趙 慧，高永峰，倪春林，周武藝

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院生物化工與制藥實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，廣州 510642）

0 引言

近20 年來，現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展迅猛，60%以上生物技術(shù)成果應(yīng)用于制藥工業(yè)，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)隨之崛起，傳統(tǒng)醫(yī)藥得到改良，特色新藥得以開發(fā)［1］，同時對生物技術(shù)人才的需求量也逐年增加。為此，很多高等院校設(shè)置了與生物藥物研究、生產(chǎn)相關(guān)的專業(yè)，如生物技術(shù)、生物工程和制藥工程等專業(yè)［2］。發(fā)展是第一要務(wù)，人才是第一資源，創(chuàng)新是第一動力。高等教育的首要目標(biāo)就是要為社會發(fā)展培養(yǎng)創(chuàng)新型和綜合應(yīng)用型人才，而同時人才的塑造是離不開高等院校對學(xué)生創(chuàng)新精神的培養(yǎng)和為學(xué)生提供的創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)服務(wù)平臺［3］。2018 年教育部《關(guān)于加快建設(shè)高水平本科教育全面提高人才培養(yǎng)能力的意見》（教高〔2018〕2 號）提出了加強(qiáng)校內(nèi)實(shí)驗(yàn)教學(xué)資源建設(shè)等要求［4］。該文件不僅強(qiáng)調(diào)了高校綜合性實(shí)驗(yàn)平臺建設(shè)的重要性，更是強(qiáng)調(diào)了綜合性實(shí)驗(yàn)平臺對未來人才的創(chuàng)新精神培養(yǎng)的重要性。綜合性實(shí)踐一般以模擬解決生產(chǎn)實(shí)際問題為基點(diǎn)，以培養(yǎng)學(xué)生多方面能力為目的，如培養(yǎng)學(xué)生的文獻(xiàn)綜合能力、創(chuàng)新設(shè)計能力、理論和技能的靈活運(yùn)用能力以及團(tuán)隊(duì)合作能力等［3，5-6］。

生物分離方法因生物分子的多樣性及生物化學(xué)的復(fù)雜性呈現(xiàn)出豐富和多變的特點(diǎn)，生物分離工藝往往不能用數(shù)學(xué)模型精確界定，它既是一種技術(shù)，也是一門科學(xué)，且在工藝開發(fā)中常需考慮多項(xiàng)法規(guī)要求［7］。在生物制藥產(chǎn)業(yè)中，生物分離工藝開發(fā)逐漸被視為競爭性優(yōu)勢的關(guān)鍵因素，采用最簡單的方法在不降低生物活性的前提下大量獲得純度較高的生物活性產(chǎn)品是提高企業(yè)競爭力的最直接方法。對于大學(xué)生而言，具備良好的綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計（分離純化設(shè)計）能力是提高人才競爭力的重要途徑之一。因此，需要打破傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)格局，改革教學(xué)模式，提升實(shí)驗(yàn)課的自由度，關(guān)注學(xué)生的學(xué)習(xí)過程，引入多維的學(xué)生老師互動等［8］。

雞蛋溶菌酶（lysozyme），即1，4-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷富虬谫|(zhì)酶，是一種可水解細(xì)菌細(xì)胞壁的堿性蛋白酶，具有抗菌、消炎、消腫和增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等多種藥理作用，可作為殺菌劑廣泛用于食品保鮮、醫(yī)學(xué)臨床等［9-12］，雞蛋和哺乳動物乳汁是溶菌酶的主要來源。學(xué)生以蛋清溶菌酶作為研究對象，進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計，具有以下幾個優(yōu)點(diǎn)，①雞蛋來源豐富且廉價；②蛋清中溶菌酶含量高，學(xué)生易得到結(jié)果，且經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化后，效果明顯，易于學(xué)生進(jìn)行比較分析；③該實(shí)驗(yàn)綜合性強(qiáng)，涉及化學(xué)和生物等多個學(xué)科；④該實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)了學(xué)生需要掌握的重要生物技術(shù)包括生物藥物的分離純化、生物藥物鑒定的基本原理和方法等，適合生物技術(shù)、生物工程和制藥工程等專業(yè)的綜合生物技術(shù)類實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。

