林碧霞

（華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院廣州市生物醫(yī)藥分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

0 引言

現(xiàn)代分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)是一門(mén)綜合性、應(yīng)用性強(qiáng)，且廣泛融合現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)。在很多高校的化學(xué)、環(huán)境、材料、能源、生物等專業(yè)中均開(kāi)設(shè)現(xiàn)代分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)，包括光譜分析、色譜分析、質(zhì)譜分析、能譜分析、電分析、熱分析、顯微分析等分析技術(shù)。熒光光譜法是現(xiàn)代光譜分析技術(shù)之一?，F(xiàn)行的熒光光譜實(shí)驗(yàn)中，主要是通過(guò)熒光光譜對(duì)維生素B2進(jìn)行定量分析。該實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目為傳統(tǒng)的驗(yàn)證性項(xiàng)目，主要讓學(xué)生掌握基本的熒光光譜原理和熒光光度計(jì)的使用方法，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)單，需要學(xué)生思考和探索的余地較少［1］，更沒(méi)有涉及更深一步的熒光傳感機(jī)理和目前研究前沿的熒光納米材料。

熒光納米材料由于具有良好的光學(xué)性質(zhì)、水溶性好、生物兼容性好、可功能化等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在傳感檢測(cè)、生物成像、醫(yī)學(xué)診療等方面［2-4］。硅量子點(diǎn)是近些年出現(xiàn)的一種新型熒光納米材料，其合成方法簡(jiǎn)單快速，可通過(guò)一步水熱法或者微波反應(yīng)法便可得到水溶性良好的硅量子點(diǎn)，且其熒光量子產(chǎn)率高、抗光漂白性強(qiáng)、穩(wěn)定性好［5-7］。維生素B12是一種重要的維生素，與人體的多種生命活動(dòng)息息相關(guān)，人體缺乏維生素B12會(huì)產(chǎn)生貧血、心血管疾病及神經(jīng)損傷［8］。人體缺乏維生素B12時(shí)多通過(guò)服用維生素B12藥片來(lái)補(bǔ)充。對(duì)于維生素B12的檢測(cè)，熒光光譜法已成為主要檢測(cè)方法之一［9-10］。

目前，為了培養(yǎng)創(chuàng)新型人才，越來(lái)越多的高校將成熟的科研成果引入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)與人才培養(yǎng)中［11-12］，進(jìn)行科研與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合［13］。同時(shí)，通過(guò)采取不同層次并行的策略，在加強(qiáng)學(xué)生掌握基礎(chǔ)知識(shí)的前提下，對(duì)于學(xué)有余力的學(xué)生力求多拓展學(xué)生的視野、加強(qiáng)科研能力的培養(yǎng)，加強(qiáng)創(chuàng)新思維的訓(xùn)練，從而提高學(xué)生的綜合能力。因此，為了達(dá)到該教學(xué)目的，將科研上的熒光納米材料硅量子點(diǎn)引入到熒光光譜法實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了現(xiàn)代分析技術(shù)新創(chuàng)實(shí)驗(yàn)“基于硅量子點(diǎn)的熒光光譜法測(cè)定維生素B12的含量”。其原理是利用維生素B12對(duì)硅量子點(diǎn)具有內(nèi)濾效應(yīng)，能夠靈敏猝滅硅量子點(diǎn)的熒光，從而建立猝滅型熒光光譜法對(duì)維生素B12進(jìn)行定量分析。該實(shí)驗(yàn)將科學(xué)研究中的熱點(diǎn)材料引入到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，不僅可以加深學(xué)生對(duì)儀器工作原理的理解，提高相關(guān)儀器的操作技能和動(dòng)手能力，同時(shí)能夠引導(dǎo)學(xué)生了解科學(xué)發(fā)展動(dòng)態(tài)，培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣［14-15］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

丙三醇、二水檸檬酸三鈉、無(wú)水乙醇購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。3-氨丙基三乙氧基硅烷和維生素B12購(gòu)于阿拉丁試劑公司。實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水。熒光光譜用F-4600 型熒光光譜儀（日本日立）測(cè)定。微波反應(yīng)采用XO系列超聲波微波組合反應(yīng)器（南京先歐儀器制造有限公司）。

1.2 硅量子點(diǎn)的合成

取10 mL 丙三醇溶液于三口燒瓶中，通入氮?dú)? min，除去溶液中的氧氣。加入0.316 8 g 的二水檸檬酸三鈉，攪拌均勻。再逐滴加入2.0 mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，繼續(xù)攪拌得到透明的前驅(qū)體溶液。將前驅(qū)體溶液轉(zhuǎn)移至微波反應(yīng)器中，在微波功率為400 W、微波溫度為180 ℃的條件下反應(yīng)10 min，得到暗棕色的溶液。往反應(yīng)后的溶液中按體積比為1∶25 的比例加入無(wú)水乙醇，并在6 000 r/min 下離心20 min，保留上清液為硅量子點(diǎn)溶液。

