黃俊花，段華，汪沙

子宮腺肌病(adenomyosis，ADS)是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)細(xì)胞向肌層良性浸潤的激素依賴性疾病，主要癥狀包括進(jìn)行性加重的痛經(jīng)、異常子宮出血和不孕。由于近年來該病發(fā)病年齡提前，極大影響患者生活質(zhì)量，保守治療方法有限，因此從發(fā)病機(jī)制入手，探索其他新型治療方法成為又一研究問題[1]。let-7a是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與RNA結(jié)合蛋白的3＇非編碼端互補(bǔ)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)，影響細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡等功能。近年來隨著對(duì)let-7a的深入研究發(fā)現(xiàn)，其在很多增殖性疾病中影響基因的表達(dá)，并且在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病中也發(fā)揮作用[2]。由于子宮內(nèi)膜異位癥和ADS在病因上存在相似之處，因此推測(cè)let-7a可能也參與ADS的發(fā)病。另外由于子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)(endometrial-myometrial interface，EMI)平滑肌細(xì)胞的異常增殖和凋亡導(dǎo)致EMI收縮紊亂，患者月經(jīng)期子宮內(nèi)壓升高，血管不能有效關(guān)閉進(jìn)而出現(xiàn)痛經(jīng)、經(jīng)量增多、經(jīng)期延長等癥狀[3]，所以let-7a在EMI平滑肌細(xì)胞中可能存在異常表達(dá)。本研究檢測(cè)了let-7a在ADS EMI平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)并探討其表達(dá)與患者痛經(jīng)程度是否相關(guān)。

1 資料來源

1.1 研究對(duì)象

選取2018年10月至2019年12月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心收治的因ADS行子宮全切除術(shù)的患者25例(ADS組)，患者平均年齡為(47.5±2.2)歲，所有患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為ADS。收集同期因子宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ 要求行子宮全切除術(shù)者22例作為對(duì)照組，患者平均年齡為(45.3±2.7)歲。兩組患者均月經(jīng)周期規(guī)律，未合并子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜息肉，術(shù)前未行性激素類藥物治療，無內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，術(shù)前患者均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料的收集

術(shù)前對(duì)所有患者的痛經(jīng)程度進(jìn)行視覺模擬評(píng)分(visual analogue scale，VAS)[4]，其中0分：無痛；1～3分：有輕微疼痛，能忍受；4～6分：疼痛影響睡眠，尚能忍受；7～10分：漸強(qiáng)烈的疼痛，疼痛難忍，影響食欲及睡眠。將ADS組25例患者根據(jù)VAS評(píng)分分為：無～輕度痛經(jīng)(VAS 0～3分)，4例；中度痛經(jīng)(VAS 4～6分)，7例；重度痛經(jīng)(VAS 7～10分)，14例。對(duì)照組22例患者均為無～輕度痛經(jīng)(VAS 0～3分)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織取材 無菌操作下，將術(shù)中切下的子宮行“Y”字形剖開，依據(jù)本課題組的前期研究方法[5]，于子宮體前壁靠近宮底處切取子宮內(nèi)膜下厚約0.5 cm的EMI平滑肌組織2塊，約1.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小，立即置于冷D-Hank液(不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液，內(nèi)含青霉素1 000 U/mL，鏈霉素1 000 U/mL)中，按本課題組改良的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行EMI平滑肌細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng)[6]。

1.3.2 主要試劑與儀器 DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清(foetal bovine serum，F(xiàn)BS)、PBS、膠原酶和DNA酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品，4%多聚甲醛固定液、免疫染色通透液、抗熒光衰減封片劑(含DAPI)均來自中國碧云天公司，兔抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白一抗和羊抗兔IgG二抗均來自英國Abcam公司，RNAiso Plus、microRNA first-strand synthesis kit和microRNA qRT-PCR TB Green Kit均為日本Takara公司產(chǎn)品，Applied Biosystems 7500熒光定量PCR儀來自美國ABI公司，免疫熒光顯微鏡來自德國Leica公司。

