包文君，李子富，王雪梅，3，高瑞嶺，程世昆，門(mén)玉

（1北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083；2北京市工業(yè)典型污染物資源化處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3北京科技大學(xué)順德研究生院，廣東佛山528300）

經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展伴隨著能源的巨大消耗，但我國(guó)傳統(tǒng)化石能源儲(chǔ)存量有限且大量依賴進(jìn)口。因此為應(yīng)對(duì)國(guó)際形勢(shì)變化、保障能源安全并優(yōu)化能源結(jié)構(gòu)，可再生能源的發(fā)展受到了越來(lái)越多的關(guān)注。國(guó)家制定了《可再生能源中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃》《可再生能源法》《能源發(fā)展十三五規(guī)劃》等一系列政策、法律法規(guī)引導(dǎo)可再生能源穩(wěn)健發(fā)展，首部能源法征求意見(jiàn)稿更是首次明確我國(guó)要將可再生能源列為能源發(fā)展的優(yōu)先領(lǐng)域。

自1983年Gramham Quick首次對(duì)生物柴油進(jìn)行定義后，這種可直接替代或與化石柴油調(diào)合使用，具有十六烷值高、無(wú)毒、低硫、可降解、無(wú)芳烴等特點(diǎn)的可再生、綠色環(huán)保的液體燃料便得到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注與研究。歐美國(guó)家研究生物柴油起步較早，國(guó)際市場(chǎng)上以大豆油和菜籽油為原料的生物柴油已實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)[1]。我國(guó)雖然起步較晚，但發(fā)展速度較快，還頒布了《生物柴油產(chǎn)業(yè)發(fā)展政策》、《B5柴油》、《BD100生物柴油》等政策和標(biāo)準(zhǔn)，引導(dǎo)生物柴油規(guī)?；⒁?guī)范化生產(chǎn)與應(yīng)用。

圖1 生物柴油簡(jiǎn)介

表1 常見(jiàn)產(chǎn)油微生物及其油脂含量

然而生產(chǎn)微生物油脂的成本較高，其中主要是碳源成本。有研究表明葡萄糖作為碳源的成本高達(dá)整個(gè)生物柴油生產(chǎn)過(guò)程總成本的80%[5]。為了降低微生物油脂的生產(chǎn)成本，研究者們致力于尋找廉價(jià)原料代替葡萄糖，以便使得微生物油脂具有更好的應(yīng)用價(jià)值。因此本文詳細(xì)總結(jié)了目前研究較多的4種廉價(jià)原料，即木質(zhì)纖維素、粗甘油、有機(jī)廢水和揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）用于產(chǎn)油酵母合成油脂的研究進(jìn)展，并展望了產(chǎn)油酵母菌利用這些廉價(jià)原料的發(fā)展趨勢(shì)。以期通過(guò)本文的綜述與總結(jié)，為推動(dòng)廉價(jià)原料廣泛、高效地應(yīng)用于微生物產(chǎn)油脂領(lǐng)域，提高微生物油脂生產(chǎn)生物柴油的經(jīng)濟(jì)效益提供借鑒。

1 產(chǎn)油酵母合成油脂的機(jī)理

微生物油脂是產(chǎn)油微生物合成的與植物油脂肪酸組成類(lèi)似的甘油三酯（triacylglycerol,TAG）[18]。產(chǎn)油微生物種類(lèi)眾多，凡是能合成其細(xì)胞干重20%以上油脂的微生物，都被稱(chēng)為產(chǎn)油微生物[19]。產(chǎn)油酵母相較于產(chǎn)油微藻，其碳源更加豐富且不受光照、氣候等因素影響；相較于霉菌，其對(duì)重金屬離子耐受性更強(qiáng)、需氧量更少；相較于細(xì)菌，其菌體更大且所合成的油脂更易提取。更重要的是，產(chǎn)油酵母產(chǎn)油能力較強(qiáng)（20%～70%），并更易于進(jìn)行基因改造，這些優(yōu)點(diǎn)使得產(chǎn)油酵母成為極具潛力的產(chǎn)油微生物[20]。