1.3 維生素B12的檢測(cè)條件優(yōu)化

取7 個(gè)干凈的5 mL容量瓶，分別加入0.50 mL 硅量子點(diǎn)溶液，2.00 mL pH 為5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0 的緩沖溶液（10 mmol），2.00 mL 濃度為50 μmol的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，并用二次水定容至5.00 mL后，在室溫下反應(yīng)3 min。隨后在激發(fā)和發(fā)射狹縫為10 nm、激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm的條件下測(cè)定各溶液在發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm的熒光強(qiáng)度。

在5 mL的容量瓶中，加入0.50 mL 硅量子點(diǎn)溶液，2.00 mL 磷酸緩沖溶液（10 mmol，pH 7.5）和2.00 mL濃度為50 μmol 的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，并用二次水定容至5.00 mL。每隔3 min 測(cè)定一次460 nm的熒光強(qiáng)度。

1.4 維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7 個(gè)干凈的5 mL容量瓶，分別加入0.50 mL 硅量子點(diǎn)溶液，2.00 mL 磷酸緩沖溶液（10 mmol，pH 7.5），0、0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00 mL濃度為50 μmol的維生素B12標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，并用二次水定容至5.00 mL后，在室溫下反應(yīng)3 min。隨后在激發(fā)和發(fā)射狹縫為10 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm的條件下測(cè)定系列溶液在發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm的熒光強(qiáng)度。以維生素B12的濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制檢測(cè)維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 維生素B12藥片的檢測(cè)

取市售維生素B12藥片，用研缽研成粉末，加水溶解后過(guò)0.22 μm的濾膜，濾液轉(zhuǎn)移到10 mL的容量瓶并用二次水定容至刻度，得到維生素B12藥片的樣品溶液。取另一個(gè)干凈的5 mL 容量瓶依次加入0.50 mL硅量子點(diǎn)溶液，2.00 mL 磷酸緩沖溶液（10 mmol，pH 7.5），1.00 mL的維生素B12樣品溶液，用二次水定容至5.00 mL后，室溫下反應(yīng)3 min。隨后測(cè)定460 nm的熒光強(qiáng)度，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中維生素B12的含量，用μg/片表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅量子點(diǎn)熒光光譜曲線的測(cè)定

首先對(duì)合成的硅量子點(diǎn)進(jìn)行光譜分析，尋找最佳的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)。如圖1 所示，固定發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm，掃描325～400 nm范圍內(nèi)的激發(fā)強(qiáng)度，得到硅量子點(diǎn)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm。反過(guò)來(lái)，固定用360 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)硅量子點(diǎn)，掃描400～550 nm范圍內(nèi)的發(fā)射強(qiáng)度，得到硅量子點(diǎn)的最佳發(fā)射波長(zhǎng)在460 nm。合成的硅量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，與維生素B12的紫外吸收（362 nm）有重疊，適合后續(xù)利用內(nèi)濾效應(yīng)的熒光猝滅機(jī)理定量檢測(cè)維生素B12。

圖1 硅量子點(diǎn)的熒光光譜曲線

2.2 維生素B12的檢測(cè)條件探究

為了獲得硅量子點(diǎn)對(duì)維生素B12的最佳響應(yīng)效果，需要對(duì)硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探究。首先對(duì)硅量子點(diǎn)測(cè)定維生素B12時(shí)的pH值進(jìn)行探究。如圖2 所示，隨著pH 從5 逐漸增加到9，測(cè)得的熒光強(qiáng)度基本變化不大。當(dāng)pH 為7.5 時(shí)，測(cè)得的熒光強(qiáng)度最小，此時(shí)維生素B12對(duì)硅量子點(diǎn)熒光的猝滅最大，因此選擇pH 為7.5 作為測(cè)定硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12的最佳pH。

圖2 pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響檢測(cè)的效果，于是對(duì)硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12時(shí)的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行探究。如圖3 所示，當(dāng)體系中加入維生素B12反應(yīng)3 min時(shí)，硅量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度已明顯下降。3 min 后熒光強(qiáng)度基本不變。因此選擇3 min作為硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12的最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

2.3 維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)上述探究，得到硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12最佳的pH是7.5，最佳反應(yīng)時(shí)間是3 min。在該測(cè)定條件下，測(cè)定硅量子點(diǎn)中加入濃度分別為0、0.5、1、5、10、15、20 μmol時(shí)，維生素B12的熒光強(qiáng)度分別為1 457、1 384、1 373、1 238、1 049、801、599。

