸。3個外顯子長度分別為379、353、363 bp,2個內(nèi)含子長度分別為420、917 bp。毛花獼猴桃LFY-like蛋白與中華獼猴桃LFY-like蛋白有99.73%同源性,僅有部分SNP的差異。其基因結(jié)構(gòu)與許多已克隆的大部分植物的LFY基因結(jié)構(gòu)相似,顯示出LFY基因的序列結(jié)構(gòu)在不同物種間進化上的保守性[8]。本研究通過克隆毛花獼猴桃LFY同源基因,為從分子水平上了解獼猴桃成花機理提供了理論基礎,同時為獼猴桃的物種分化、進化研究提供序列信息。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 載體、菌株和植物材料

克隆載體pEASY-Blunt Simple Cloning Vector購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物表達載體pART27-MCS-GFP(帶有CaMV35S植物組成型啟動子和GFP標簽蛋白)由本實驗室保存;大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV2260由實驗室保存;煙草(Nicotianabenthamiana)、毛花獼猴桃(ActinidiaerianthaBenth.)植株種植于合肥工業(yè)大學屯溪路校區(qū)人工氣候培養(yǎng)室。

1.1.2 實驗試劑

Pfu高保真DNA聚合酶購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;植物RNA提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于愛必夢生物科技有限公司;實時熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購于TaKaRa公司;引物設計采用Primmer Premmier5.0軟件,由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成;實驗樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 序列分析及氨基酸序列同源性分析

運用 NCBI的BLAST在線軟件程序?qū)y序結(jié)果進行檢索;用NCBI數(shù)據(jù)庫BLASTP在線比對、查找AeLFY蛋白序列的同源蛋白序列,并應用DNAMAN軟件進行多序列同源性比對分析。用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.2 ‘華特’獼猴桃AeLFY-like1基因克隆

使用植物RNA提取試劑盒從‘華特’獼猴桃花芽材料中提取總RNA,取1 μg總RNA為模板,利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA?！A特’AeLFY-like1基因序列特異性引物AeLFY-like1 F/R見表1所列,用于對其編碼區(qū)進行PCR擴增,并分別引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、純化,然后與pEASY-Blunt Simple Cloning Vector克隆載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑取單克隆培養(yǎng)后進行菌落PCR鑒定,將陽性克隆送測序。

1.2.3AeLFY-like1-GFP表達載體的構(gòu)建

將上述測序陽性克隆提取質(zhì)粒分別進行雙酶切。酶切片斷進行膠回收,然后與雙酶切回收的pART27-MCS-GFP表達載體片斷進行連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化,并進行菌落PCR鑒定,質(zhì)粒酶切鑒定后進行測序驗證。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV2260,獲得陽性克隆后,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因煙草瞬時表達與亞細胞定位

本文采用農(nóng)桿菌介導的瞬時表達方法。將帶有構(gòu)建正確的AeLFY-like1-GFP表達載體的農(nóng)桿菌在含有利福平(Rif)和壯觀霉素(Spec)的LB培養(yǎng)板28 ℃培養(yǎng)2 d,挑取單克隆于2 mL LB/Rif/Spec培養(yǎng)液中,28 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng)。吸取300 μL菌液于2.7 mL LB/Rif/Spec培養(yǎng)液中,28 ℃培養(yǎng)5 h。然后將菌液4 000 r/min離心6 min后重懸于3 mL誘導緩沖液Ⅰ(IM培養(yǎng)液、200 mmol/L乙酰丁香酮、25 mg/mL壯觀霉素)中,28 ℃培養(yǎng)5～8 h。將菌液4 000 r/min離心6 min收集細胞,以2 mL誘導緩沖液Ⅱ(50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸、蒸餾水、200 mmol/L乙酰丁香酮)重懸細胞,測定、調(diào)節(jié)OD600=0.5,注射于4周左右大小煙草植株的葉片中。36 h后即可撕取注射區(qū)域葉片的表皮細胞,經(jīng)4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察,并確定AeLFY-like1蛋白在細胞中的定位。