1.3.3 子宮內(nèi)膜肌層交界區(qū)平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將超凈臺(tái)紫外消毒30 min，所需液體室溫平衡預(yù)溫。將獲得的EMI平滑肌組織剪碎成糊狀(<1 mm)，加入適量消化液(含I型或II型膠原酶0.002 g/mL及DNA酶0.0002 g/mL)放在空氣搖床上于37℃條件下低速震蕩消化4～5 h，加入等體積無血清DMEM培養(yǎng)基，終止消化。經(jīng)100 μm篩網(wǎng)過濾，1 200 g離心10 min，棄去上清，加入DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次1 200 g離心10 min后將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待90%～95%細(xì)胞融合，消化傳代。子代細(xì)胞經(jīng)免疫熒光鑒定為平滑肌細(xì)胞。

1.3.4 免疫熒光鑒定平滑肌細(xì)胞 將穩(wěn)定傳代至第3代的對(duì)數(shù)生長期平滑肌細(xì)胞按每孔1×105個(gè)/mL接種于6孔板上，鋪有無菌蓋玻片，生長至70%融合度。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗1～2次。室溫下，用4%的多聚甲醛(4℃預(yù)冷)固定爬片15～20 min，棄去多聚甲醛，用PBS清洗3次。室溫下，用1%免疫染色通透液穿孔30 min后，用PBS清洗3次。然后用5% BSA封閉60 min，棄去封閉液，加入兔抗人α平滑肌肌動(dòng)蛋白一抗封閉液，4℃濕盒過夜。第2 d在室溫下將細(xì)胞復(fù)溫30 min，用PBS清洗3遍。吸干爬片上多余液體，加入羊抗兔熒光二抗，濕盒中室溫避光孵育1 h，PBS清洗3次，吸掉熒光二抗，將爬片夾出，放在載玻片上，滴加含DAPI、抗熒光淬滅劑作用10 min然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3.5 RT-qPCR檢測(cè)let-7a的表達(dá) 使用RNAiso Plus提取總RNA，根據(jù)microRNA first-strand synthesis kit和microRNA qRT-PCR TB Green Kit試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增。檢索美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站，查找靶基因cDNA的全序列；根據(jù)靶基因cDNA的全序列由Prime Express軟件設(shè)計(jì)引物，并與BLAST數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)果良好的引物用于本研究，由上海生工生物工程股份有限公司合成。let-7a的引物序列為5′-CCGCGCGCGCTATACAATCTACTGTCT-3′，以U6作為內(nèi)對(duì)照，其引物序列上游為5′- AACGAGACGACGACA GAC-3′，下游為5′-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。應(yīng)用ABI7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算目的基因的表達(dá)水平，其中Ct為循環(huán)閾值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 子宮腺肌病內(nèi)膜肌層交界區(qū)平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

子宮平滑肌細(xì)胞接種 24 h后大部分貼壁，細(xì)胞呈長梭形、反射狀或旋渦狀排列，成束的細(xì)胞平行排列，細(xì)胞可單層生長，也可層疊排列呈典型“峰谷”狀生長(圖1A見彩插2)。抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體主要表達(dá)于平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)免疫熒光標(biāo)記后在熒光顯微鏡下發(fā)綠光(圖1B見彩插2)。

2.2 let-7a在子宮腺肌病內(nèi)膜肌層交界區(qū)平滑肌細(xì)胞中低表達(dá)

RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADS組子宮EMI平滑肌細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)量低于對(duì)照組(t=10.10，P<0.001)，詳見圖2。

圖2 兩組let-7a表達(dá)水平比較(****P<0.001)

2.3 let-7a的表達(dá)與痛經(jīng)的相關(guān)性

對(duì)照組與ADS不同痛經(jīng)程度亞組let-7a相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=38.25，P<0.001)，詳見圖3。進(jìn)一步在ADS組中進(jìn)行VAS評(píng)分與let-7a相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，VAS評(píng)分增高時(shí)ADS組子宮EMI平滑肌細(xì)胞中l(wèi)et-7a表達(dá)量降低，二者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9296，P<0.001)，詳見圖4。