產(chǎn)油酵母一般通過(guò)兩種不同的途徑合成油脂：非從頭（ex novo）合成途徑和從頭（de novo）合成途徑[21]。

非從頭合成途徑，產(chǎn)油酵母可以利用培養(yǎng)基中的疏水性底物，如脂肪酸、油和三酰基甘油（TAG）等。這些物質(zhì)在胞外被脂肪酶水解，釋放的脂肪酸通過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)積累并儲(chǔ)存在脂質(zhì)體（lipid body）中。此途徑不受培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)素限制。

從頭合成途徑是指產(chǎn)油酵母在生長(zhǎng)過(guò)程中，將培養(yǎng)基中的親水性底物，如葡萄糖、甘油、乙酸等，在特定的發(fā)酵條件下通過(guò)三羧酸循環(huán)等生化過(guò)程轉(zhuǎn)化為油脂。此途徑中脂質(zhì)積累通常是在培養(yǎng)基中碳源充足而氮源耗盡時(shí)啟動(dòng)的，氮是微生物合成細(xì)胞物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和用于細(xì)胞增殖的含氮代謝物的重要營(yíng)養(yǎng)元素。因此當(dāng)?shù)春谋M時(shí)，菌體繼續(xù)吸收培養(yǎng)基中過(guò)量的碳源并用于脂質(zhì)合成，而不是細(xì)胞增殖。非產(chǎn)油微生物在相同的營(yíng)養(yǎng)限制條件下，往往也會(huì)停止進(jìn)一步的細(xì)胞增殖，但是繼續(xù)吸收的碳水化合物則是被轉(zhuǎn)移儲(chǔ)存到到各種多糖中，如各種葡聚糖和甘露聚糖，而不是形成油脂。

產(chǎn)油酵母通過(guò)從頭合成途徑合成油脂的機(jī)理主要分為3步[22]。第1步，脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)As）的合成。微生物油脂合成過(guò)程中需要乙酰-CoA作為底物，其通常來(lái)源于三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑。產(chǎn)油微生物還可利用ATP-檸檬酸裂解酶（ACL）裂解檸檬酸生成乙酰-CoA和草酰乙酸。限氮培養(yǎng)條件可刺激腺苷一磷酸（AMP）脫氨酶活性增強(qiáng)，AMP脫氨酶裂解AMP生成大量的肌苷一磷酸（IMP）及氨，為微生物細(xì)胞提供氮。輔助因子AMP濃度降低導(dǎo)致細(xì)胞線粒體中異檸檬酸脫氫酶（ICDH）活性減弱甚至失活，無(wú)法轉(zhuǎn)化異檸檬酸脫氫酶為2-酮戊二酸，致使三羧酸循環(huán)受到阻礙，細(xì)胞代謝途徑由此轉(zhuǎn)換。檸檬酸在線粒體中逐漸積累，并通過(guò)膜上的蘋(píng)果酸/檸檬酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，由ACL裂解生成乙酰-CoA及草酰乙酸。草酰乙酸可被蘋(píng)果酸脫氫酶（ME）轉(zhuǎn)化為蘋(píng)果酸，生成的蘋(píng)果酸可由蘋(píng)果酸/檸檬酸轉(zhuǎn)移酶再次轉(zhuǎn)移至線粒體，或者由ME進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)生成還原氫（NADPH）和CO2。這一系列的酶促反應(yīng)所產(chǎn)生的乙酰-CoA以及NADPH將參與脂肪酸合酶復(fù)合體（FAS）的合成直至生成最后的甘油三酯（TAGs）。

授課結(jié)束后，“雨課堂”會(huì)自動(dòng)生成課后小結(jié)，并發(fā)給教師和學(xué)生?！坝暾n堂”會(huì)自動(dòng)評(píng)定出本節(jié)課的優(yōu)秀學(xué)生和預(yù)警學(xué)生，教師也可通過(guò)“雨課堂”發(fā)布課后習(xí)題，學(xué)生作答后可直接查看“富文本答案解析”。通過(guò)數(shù)據(jù)采集、分析、教師對(duì)學(xué)生任務(wù)完成時(shí)間和情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，掌握每位學(xué)生課程的學(xué)習(xí)情況，準(zhǔn)確定位教師的教學(xué)活動(dòng)[6]。