利用該數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4 所示，隨著維生素B12濃度逐漸增大，硅量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，這是因?yàn)榫S生素B12對(duì)硅量子點(diǎn)具有內(nèi)濾效應(yīng)，能夠靈敏猝滅硅量子點(diǎn)的熒光。當(dāng)維生素B12濃度在0.5～20 μmol范圍內(nèi)時(shí)，硅量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與維生素B12的濃度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程F=-41.32C+1 433（C：μmol），相關(guān)系數(shù)為R2=0.995 4。

圖4 硅量子點(diǎn)測(cè)定維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 維生素B12藥片的檢測(cè)

按照前述的實(shí)驗(yàn)操作步驟制備維生素B12藥片的樣品溶液并進(jìn)行熒光光譜測(cè)定，測(cè)得的熒光強(qiáng)度代入上述檢測(cè)維生素B12的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到維生素B12藥片中維生素B12的含量為978 μg/片，與標(biāo)示的含量（1 000 μg/片）接近，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

該實(shí)驗(yàn)選擇了與人們健康息息相關(guān)的維生素B12作為檢測(cè)對(duì)象，并選擇了典型的熒光納米材料硅量子點(diǎn)作為檢測(cè)手段，檢測(cè)原理簡(jiǎn)單易懂又具有代表性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好，適用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。此外，將該實(shí)驗(yàn)作為現(xiàn)代分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)的一個(gè)新創(chuàng)實(shí)驗(yàn)，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)?zāi)苡?xùn)練學(xué)生的科研思路和創(chuàng)新意識(shí)［16-17］。在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)要注意以下幾個(gè)問(wèn)題：

（1）本實(shí)驗(yàn)包括了熒光納米材料硅量子點(diǎn)的合成和熒光光譜法檢測(cè)維生素B12兩部分，共需4 學(xué)時(shí)。學(xué)生通過(guò)動(dòng)手操作合成熒光硅量子點(diǎn)，可以了解熒光納米材料的基本合成方法，并重點(diǎn)掌握其微波合成方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)熒光材料進(jìn)行熒光光譜表征，加深學(xué)生對(duì)熒光產(chǎn)生機(jī)理的理解。學(xué)生利用合成的硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12，可以了解常見(jiàn)的熒光檢測(cè)機(jī)理和熒光光譜法的基本操作。本實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)緊扣實(shí)驗(yàn)具體內(nèi)容和具體環(huán)節(jié)，從合成到性質(zhì)表征再到應(yīng)用，環(huán)環(huán)相扣，逐步深入，可以使學(xué)生更加深入地理解熒光的產(chǎn)生機(jī)理，表現(xiàn)和影響因素［18］。實(shí)驗(yàn)過(guò)程可以采取學(xué)生單獨(dú)完成，也可以采取小組合作的形式。

（2）由于大多本科生沒(méi)有接觸熒光納米材料，對(duì)熒光檢測(cè)機(jī)理也缺乏相關(guān)理論知識(shí)。為了幫助學(xué)生更好地理解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)前教師可以先提供一些有關(guān)熒光納米材料、熒光檢測(cè)機(jī)理研究的資料，讓學(xué)生閱讀資料，進(jìn)行預(yù)習(xí)，儲(chǔ)備相關(guān)知識(shí)，才能更規(guī)范地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。其中熒光納米材料的相關(guān)資料可以包括半導(dǎo)體量子點(diǎn)、熒光碳基納米材料、金屬納米簇、上轉(zhuǎn)換納米粒子等。熒光檢測(cè)機(jī)理可以包括內(nèi)濾效應(yīng)、熒光能量轉(zhuǎn)移、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移等。

（3）可以將硅量子點(diǎn)檢測(cè)維生素B12的條件設(shè)計(jì)成探究性環(huán)節(jié)，教師不要將摸索好的檢測(cè)條件提供給學(xué)生，而是讓學(xué)生自己設(shè)計(jì)方案探討最佳的熒光檢測(cè)條件，多給學(xué)生思考和解決問(wèn)題的機(jī)會(huì)。

（4）由于維生素B12在362 nm 處具有較強(qiáng)的吸收，可以利用紫外分光光度法測(cè)定維生素B12的含量。但和熒光光譜法相比，熒光光譜法的靈敏度更高，受干擾更小。因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，可以將該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步擴(kuò)展為綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)“兩種方法（紫外分光光度法和熒光光譜法）測(cè)定維生素B12藥片的含量”，然后對(duì)比兩種方法對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果，加深對(duì)兩種方法靈敏度的理解。