圖3 對(duì)照組及ADS不同痛經(jīng)程度亞組let-7a表達(dá)水平比較

圖4 ADS組VAS評(píng)分與let-7a表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討論

3.1 let-7a表達(dá)降低與疾病的關(guān)系

本研究檢測(cè)了ADS患者EMI平滑肌細(xì)胞中l(wèi)et-7a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)低于對(duì)照組。ADS雖然是常見的婦科疾病，但闡明其發(fā)病機(jī)制仍是一個(gè)難題，目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制主要有兩大理論：“內(nèi)陷”和“化生”[7]，其中“內(nèi)陷”理論來源于組織的損傷與修復(fù)[8]，而EMI的損傷與修復(fù)又成為了解釋許多臨床癥狀的主要原因。EMI的正常結(jié)構(gòu)被破壞，平滑肌細(xì)胞異常增殖和凋亡使子宮收縮節(jié)律發(fā)生改變，同時(shí)由于組織缺氧，誘發(fā)一系列分子改變[1]。近幾年隨著表觀遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究深入，發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也不容忽視。MicroRNA是一類非編碼小分子RNA(19～22個(gè)核苷酸)，通過與靶mRNA的3＇非編碼區(qū)結(jié)合，抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA降解，在調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，MicroRNA通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化，從而在調(diào)控癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Let-7a是MicroRNA let-7家族中的一員，其保守性較高，在多種疾病的組織或細(xì)胞中表達(dá)異常并調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與凋亡，如胰腺癌、鼻咽癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，其可作為抑癌因子影響癌細(xì)胞的增殖[9]。另外子宮內(nèi)膜異位癥中也發(fā)現(xiàn)let-7家族表達(dá)異常[10]。

本研究結(jié)果證實(shí)了let-7a在ADS的EMI平滑肌細(xì)胞中也存在表達(dá)降低，提示let-7a可能通過調(diào)節(jié)ADS的EMI平滑肌細(xì)胞活動(dòng)，從而影響子宮的收縮節(jié)律、血管的舒縮以及受精卵著床，進(jìn)而出現(xiàn)不同程度的痛經(jīng)、月經(jīng)異常及不孕等臨床癥狀。

3.2 let-7a可能影響痛經(jīng)程度

進(jìn)行性痛經(jīng)是ADS患者的典型臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，成為很多患者選擇子宮切除術(shù)的重要原因。目前關(guān)于ADS疼痛的機(jī)制研究包括：病灶局部前列腺素水平增高，縮宮素受體表達(dá)異常，炎性因子、致痛因子異常分泌，子宮內(nèi)膜異位病灶機(jī)械性牽拉，神經(jīng)纖維損傷再生及分布異常等。

主要由于EMI的組織損傷造成局部炎癥反應(yīng)，IL-1β表達(dá)升高，從而誘發(fā)環(huán)氧化酶2(cox-2)產(chǎn)生前列腺素E2，進(jìn)一步上調(diào)芳香化酶P450。過表達(dá)的芳香化酶與上調(diào)的類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)相結(jié)合，產(chǎn)生更多的雌二醇，使得雌激素受體過表達(dá)。雌激素受體影響縮宮素及縮宮素受體的表達(dá)，在ADS肌層中過表達(dá)的縮宮素受體結(jié)合子宮活躍亢進(jìn)引起不同程度的痛經(jīng)[11]。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-24可以調(diào)節(jié)縮宮素的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平[12]，這說明microRNA可能與ADS的痛經(jīng)存在關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)ADS的EMI平滑肌細(xì)胞中存在let-7a低表達(dá)，并且VAS評(píng)分增加時(shí)，其表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，二者呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果進(jìn)一步說明了microRNA可能與ADS的痛經(jīng)程度相關(guān)，并且let-7a可能從表觀遺傳學(xué)的角度影響ADS的發(fā)病。

本研究從表達(dá)層面入手，初步探索了let-7a在ADS的EMI平滑肌細(xì)胞中的作用，為后續(xù)ADS的研究提供方向。進(jìn)一步的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)及其中的因果關(guān)系將成為今后研究的重點(diǎn)。