第2步，脂肪酸合酶復(fù)合體的酶促反應(yīng)，利用ME產(chǎn)生的NADPH，使得第1步得到的脂肪酸鏈的碳鏈不斷增長(zhǎng)，直到生成某一特征脂肪酸。第3步，脂肪酸合成后，絕大部分發(fā)生酯化反應(yīng)生成甘油三酯或磷酸甘油脂。微生物體內(nèi)甘油在甘油激酶（GK）作用下生成甘油-3-磷酸，再與酯酰-CoA形成中間產(chǎn)物磷脂酸（PA）。接著磷脂酸在磷脂酸磷酸酶（PAP）作用下磷酸化形成甘油二酯（DAG），再由酯酰-CoA:DAG?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物甘油三酯。圖2介紹了產(chǎn)油酵母利用幾種常見(jiàn)碳源合成油脂的代謝途徑。

Braunwald等[23]評(píng)估了產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油全過(guò)程的經(jīng)濟(jì)成本，結(jié)果表明現(xiàn)階段其經(jīng)濟(jì)可行性低于傳統(tǒng)油脂性植物原料；Dias等[24]的研究也顯示傳統(tǒng)柴油的生產(chǎn)成本為0.49美元/升（不包括稅費(fèi)和經(jīng)銷(xiāo)成本），棕櫚油合成生物柴油的成本為0.66美元/升，而產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的平均成本為2.07美元/升（不包括原料成本）。利用微生物油脂合成生物柴油不具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，這也成為微生物油脂規(guī)?；瘧?yīng)用的限制因素。然而，無(wú)論是通過(guò)以上何種途徑合成微生物油脂，培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)都是重要因素，碳源的成本是影響微生物油脂成本的重要因素之一，占生物柴油生產(chǎn)總成本的40%～80%[25]。因此降低碳源成本對(duì)降低微生物油脂的生產(chǎn)成本至關(guān)重要。

2 產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料

如前文所述，產(chǎn)油酵母可利用的碳源種類(lèi)廣泛，如葡萄糖、淀粉、甘油、木糖、蔗糖、秸稈、烷烴、餐廚廢油和有機(jī)廢水等。其中葡萄糖是研究最多、應(yīng)用最廣且是細(xì)胞生長(zhǎng)和油脂合成的高效碳源，產(chǎn)油酵母利用其合成的油脂含量可達(dá)60%以上[26]。但利用葡萄糖作為原料不僅會(huì)面臨與糧爭(zhēng)地、與人爭(zhēng)糧等爭(zhēng)議性問(wèn)題，而且其成本高昂。據(jù)評(píng)估，葡萄糖成本約占培養(yǎng)基總成本的80%，占生物柴油總生產(chǎn)成本的60%以上[27]。因此，為了降低產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的總成本，使其更具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)和可推廣性，使用廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵勢(shì)在必行。

近年來(lái)，對(duì)廉價(jià)原料的研究主要集中在親水性底物上，例如木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物、粗甘油和有機(jī)廢水等以及少數(shù)疏水性底物，如工農(nóng)業(yè)過(guò)程的副產(chǎn)物或廢物——揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids,VFAs）等。利用這些物質(zhì)作為產(chǎn)油酵母的原料，不僅能夠降低生物柴油的生產(chǎn)成本，而且這些物質(zhì)大都屬于工農(nóng)業(yè)及生活廢物（水），此過(guò)程還能處理廢物（水）并進(jìn)行再利用，實(shí)現(xiàn)了可持續(xù)發(fā)展。表2對(duì)比了常用碳源的價(jià)格，圖3介紹了產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料。

圖2 產(chǎn)油酵母利用常見(jiàn)碳源合成油脂

圖3 產(chǎn)油酵母可利用的廉價(jià)原料簡(jiǎn)介

表2 產(chǎn)油酵母常用碳源價(jià)格表

2.1 木質(zhì)纖維素

木質(zhì)纖維素是農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品、城市固體廢物、低投入能源作物和森林殘留物的重要部分，占全球生物質(zhì)總量的一半[20]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)且森林覆蓋率高，因此我國(guó)的木質(zhì)纖維素資源非常豐富，僅農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)量就達(dá)(6～8)億噸[29]。因此，這種來(lái)源廣泛且不與食品供應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)的可再生原料成為產(chǎn)油酵母生產(chǎn)生物柴油的極具吸引力的原料[28]。

