蘇學(xué)軍，陳 東，裘 可，范文赟

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

前 言

殘存于食品中的亞硝酸鹽會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，在胃液酸性環(huán)境中很適宜與仲胺類(lèi)物質(zhì)作用生成致癌性強(qiáng)的N-亞硝基化合物[1]。降低反應(yīng)底物亞硝酸鹽的濃度可以抑制亞硝化反應(yīng)的發(fā)生，起到有效預(yù)防癌癥的效果。一些合成類(lèi)的抗氧化劑（焦亞硫酸鈉、異抗壞血酸鈉、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚等）具有良好的亞硝酸鹽清除能力，可通過(guò)降解、歧化途徑，降低肉制品中亞硝酸鹽的殘留，阻斷亞硝胺的合成[2,3]。但這些外源性抗氧劑大多無(wú)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且有潛在的毒副作用，實(shí)際使用中會(huì)受到一定的限制，人們更傾向于添加安全性高、功能性強(qiáng)的天然植物源抗氧化劑。它們一般具有特殊的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)，成分復(fù)雜，種類(lèi)包括多酚、生物堿、皂甙類(lèi)等[4]，其中一些因抗氧化活性強(qiáng)，且對(duì)亞硝酸鹽的清除作用表現(xiàn)不俗[5～7]，而使其成為膳食健康領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

吳茱萸是一種常見(jiàn)的大宗藥材，系蕓香科植物，又名吳萸、淡茱萸、米辣子等[8]，主要分布于湖南、貴州、陜西等地。吳茱萸中含有豐富的生物堿、揮發(fā)油、黃酮等成分，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗炎鎮(zhèn)疼、強(qiáng)心護(hù)肝等功效[9,10]。近年來(lái)，對(duì)吳茱萸的報(bào)道多集中在活性成分的提取及抗氧化活性方面，而有關(guān)其清除亞硝酸鹽能力的研究則報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲浸提工藝制備吳茱萸提取液，研究不同條件下提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除作用，以期為人們能深入了解吳茱萸的保健功能提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 原料與試劑

吳茱萸：泰州市國(guó)泰大藥房；無(wú)水乙醇、抗壞血酸、亞硝酸鈉、鹽酸、丙酮、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；80-2離心機(jī)，上海物理光學(xué)儀器廠；KQ5200E超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BJ-150多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；LRH-250F型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

亞硝酸鈉在弱酸條件下與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色絡(luò)合物，在538nm處有最大吸收，可用分光光度法測(cè)定吸光度，確定其濃度，因亞硝酸鈉濃度與吸光度值成良好的線性關(guān)系，所以本實(shí)驗(yàn)以亞硝酸鈉為對(duì)照，直接以其吸光度作為考查指標(biāo)計(jì)算清除率。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 吳茱萸提取液的制備

取吳茱萸適量于65℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎，過(guò)40目篩。稱(chēng)取3g粉末置于具塞錐形瓶中，加入60mL提取劑，浸泡0.5h，然后于50℃條件下超聲波輔助提取30min。室溫冷卻，3000r/min離心分離10min，收集上清液于棕色容量瓶中，冷藏備用。

1.3.2 清除率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]并略加修改。取25mL具塞比色管，加入1mL吳茱萸提取液，再加入5.0μg/mLNaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL，搖勻，然后置于50℃水浴中反應(yīng)20min，取出后加入2mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸，搖勻靜置，5min后立刻加入1mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，搖勻，定容，靜置15min，離心分離取適量上清液經(jīng)針式微孔濾膜過(guò)濾后于538nm處測(cè)定吸光度，按下式計(jì)算吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率。

式中：A0為未加入提取液時(shí)的吸光度（以試劑空白作參比）；A1為加入提取液后的吸光度（以提取液為參比溶液）

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取劑對(duì)清除率的影響

稱(chēng)取3g吳茱萸粉末，分別置于8個(gè)錐形瓶中，依次加入蒸餾水、丙酮及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（30%、40%、50%、60%、70%、80%）各60mL，按1.3.1制備提取液，再按1.3.2中方法反應(yīng)并測(cè)定清除率，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同提取劑對(duì)清除率的影響Fig.1 The effect of different extractants on the scavenging rate