1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)材料：雞蛋，溶酶小球菌，D152 大孔弱酸性陽離子交換樹脂，氯化鈉，硫酸銨，磷酸氫二鈉，鹽酸和氫氧化鈉等；溶菌酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（貨號A050）。

實(shí)驗(yàn)器材：紫外分光光度計，循環(huán)水式真空泵，低溫離心機(jī)，層析柱，布氏漏斗等。

1.2 溶菌酶的提取

樹脂處理流程：D152 樹脂先用1 mol/L NaOH 攪拌浸泡4～8 h后，再用1 mol/L HCl攪拌浸泡4～8 h，使其全部轉(zhuǎn)變成氫型，蒸餾水洗樹脂至pH 5.5，保持過夜，此為H+型樹脂；取一部分H+型樹脂再用2 mol/L NaOH處理，使之轉(zhuǎn)變?yōu)镹a+型，pH值不小于6.5。氫型和鈉型兩種樹脂按1 ∶1的比例混合備用［13-14］，流程為：

（1）蛋清處理及吸附。取1～2 個新鮮雞蛋清加入等體積去離子水，用1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至7 左右，過濾收集濾液，按樹脂/體積蛋清比為12.5%加入上述混合型樹脂。

（2）洗滌。用與樹脂等體積的去離子水洗滌15 min，過濾，重復(fù)洗3 次，測其O280的吸光度，洗至吸光度低于0.01 即可。

（3）洗脫。將樹脂加入至等體積的10%硫酸銨水溶液中，攪拌洗脫50～60 min。

（4）沉淀及樣品收集。往濾液中緩慢加入硫酸銨使鹽濃度達(dá)到32%，放入冰箱靜置過液，收集濾餅，即得溶菌酶，丙酮洗滌，真空干燥約3 h，稱取重量。

1.3 溶菌酶的SDS-PAGE鑒定

采用12%分離膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析溶菌酶純度，采用Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度。

1.4 溶菌酶酶活測定

以溶酶小球菌為底物，溶菌酶可水解小球菌細(xì)胞壁，小球菌裂解從而細(xì)胞濃度下降，透光度伴隨增強(qiáng)，據(jù)此原理，可測定提取液中溶菌酶酶量（μg/mL）與酶活（U/mL）。具體方法參見溶菌酶檢測試劑盒［15］。

1.5 學(xué)生方案設(shè)計

上述步驟為標(biāo)準(zhǔn)方案。學(xué)生方案1 采用單一鈉型（Na+）樹脂吸附，洗滌、洗脫和沉淀等方法與標(biāo)準(zhǔn)方案相同。學(xué)生方案2 主要以鹽析法提純?nèi)芫?，方案分為兩部分，①直接采用NaCl鹽析結(jié)晶法提取溶菌酶為樣品1［16］；②直接采用飽和度為50%的硫酸銨鹽析沉淀蛋清中溶菌酶為樣品2，剩余清液繼續(xù)用80%硫酸銨鹽析得樣品3。學(xué)生設(shè)計方案3 雖采用混合型樹脂吸附，且樹脂吸附、洗滌、洗脫和沉淀方法同標(biāo)準(zhǔn)方案，但蛋清預(yù)處理方案不同于標(biāo)準(zhǔn)方案，先以0.05 mol/L NaCl溶液以1∶2倍體積比稀釋蛋清液，后用1 mol/L乙酸將懸浮液的pH調(diào)節(jié)至5.0，再以50%乙醇（v/v）連續(xù)攪拌6 h沉淀后再進(jìn)行吸附洗脫等。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶菌酶的SDS-PAGE鑒定

實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方案結(jié)果如圖1（a）所示，溶菌酶提取含量適中，純度較高，方便凝膠過濾層析法進(jìn)一步純化。學(xué)生方案1 提取結(jié)果如圖1（b），結(jié)果顯示，每一樣品中均含有一定量的溶菌酶，但雜蛋白含量很高，這將大大影響后期的回收率。選取溶菌酶含量較高的幾個樣品做進(jìn)一步含量分析，對應(yīng)泳道為圖1（b）3、4 和6。比較標(biāo)準(zhǔn)方案與學(xué)生方案1 可知，混合型樹脂吸附特異性較好，可知樹脂離子型式對目的蛋白的提取有較明顯的影響。