產(chǎn)油酵母大多不能對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行直接利用，因此需進(jìn)行預(yù)處理得到微生物可直接利用的各種單糖，這將大幅提高木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為微生物油脂的效率。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法、物化法和生物法[30-32]，無(wú)論采取何種方法，都應(yīng)最大程度地將木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)分解為單糖，并防止單糖進(jìn)一步化學(xué)分解。各種預(yù)處理方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，表3進(jìn)行了較詳細(xì)的總結(jié)。

木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物多樣，圖4列出了常見(jiàn)的水解產(chǎn)物。其通常由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3種不同的聚合物組成，比例構(gòu)成因原料種類(lèi)的不同而不同[24]。其中纖維素和半纖維素可水解為單糖，如己糖（葡萄糖等）和戊糖（木糖等），產(chǎn)油酵母可有序利用這些糖類(lèi)。木質(zhì)素的水解產(chǎn)物為芳香族化合物，具有毒性，極少的產(chǎn)油酵母菌能夠利用其生長(zhǎng)。

產(chǎn)油酵母對(duì)木質(zhì)纖維素各水解糖的偏好和利用順序不同，促進(jìn)對(duì)各種糖類(lèi)的快速和同時(shí)利用對(duì)木質(zhì)纖維素向微生物油脂的經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)化至關(guān)重要，因此已有許多學(xué)者對(duì)產(chǎn)油酵母利用多種木質(zhì)纖維素合成微生物油脂開(kāi)展了研究（表4中油脂含量是指油脂產(chǎn)量和細(xì)胞干重的百分比，下同），以進(jìn)一步闡明糖同化機(jī)制。這些研究也再次印證了多種木質(zhì)纖維素用于產(chǎn)油酵母合成微生物油脂的可行性，從而有望顯著降低生物柴油的生產(chǎn)成本。

由于目前較多的木質(zhì)纖維素如玉米秸稈和水稻秸稈等，已大量地規(guī)?；糜诤铣善渌鲋诞a(chǎn)品，如生物乙醇。因此為避免潛在的土地管理問(wèn)題等，應(yīng)大力發(fā)展非競(jìng)爭(zhēng)性木質(zhì)纖維素用于生物柴油的生產(chǎn)，如天然雜草、造紙廠污泥等，保證多種可再生能源的共同發(fā)展。另外，木質(zhì)纖維素預(yù)處理過(guò)程產(chǎn)生的一些可能對(duì)產(chǎn)油酵母生長(zhǎng)、油脂合成產(chǎn)生抑制作用的水解產(chǎn)物和副產(chǎn)物也需要注意并妥當(dāng)處理。

2.2 粗甘油

圖4 木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及預(yù)處理和水解產(chǎn)物

表3 木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法

粗甘油是生物柴油生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)10kg生物柴油將產(chǎn)生1kg甘油副產(chǎn)物。生物柴油原料以及處理工藝的不同使得粗甘油成分組成不同，但主要成分均為甘油、水、灰分和甲醇等[20]。甘油作為多種產(chǎn)油酵母可利用的碳源，與糖類(lèi)碳源相比，其還原度更高、發(fā)酵過(guò)程中的CO2排放更少并且作為工業(yè)廢物，不會(huì)與食品或飼料生產(chǎn)發(fā)生直接競(jìng)爭(zhēng)。精制甘油在化妝品和藥品等不同領(lǐng)域有更廣泛的用途，因此將純甘油用于酵母的大規(guī)模培養(yǎng)是昂貴且不切實(shí)際的；粗甘油相較于純甘油成本更低，且其中的一些雜質(zhì)元素（如鉀、鈣、硫和鎂）對(duì)微生物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。因此，使用粗甘油生產(chǎn)微生物油脂不僅可以降低生產(chǎn)成本，還可以作為一種粗甘油回收利用的方法。