1.2.5 實時熒光定量PCR

采集毛華獼猴桃根、莖、葉、成花、花芽材料,分別提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,獼猴桃肌動蛋白(actin)基因作為內(nèi)參,進行實時熒光定量PCR分析。該反應在Bio-Rad實時熒光定量PCR儀上進行。實時熒光定量PCR總體系含cDNA 30 ng、SYBR ? Green PCR Master 5.0 μL、定量引物AeLFYqF/R各 0.2 μL,序列信息見表1所列,用 ddH2O補足到 10.0 μL。反應程序為 95 ℃ 10 min,95 ℃15 s,60 ℃ 1 min,39個循環(huán)。PCR擴增結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及溶解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛花獼猴桃LFY同源基因的克隆

使用毛花獼猴桃花芽組織材料提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板,使用特異性引物擴增得到獼猴桃LFY同源基因如圖1所示,擴增條帶約1 100 bp,實際測序結(jié)果顯示AeLFY-like1基因為1 095 bp。電泳結(jié)果與目的片段大小一致。圖1中,M為DNA Marker;L1為陰性對照;L2為目的片段。

2.2 毛花獼猴桃AeLFY-like1基因結(jié)構(gòu)分析

AeLFY-like1基因序列全長2 432 bp,有3個外顯子與2個內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個氨基酸。基因結(jié)構(gòu)如圖2所示,3個外顯子長度分別為379、353、363 bp,2個內(nèi)含子長度分別為420、917 bp。

AeLFY-like1基因編碼的氨基酸序列也具有5’端脯氨酸富集區(qū)、中央酸性區(qū)和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域,這些功能結(jié)構(gòu)域與其轉(zhuǎn)錄因子功能相對應。獼猴桃LFY基因結(jié)構(gòu)與大部分植物基因結(jié)構(gòu)一致,顯示出其在不同物種進化過程中的保守性。

2.3 AeLFY-like1基因的系統(tǒng)進化樹分析

將AeLFY-like1基因編碼的氨基酸序列與多種植物的LFY蛋白同源序列進行比對,運用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,進化樹信息如圖3所示。圖3中,Ae為毛花獼猴桃;Ac為中華獼猴桃;Cs為野茶樹;Cc為山核桃;Ps為豌豆;Gs為野生大豆;Gm為大豆;Sl為番茄;Nt為煙草;Lc為荔枝;Pc為黃連木;Vv為葡萄;At為擬南芥;Os為水稻;Zm為玉米;分支點的數(shù)字為Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節(jié)點可信度的百分比;標尺代表每一位點氨基酸替換率。毛花獼猴桃和中華獼猴桃這2個獼猴桃品種的LFY同源蛋白序列以100%的支持率聚在同一枝上,表明在不同品種獼猴桃中,LFY基因高度保守。

獼猴桃科與茶科都屬于五椏果亞綱、杜鵑花目。由圖3可知,獼猴桃與茶樹同源性為95%,而與單子葉植物植物水稻、玉米親緣關系較遠。該結(jié)果與傳統(tǒng)分類學結(jié)果一致。在該系統(tǒng)進化樹中,傳統(tǒng)分類學上親緣關系較近物種都聚集在一起。預測在分類學研究中,LFY蛋白是一個可以利用的分子標記。

2.4 AeLFY-like1基因組織差異性分析

采集毛花獼猴桃的根、莖、葉、成花和花芽組織作為樣品材料,提取總RNA,以獼猴桃肌動蛋白(actin)基因作為內(nèi)參,通過實時熒光定量PCR分析不同組織的AeLFY-like1基因的表達水平,如圖4所示。