學(xué)生方案2 提取結(jié)果如圖1（c）條帶1～3 所示，由結(jié)果可知，直接采用NaCl 鹽析結(jié)晶法，并未得到預(yù)期結(jié)果（見泳道1）。直接采用50%～80%的硫酸銨鹽析，雖能沉淀目的蛋白，但分辨率不高，同時伴隨大量的雜蛋白沉淀（見泳道2、3），這將大大增加進(jìn)一步純化的成本，影響后期的回收率。就實(shí)驗(yàn)效果而言，學(xué)生方案2 與學(xué)生方案1 效果相當(dāng)。

學(xué)生方案3 提取結(jié)果如圖1（d）所示，每一樣品均顯示目的蛋白含量低，雜蛋白含量高，且雜蛋白種類較學(xué)生方案1 和2 更多。該方案雖采用混合型樹脂吸附，但蛋清前期預(yù)處理方法不同于標(biāo)準(zhǔn)方案。事實(shí)證明，不同預(yù)處理方法會使溶菌酶蛋白分子和蛋白清液的離子狀態(tài)和離子含量不同，則后續(xù)的樹脂吸附等方法也須隨之調(diào)整優(yōu)化。因此，如果學(xué)生只一味機(jī)械照搬，不加理解，則提取結(jié)果必然偏離預(yù)期。根據(jù)圖1（d），選擇溶菌酶含量較高的樣品做進(jìn)一步含量分析，對應(yīng)泳道為圖1（d）2 和5。

圖1 溶菌酶的SDS-PAGE電泳鑒定

根據(jù)每組電泳時所用溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品用量、蛋白Marker用量以及各組的上樣量，采用Image J分析電泳中各條帶灰度，初步推算溶菌酶提取濃度，如圖2所示，可更直接顯示各組溶菌酶濃度（均以相同體積折算）。

圖2 SDS-PAGE電泳條帶灰度分析

綜上所述，通過蛋白電泳分析，蛋白提取的效果清晰明了，可直接反映蛋白提取方案的優(yōu)劣。

2.2 溶菌酶酶量/酶活測定

根據(jù)所得溶菌酶樣品的物理特點(diǎn)，采用空白對照法，結(jié)合溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，通過分光光度計530 nm處測得的透光度值，計算各樣品中具有生物活性溶菌酶的含量（μg/mL），酶活（U/mL）以及溶菌酶的最大理論回收率，結(jié)果如表1 和圖3 所示。

表1 各方案提取樣品中溶菌酶的酶量、酶活和最大理論回收率

圖3 所示清晰地展現(xiàn)了各方案溶菌酶提取量與回收率的關(guān)系，盡管學(xué)生的3 個方案提取的具有生物活性的溶菌酶含量比標(biāo)準(zhǔn)方案略高，但綜合分析純度和回收率關(guān)系，學(xué)生方案的提取效果均不理想，相反標(biāo)準(zhǔn)方案優(yōu)于學(xué)生方案。

圖3 各方案提取溶菌酶的酶量和回收率

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排與教學(xué)效果

3.1 實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排

本實(shí)驗(yàn)將學(xué)生分成4 人小組若干，以組為單位，每組需獨(dú)立設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，并完成全部實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括溶菌酶的提取，鑒定和酶活測定。實(shí)驗(yàn)工作量較大，小組成員需要合作分工，討論確定實(shí)驗(yàn)方案，組長需合理安排每個成員的工作，每個成員需要相互了解彼此的工作內(nèi)容和進(jìn)展，便于實(shí)驗(yàn)的銜接和推進(jìn)。

每組通常需要提前準(zhǔn)備，并達(dá)到以下目標(biāo)：①小組成員查閱文獻(xiàn)，討論設(shè)計實(shí)驗(yàn)方案，與指導(dǎo)老師討論并確定實(shí)驗(yàn)方案，在獨(dú)立查閱文獻(xiàn)的過程中重溫多種生物分離技術(shù)的理論要點(diǎn)和技術(shù)要點(diǎn)，了解生物分離技術(shù)重要性以及研究進(jìn)展；②掌握生物藥物的生理生化特點(diǎn)，能靈活運(yùn)用各種分離方法處理目標(biāo)產(chǎn)物；③準(zhǔn)備相關(guān)試劑的配制，熟悉實(shí)驗(yàn)過程中需要的重要儀器和重要分離方法，重注細(xì)節(jié)設(shè)計；④各小組成員通過分工合作，在規(guī)定時間內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)并達(dá)到預(yù)期目標(biāo)；⑤實(shí)驗(yàn)結(jié)束后須以組為單位，分享實(shí)驗(yàn)過程的得與失。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表達(dá)與要求