表4 產(chǎn)油酵母菌利用不同木質(zhì)纖維素合成油脂

多種產(chǎn)油酵母已被證實(shí)可利用粗甘油合成油脂（表5），并且產(chǎn)油酵母利用粗甘油能獲得與葡萄糖和純甘油作為碳源時(shí)相當(dāng)?shù)纳踔粮叩挠椭a(chǎn)量。有研究表明，粗甘油中存在的一些雜質(zhì)（油酸甲酯、油酸鈉和NaCl等）能一定程度地提高脂質(zhì)產(chǎn)量，甲醇則會(huì)有抑制作用，但可被其他雜質(zhì)的促進(jìn)作用削弱[38-39]。即使是雜質(zhì)（如肥皂和游離脂肪酸）含量較高而甘油含量較低的粗甘油（13.24%），也可通過(guò)優(yōu)化C/N比和發(fā)酵模式的方法來(lái)代替葡萄糖，成為可被T.oleaginosus高效利用的碳源[40]。Y.lipolytica可直接利用各種工業(yè)過(guò)程產(chǎn)生的粗甘油并合成油脂[41]，相比于葡萄糖，一些菌株甚至對(duì)甘油的利用速率更快[42]。已有綜述詳細(xì)總結(jié)了甘油應(yīng)用于Y.lipolytica生產(chǎn)各種生物產(chǎn)品的進(jìn)展[43]。

表5 產(chǎn)油酵母菌利用粗甘油合成油脂

在其他條件均相同的前提下，Y.lipolyticaACA-YC 5030幾乎無(wú)法利用30g/L的粗甘油合成油脂[13]。因此為提高產(chǎn)油酵母對(duì)高濃度甘油的利用率和油脂產(chǎn)量，很多研究通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)模式來(lái)實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)。Polburee等[44]采用溫度調(diào)節(jié)兩階段培養(yǎng)模式，使得產(chǎn)油酵母R.fluvialeDMKU-RK253能夠有效利用濃度高達(dá)60g/L的粗甘油，并獲得了高密度的生物量和高產(chǎn)量的油脂，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70%。在脂合成階段，連續(xù)補(bǔ)料800g/L的甘油不僅不會(huì)給R.glutinis造成濃度抑制，多余碳源反而被引導(dǎo)至油脂合成過(guò)程[15]。Magdouli等[45]通過(guò)添加表面活性劑和油類(lèi)物質(zhì)作為誘導(dǎo)劑，能夠提高Y.lipolytica對(duì)粗甘油的利用率和油脂產(chǎn)量，這是因?yàn)楸砻婊钚詣┠軌蛉榛指视椭械碾s質(zhì)烴基化合物，將烴基化合物分解為更易于微生物利用的形態(tài)，此外，表面活性劑還有效充當(dāng)了Y.lipolytica中TAG積累的活化劑。

通過(guò)增加粗甘油濃度到合適范圍或優(yōu)化培養(yǎng)模式、預(yù)處理去除對(duì)微生物生長(zhǎng)和油脂合成產(chǎn)生抑制的雜質(zhì)、保留粗甘油中有益雜質(zhì)以及添加表面活性劑等方式，能夠使得產(chǎn)油酵母有效利用各工業(yè)過(guò)程中產(chǎn)生的廉價(jià)副產(chǎn)物甘油，并合成增值產(chǎn)品微生物油脂。

2.3 有機(jī)廢水

據(jù)國(guó)家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，我國(guó)廢水排放量巨大，2019年排放總量達(dá)700億噸。廢水處理工藝復(fù)雜且處理成本較高，但考慮到廢水中含有豐富有機(jī)物和有益的微量元素，一些研究利用工農(nóng)業(yè)廢水作為產(chǎn)油酵母的廉價(jià)原料。這既可以解決廢水處理過(guò)程中帶來(lái)的高能耗、二次污染物排放、高處理成本以及大量的剩余污泥等問(wèn)題，同時(shí)合成能源物質(zhì)微生物油脂，實(shí)現(xiàn)了廢物再利用。