組織圖4 AeLFY-like1基因在毛花獼猴桃不同組織和器官中的表達

由圖4可知,qRT-PCR結(jié)果表明AeLFY-like1基因在毛花獼猴桃不同組織和器官中表達量有明顯差異。AeLFY-like1基因主要在早期花芽組織中大量表達,而在成花中表達量很低,其表達量與葉片組織中相近。在根與莖中AeLFY-like1基因基本不表達。推測在花芽發(fā)育過程中,AeLFY-like1基因的表達量逐漸減少,在發(fā)育到成花階段時,AeLFY-like1基因表達量已經(jīng)下降到較低的水平。符合LFY同源基因在花原基起始的早期表達的特征。AeLFY-like1基因在促進獼猴桃由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)向生殖生長階段、花序分化以及起始花器官發(fā)育發(fā)揮重要作用。

2.5 AeLFY-like1基因的亞細胞定位

本文將帶有AeLFY-like1-GFP表達載體的農(nóng)桿菌經(jīng)擴大培養(yǎng)、誘導后注射煙草葉片,36 h后撕取煙草葉片表皮細胞,經(jīng)DAPI染料染色、制片,在激光共聚焦顯微鏡下觀察,檢測GFP與DAPI熒光信號,進行AeLFY-like1基因的亞細胞定位,其結(jié)果如圖5所示。圖5a為明場下觀察到的煙草表皮細胞的細胞結(jié)構(gòu);圖5b為488 nm激發(fā)波長下GFP發(fā)射出的綠色熒光;圖5c為358 nm激發(fā)波長下DAPI發(fā)射出的藍色熒光;圖5d為Merge圖像,可以觀察到綠色熒光與藍色熒光的重疊。

圖5 AeLFY-like1基因亞細胞定位

從圖5可以看出,AeLFY-GFP融合蛋白定位在細胞核中,推測出AeLFY蛋白可作為轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中調(diào)控相關基因的表達進而促進植物開花。

3 結(jié) 論

本研究通過同源序列比對分析從毛花獼猴桃‘華特’基因組中克隆出LFY同源基因,命名為AeLFY-like1。基因序列全長為2 432 bp,有3個外顯子和2個內(nèi)含子,含有1 095 bp的完整的編碼框,編碼364個氨基酸,與中華獼猴桃LFY蛋白同源性達到99.73%。同源性分析表明毛花獼猴桃的AeLFY-like1基因與其他植物LFY基因在核酸和蛋白質(zhì)水平上十分相似,在N端和C端都含有高度保守的區(qū)域。進化樹分析發(fā)現(xiàn)獼猴桃LFY基因與茶科植物親緣關系最近,與單子葉植物水稻、玉米等親緣關系較遠。但親緣關系較遠物種間LFY基因編碼的蛋白質(zhì)也具有較高的同源性,表明其在不同物種中具有相似的結(jié)構(gòu)和功能[9]。

亞細胞定位顯示AeLFY-like1表達產(chǎn)物定位在細胞核,與LFY基因家族的轉(zhuǎn)錄因子功能、亞細胞定位特征相一致。推測其在獼猴桃開花調(diào)控中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能,調(diào)控開花調(diào)控網(wǎng)絡中相關基因的表達,進而促進獼猴桃植株開花。

組織差異性分析表明AeLFY-like1基因在花芽組織中的表達量最高。LFY基因家族在花原基起始早期表達,是植物開花調(diào)控網(wǎng)絡中的早期基因。AeLFY-like1基因在促進獼猴桃由營養(yǎng)生長階段轉(zhuǎn)向生殖生長階段、花序分化以及起始花器官發(fā)育發(fā)揮重要作用[10-11]。獼猴桃AeLFY-like1基因誘導植物成花過程以及調(diào)控植物開花時間的分子機理還需要進一步的實驗。

本研究通過克隆毛花獼猴桃的LFY同源基因,分析了基因特征與同源性關系,初步鑒定了基因的功能,為獼猴桃的系統(tǒng)進化研究、發(fā)育分析提供了一定的理論依據(jù)。