通過SDS-PAGE 蛋白電泳分析溶菌酶的提取結(jié)果，確定其蛋白分子量，同時學(xué)習(xí)使用Image J軟件分析條帶灰度，根據(jù)蛋白電泳中所用標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和條帶灰度的關(guān)系，初步推算樣品中溶菌酶的濃度；根據(jù)所得樣品的性質(zhì)選擇合適的溶菌酶酶活測定方法，計算活性溶菌酶含量、酶活以及根據(jù)總蛋白量計算最大理論回收率，并能以簇狀柱形圖或復(fù)合圖等形式展現(xiàn)溶菌酶提取量與回收率的關(guān)系，綜合分析結(jié)果；實(shí)驗(yàn)報告以研究論文的格式撰寫，重點(diǎn)包括研究進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)方法以及結(jié)果分析討論，其主要目的在于考查，①對前期準(zhǔn)備工作的完整總結(jié)；②完整真實(shí)的表述實(shí)驗(yàn)的具體過程；③根據(jù)全班結(jié)果共享，能分析各種結(jié)果產(chǎn)生的原因，從全局上分析各個方案的優(yōu)缺點(diǎn)，提出合理的設(shè)計方案和優(yōu)化方案。

3.3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

該實(shí)驗(yàn)綜合考查了學(xué)生對蛋白質(zhì)藥物的分離純化理論知識的掌握程度，和對多種純化方法的靈活運(yùn)用能力。同時也考查了學(xué)生對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析能力，①對相似方案結(jié)果分析能力的培養(yǎng)，學(xué)生4 人1組，全班通常有8～9 組，相似甚至相同的方案不可避免，學(xué)生通過比較相似/相同方案組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，探討實(shí)驗(yàn)過程中的細(xì)節(jié)和操作規(guī)范對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；②對不同方案實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析比較能力的培養(yǎng)，學(xué)生通過共享不同方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可了解提取同一種生物活性物質(zhì)有多種方案，通過不同方案實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大小的比較，可進(jìn)一步深刻理解不同因素，不同方案對生物活性物質(zhì)的提取量和活性的影響；③對結(jié)果綜合分析能力的培養(yǎng)，沒有生產(chǎn)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的學(xué)生通常只單方面追求提取量或純度，學(xué)會用綜合性思維分析問題是解決生產(chǎn)實(shí)際問題的重要原則。實(shí)驗(yàn)中學(xué)生的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方案間的巨大差異可進(jìn)一步加深學(xué)生對這一思維的理解和應(yīng)用，同時有利于培養(yǎng)學(xué)生的綜合設(shè)計能力和創(chuàng)造性思維；④通過整個實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果總結(jié)，培養(yǎng)學(xué)生科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯繎B(tài)度，啟發(fā)學(xué)生，任何不加理解、盲目機(jī)械照搬和不重視細(xì)節(jié)的研究態(tài)度都不會得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié)語

該綜合性實(shí)驗(yàn)包括文獻(xiàn)檢索，溶菌酶的制備，溶菌酶純度的定性鑒定以及酶活性檢測等內(nèi)容，涉及化學(xué)與生物多個學(xué)科的知識，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了生物分離技術(shù)中多種技術(shù)手段的靈活使用及現(xiàn)代化儀器和分析軟件的使用。生物技術(shù)、生物工程和制藥工程等專業(yè)的學(xué)生通過該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的訓(xùn)練，可以培養(yǎng)文獻(xiàn)檢索能力、學(xué)生的團(tuán)隊(duì)精神和大局觀，同時提高實(shí)驗(yàn)綜合設(shè)計能力，分析問題和解決問題的能力。通過該綜合實(shí)驗(yàn)，訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)思維和生物學(xué)思維，一方面激發(fā)學(xué)生的興趣，另一方面也為學(xué)生后期的專業(yè)方向選擇，畢業(yè)論文甚至未來的科學(xué)研究工作奠定基礎(chǔ)。