現(xiàn)階段用來(lái)作為原料的有機(jī)廢水主要是工業(yè)廢水（如釀酒廠、味精制造廠和制氫工藝等）和農(nóng)業(yè)廢水（如畜禽廢水）（表6）。Chi等[46]將制氫廢水作為C.curvatus發(fā)酵產(chǎn)油脂的原料，相較于餐廚廢水，這種含氮量較少的廢水能夠得到更為高效的利用，獲得了126g/L的油脂產(chǎn)量和75%的油脂含量，為有機(jī)廢物用于產(chǎn)氫和產(chǎn)油脂的耦合生產(chǎn)提供了思路。Ling等[47]研究了釀酒廢水原水作為碳源用于微生物產(chǎn)油脂，無(wú)需滅菌處理，也不額外添加營(yíng)養(yǎng)元素，僅通過(guò)提高R.toruloidesAS2.1389的接種量即可實(shí)現(xiàn)油脂生產(chǎn)和化學(xué)需氧量（COD）的高效去除。經(jīng)流體動(dòng)力空化處理后的畜禽廢水能被C.pseudolambica高效利用并合成產(chǎn)量可觀的油脂，同時(shí)還能有效回收磷和鎂等元素[48]。纖維素廢水的處理還處于研究階段，其成分復(fù)雜且處理難度大，而對(duì)有機(jī)廢水耐受性較高的黏紅酵母，不僅能有效去除纖維素廢水中的COD，還能合成微生物油脂[49]。一些研究通過(guò)酵母-微藻、酵母-霉菌等共培養(yǎng)的模式，可提高油脂產(chǎn)量和污水處理效果。Magdouli等[50]對(duì)共培養(yǎng)體系用于生產(chǎn)微生物油脂的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)進(jìn)行了詳細(xì)的綜述；Ling等[51]將產(chǎn)油酵母R.toruloides和產(chǎn)油微藻C.pyrenoidosa共培養(yǎng)處理釀酒廢水，相較于單獨(dú)培養(yǎng)，不僅減少了調(diào)節(jié)pH所需的試劑用量，還大大提高了油脂產(chǎn)量和溶解性化學(xué)需氧量（SCOD）去除率；產(chǎn)油酵母Y.lipolytica和產(chǎn)油微藻C.vulgaris在乳制品廢水基質(zhì)下共培養(yǎng)，所得油脂產(chǎn)量和含量分別是Y.lipolytica單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的8倍和3倍[52]。

表6 產(chǎn)油酵母菌利用不同有機(jī)廢水合成油脂

廢水中豐富的有機(jī)物以碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、氨基酸和VFAs等形式存在，可以被產(chǎn)油酵母用作營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但是不可忽視的是，有些廢水中還含有高濃度的有機(jī)酸以及復(fù)雜的鹽成分，如高濃度的鈉、鈣、鉀、鎂、氯、硫、磷酸鹽、碳酸氫鹽、銨鹽和重金屬等，有些廢水甚至還含有一些不可生物降解的抗生素和難降解的化學(xué)物質(zhì)，這些物質(zhì)都會(huì)影響到產(chǎn)油酵母的生長(zhǎng)以及各種代謝活動(dòng)。因此，未來(lái)產(chǎn)油酵母利用廢水作為廉價(jià)原料時(shí)，應(yīng)考慮以下方法以加強(qiáng)對(duì)有機(jī)廢水的利用：①對(duì)廢水進(jìn)行預(yù)處理。通過(guò)低價(jià)、高效的預(yù)處理，減少菌體抑制物質(zhì)并盡量多地釋放可利用物質(zhì)；②篩選或者馴化可在含有高濃度有機(jī)物廢水里生長(zhǎng)的菌株，提高菌株本身對(duì)環(huán)境的耐受性；③大規(guī)模推廣時(shí)，可能不便對(duì)廢水進(jìn)行消毒以維持產(chǎn)油酵母的優(yōu)勢(shì)菌種地位，可通過(guò)提高產(chǎn)油酵母初始細(xì)胞密度、調(diào)節(jié)pH為產(chǎn)油酵母最適范圍以及與微藻共培養(yǎng)等方式來(lái)解決該問(wèn)題。

2.4 VFAs

揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）通常是指短鏈脂肪酸（C1～C6），如乙酸、異丁酸、丙酸、異戊酸、正丁酸和正戊酸，是有機(jī)廢物厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的廉價(jià)原料，其產(chǎn)量和組成與厭氧發(fā)酵底物和發(fā)酵過(guò)程密切相關(guān)。由食物殘?jiān)╢ood waste,FW）產(chǎn)生的VFAs的成本為30美元/噸，不到葡萄糖成本的10%[27]。與其他糖基碳源相比，VFAs具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)。此外，其脂質(zhì)轉(zhuǎn)化路徑更短且理論轉(zhuǎn)化率更高[55]。因此，VFAs被認(rèn)為是生產(chǎn)微生物油脂極具前景的廉價(jià)碳源。