由圖1可見(jiàn)，選用不同提取劑制備的吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽均有一定的清除作用，但清除程度不同，其中丙酮作提取劑時(shí)的清除作用最弱。選用乙醇作提取劑，清除作用隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而逐漸增強(qiáng)，至60%時(shí)清除率達(dá)到最大。其后再增大乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，清除率反而降低。研究表明[8]，吳茱萸中含黃酮、生物堿、兒茶酚、綠原酸等多種可清除亞硝酸鹽的活性成分，因各種提取劑的極性不同，得到的提取液中活性組分含量及組成存在差異，從而表現(xiàn)出不同的亞硝酸鹽清除能力。選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取劑的清除效果最好。

2.2 吳茱萸提取液的用量對(duì)清除率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取3g吳茱萸粉末，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液60mL，按1.3.1制備提取液。分別吸取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8mL提取液，再按1.3.2中方法反應(yīng)并測(cè)定清除率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取液的用量對(duì)清除率的影響Fig.2 The effect of the amount of extract on the scavenging rate

由圖2可見(jiàn)，在一定體積范圍內(nèi)，隨著吳茱萸提取液用量的增多，對(duì)亞硝酸鹽的清除作用也不斷增強(qiáng)，清除率呈快速上升趨勢(shì)。但當(dāng)提取液的用量達(dá)到2mL時(shí)，其后用量的增多對(duì)清除率的貢獻(xiàn)度較小，考慮到成本則提取液用量選擇2mL即可。

2.3 反應(yīng)溫度對(duì)清除率的影響

移取吳茱萸提取液2mL（60%的乙醇作提取劑），再加入5.0μg/mLNaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL，選用不同水浴溫度（30、40、50、60、70、80℃），按1.3.2中方法反應(yīng)并測(cè)定清除率，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)清除率的影響Fig.3 The effect of reaction temperature on the scavenging rate

由圖3可見(jiàn)，吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率隨反應(yīng)溫度的升高而不斷增大，當(dāng)反應(yīng)溫度到達(dá)60℃時(shí)，清除率已達(dá)到相對(duì)高值。進(jìn)一步升高反應(yīng)溫度，清除率值略有降低。這可能是由于過(guò)高的反應(yīng)溫度使得吳茱萸提取液中一些活性組分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響到亞硝酸鹽的清除效果。

2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除率的影響

移取吳茱萸提取液2mL（60%的乙醇作提取劑），再加入5.0μg/mLNaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液2mL，于60℃水浴反應(yīng)一定時(shí)間（5、10、15、20、25、30min），按1.3.2中方法測(cè)定清除率，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除率的影響Fig.4 The effect of reaction time on the scavenging rate

由圖4可見(jiàn)，吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除作用隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而快速上升，反應(yīng)到25min時(shí)，清除率可達(dá)97.12%，其后延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，清除率的變化趨于平緩，表明提取液與亞硝酸鹽的清除反應(yīng)已達(dá)到相對(duì)飽和的狀態(tài)。

3結(jié)論

隨著人們對(duì)“組分天然化、功能多樣化”的食品添加劑的呼聲越來(lái)越高，天然植物源食品抗氧化劑有望成為替代人工合成的抗氧化劑的良好來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)表明，不同的提取劑制得的吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除能力存在一定差異，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液作提取劑的清除效果最好。提取液的用量與清除效果在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，反應(yīng)溫度對(duì)清除率的影響顯著，60℃時(shí)清除反應(yīng)速率較快，能在25min時(shí)達(dá)到平衡，此時(shí)2mL的提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除率可達(dá)97.12%。吳茱萸提取液對(duì)亞硝酸鹽的清除表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性，其清除率高，清除速率較快，是一種值得開(kāi)發(fā)的天然亞硝酸鹽清除劑。