一些研究已證實(shí)了產(chǎn)油酵母如Y.lipolytica、R.toruloides和C.curvatus等可將VFAs轉(zhuǎn)化為微生物油脂（表7）。VFAs可作為唯一碳源用于合成微生物油脂，但通常油脂產(chǎn)量較低，油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅在20%左右[5]，所以為提高其轉(zhuǎn)化率，可與葡萄糖或者甘油等共同作為碳源，通過(guò)兩階段的培養(yǎng)模式獲得較高的油脂產(chǎn)量。在Fei等[27]的研究中，VFAs作為單一碳源時(shí)，油脂產(chǎn)量和質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.65g/L和25.1%，通過(guò)培養(yǎng)模式的優(yōu)化，其油脂產(chǎn)量和含量可分別提高20倍和2倍。

VFAs中不同有機(jī)酸的組成對(duì)油脂產(chǎn)量影響顯著，F(xiàn)ei等[5]研究了乙酸、丙酸、丁酸以不同比例混合的VFAs作為碳源時(shí)對(duì)C.albidus生長(zhǎng)和油脂合成的影響。結(jié)果表明，乙酸比例較高的組別相對(duì)于比例均衡的組別，所獲生物量、油脂產(chǎn)量和含量均較高。類(lèi)似的結(jié)果也在其他學(xué)者的研究中得到印證[56]，且發(fā)現(xiàn)無(wú)論VFAs濃度高低與否，產(chǎn)油酵母均表現(xiàn)出對(duì)乙酸的偏愛(ài)，利用率更高，而丙酸和丁酸的利用率較低。在Liu等[56]的研究中發(fā)現(xiàn)乙酸的利用率達(dá)99%以上，而丙酸的利用率僅為35%。Gao等[57]還發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是單酸體系還是混合酸體系，乙酸的消耗速率均更快，且Y.lipolytica對(duì)不同類(lèi)型VFAs的利用不是同步進(jìn)行的，而是逐步進(jìn)行的，即優(yōu)先使用乙酸合成脂質(zhì)，然后再使用丙酸和丁酸，且當(dāng)有足夠的乙酸作為碳源時(shí)，丙酸和丁酸的代謝甚至可能會(huì)受到抑制或停止。因此，增加VFAs中乙酸的比例可能是促進(jìn)油脂生產(chǎn)的有效方法。

表7 產(chǎn)油酵母菌利用VFAs合成油脂

實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，污泥產(chǎn)生的VFAs濃度為2～8g/L，而食品殘?jiān)?、?dòng)物或人類(lèi)糞便以及高含量有機(jī)廢水的VFAs的濃度相對(duì)較高，為10～40g/L。因此為推動(dòng)實(shí)際高濃度VFAs應(yīng)用于微生物產(chǎn)油脂并減少稀釋成本和反應(yīng)器容積，一些學(xué)者研究了如何高效利用高濃度VFAs。對(duì)于大多數(shù)產(chǎn)油微生物利用葡萄糖作為碳源時(shí)，弱酸環(huán)境（pH=5～6）是較適宜的發(fā)酵環(huán)境，但是Gao等[60]研究表明，弱堿性環(huán)境更適宜Y.lipolytica利用高濃度乙酸（30～110g/L）。弱堿性環(huán)境可緩解高濃度乙酸的抑制作用，且在各乙酸濃度下，pH=8皆為最適pH，最高油脂產(chǎn)量和含量均在乙酸濃度為70g/L時(shí)獲得，分別為10.11g/L和28%。Liu等[58]也驗(yàn)證了堿性環(huán)境對(duì)高濃度VFAs的利用有促進(jìn)作用，40g/L乙酸作為碳源時(shí)，C.curvatusATCC 20509在pH=8時(shí)可獲得6.32g/L的油脂產(chǎn)量和65.3%的油脂含量，乙酸利用率高達(dá)95.1%，分別為中性環(huán)境下所得結(jié)果的3.49倍、1.26倍和1.26倍。此外Liu也表明增加初始菌種接種比或降低C/N比也有利于高濃度VFAs的利用。

利用VFAs這一廉價(jià)發(fā)酵產(chǎn)物作為產(chǎn)油酵母的原料是可行的，實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)注意其抑制作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)pH、優(yōu)化接種比、C/N比和培養(yǎng)模式等方法，提高產(chǎn)油酵母對(duì)VFAs的轉(zhuǎn)化率和油脂產(chǎn)量。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

無(wú)論是基于國(guó)際能源發(fā)展趨勢(shì)還是我國(guó)的能源發(fā)展規(guī)劃，可再生能源和清潔能源都是現(xiàn)階段以及未來(lái)的研究熱點(diǎn)和研究重點(diǎn)。產(chǎn)油酵母合成的微生物油脂來(lái)源廣泛、生產(chǎn)速率快且?guī)缀醪皇芟抻跉夂蚝图竟?jié)等因素，是生物柴油生產(chǎn)的理想原料。如果能攻克高昂的原料成本問(wèn)題，微生物油脂在實(shí)際應(yīng)用中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)將大幅提高。本文綜述的來(lái)自工農(nóng)業(yè)和生活中的廢棄物質(zhì)（廢水）木質(zhì)纖維素、粗甘油、有機(jī)廢水和VFAs，都具有原料充足、廉價(jià)易得、有機(jī)物含量高以及成分復(fù)雜的特點(diǎn)，在經(jīng)過(guò)有效預(yù)處理后均可被產(chǎn)油酵母高效利用。這不僅可以解決廢棄物的處理問(wèn)題，還能變廢為寶，生產(chǎn)增值物質(zhì)生物柴油，具有極高的環(huán)境效益和經(jīng)濟(jì)效益?？偨Y(jié)現(xiàn)有的研究成果，未來(lái)利用這些廉價(jià)原料作為產(chǎn)油酵母的原料時(shí)，還需要進(jìn)一步的技術(shù)研發(fā)和構(gòu)建生物柴油生產(chǎn)系統(tǒng)，主要有以下幾點(diǎn)建議。

（1）采取高效預(yù)處理技術(shù)提高廉價(jià)原料的可利用性。這些來(lái)自工農(nóng)業(yè)和生活中的廢棄物，除了含量較高的有機(jī)物，還含有許多不利于酵母生長(zhǎng)和代謝的雜質(zhì)。進(jìn)行有效的預(yù)處理可以提高產(chǎn)油酵母對(duì)這些原料的利用率和油脂產(chǎn)量。同時(shí)應(yīng)注意，這些處理技術(shù)應(yīng)盡量低成本，并且盡量避免造成二次抑制。

（2）利用基因工程或共培養(yǎng)技術(shù)，強(qiáng)化產(chǎn)油酵母對(duì)這些原料的適應(yīng)和利用。這些成分復(fù)雜的原料可能不利于一些微生物的適應(yīng)和生存，因此可利用基因工程構(gòu)建、篩選、馴化高效適應(yīng)的菌種，簡(jiǎn)化原料預(yù)處理步驟，減少預(yù)處理成本。現(xiàn)階段利用基因工程提高油脂產(chǎn)量的方法主要有：脂肪酸（FAs）合成途徑中關(guān)鍵酶的過(guò)表達(dá)、TAG合成途徑中關(guān)鍵酶的過(guò)表達(dá)、TAG合成旁路的調(diào)控、阻礙競(jìng)爭(zhēng)途徑[4,65-66]。如Y.lipolytica通過(guò)過(guò)表達(dá)一些天然異源基因，就能夠有效地利用木糖作為碳源來(lái)生產(chǎn)脂質(zhì)，脂質(zhì)產(chǎn)量高達(dá)16.5g/L，脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)67%[67]。此外，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模一般通過(guò)滅菌來(lái)保持產(chǎn)油酵母優(yōu)勢(shì)菌種的狀態(tài)，實(shí)際規(guī)?；瘧?yīng)用過(guò)程中，滅菌操作難以完成，因此可考慮通過(guò)共培養(yǎng)技術(shù)或加大接種量等途徑促進(jìn)菌種適應(yīng)和油脂合成。

（3）構(gòu)建廢棄物收集→微生物油脂合成→生物柴油生產(chǎn)→廢棄物收集的綠色閉合循環(huán)系統(tǒng)。未來(lái)實(shí)現(xiàn)生物柴油穩(wěn)定、低價(jià)的生產(chǎn)應(yīng)構(gòu)建一套閉環(huán)的綠色循環(huán)系統(tǒng)：首先保證廉價(jià)原料的持續(xù)穩(wěn)定供應(yīng)，其后產(chǎn)油酵母高效合成微生物油脂，微生物油脂再有序轉(zhuǎn)化為生物柴油。此過(guò)程產(chǎn)生的廢棄物可循環(huán)再次作為原料，形成一套零排放的循環(huán)系統(tǒng)，符合清潔生產(chǎn)理念。