孫金梅，張振偉，鐘 浪，楊 飛

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130000；2.西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝860000；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

犬瘟熱（canine distemper，CD）屬于麻疹病毒屬，又稱為犬麻疹病毒，容易造成動(dòng)物機(jī)體多種器官系統(tǒng)相互傳染，是一種高接觸性、致死性的包膜RNA病毒疾病[1]，主要感染犬科[2]、野生食肉動(dòng)物[3-4]、貓科動(dòng)物和浣熊科動(dòng)物[5]等。犬科動(dòng)物一旦感染，致死率高達(dá)30%~80%[6]。犬瘟熱病毒（CDV）分為肺炎型、消化道型、神經(jīng)型及皮膚型，嚴(yán)重威脅寵物犬的健康。

GICA檢測(cè)法即膠體金免疫層析法[7]，將抗原或抗體固定在微孔濾膜上，膠體金指示劑作為顯色劑與其直接反應(yīng)，繼而出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的顏色變化，以達(dá)到檢測(cè)病原的目的[8-9]。該檢測(cè)法具有簡(jiǎn)單快捷、低成本、特異性好的優(yōu)點(diǎn)[10-11]，是現(xiàn)在各類醫(yī)院使用最普遍的疾病檢測(cè)方法[12]。

ELISA檢測(cè)法即酶聯(lián)免疫吸附法。該技術(shù)將抗原或抗體固定在酶標(biāo)板表面，使用酶標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，使其在酶標(biāo)板表面與檢測(cè)樣品發(fā)生顯色反應(yīng)，最后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，以達(dá)到檢測(cè)病原的目的[13]。該檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、低成本、精準(zhǔn)度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)[14]，是實(shí)驗(yàn)室最普遍使用的檢測(cè)方法之一[15]。

通過(guò)GICA、ELISA兩種檢測(cè)方法檢測(cè)湖南省長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)5家寵物醫(yī)院所收治的寵物犬犬瘟熱病病發(fā)情況，為該地區(qū)犬瘟熱的預(yù)防及治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

調(diào)查時(shí)間：2020年3月12日~2020年4月12日。

調(diào)查醫(yī)院：湖南省長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)5家寵物醫(yī)院，簡(jiǎn)稱A、B、C、D、E醫(yī)院。各醫(yī)院樣品采集情況見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)材料

10 mL真空采血管（EDTA）、一次性采血針，均購(gòu)自廣州邦標(biāo)醫(yī)療器械有限公司；犬瘟熱/犬副流感病抗原雙聯(lián)檢測(cè)卡購(gòu)自上海八通生物科技股份有限公司；犬瘟熱病毒（CDV）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海遠(yuǎn)研生物科技有限公司；100 mL PBS緩沖液。

100 mL PBS緩沖液的配制：量取90 mL雙蒸水，加入100 mL容量瓶中，稱取0.8 g氯化鈉、0.02 g氯化鉀、0.115 g無(wú)水磷酸氫二鈉、0.156 g二水磷酸二氫鈉、0.02 g磷酸二氫鉀加入該容量瓶，定容至100 mL。

血清的制備：將采集到的血液樣品放置于常溫下20~30 min，血液自然凝固析出血清。

1.3 儀器設(shè)備

BCD-230SDCY冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)購(gòu)自金壇市鴻科儀器廠；DNM-9602酶標(biāo)分析儀購(gòu)自北京普朗新技術(shù)有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水儀購(gòu)自默瑞（上海）生物科技有限公司；AR2130電子天平購(gòu)自金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 GICA檢測(cè)

使用樣品稀釋液稀釋樣品，再使用滴管將稀釋后的樣品取3~4滴，逐滴滴入指示卡的加樣窗中，反應(yīng)5~10 min，依據(jù)犬瘟熱/犬副流感病抗原雙聯(lián)檢測(cè)卡的判斷指標(biāo)判定犬瘟熱感染結(jié)果，并記錄。

1.4.2 ELISA檢測(cè)

將酶標(biāo)板各孔標(biāo)記，設(shè)置陰、陽(yáng)、空白對(duì)照組各2孔，使用PBS液對(duì)血清樣品進(jìn)行稀釋，參照犬瘟熱病毒ELISA檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)依次對(duì)稀釋樣品進(jìn)行加樣→溫育→洗滌→加酶→溫育→洗滌→顯色→終止反應(yīng)等步驟，在酶標(biāo)分析儀上使用450 nm的波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度，觀察記錄，并分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，參照說(shuō)明書(shū)判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼻黏液和血液樣品GICA檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表1、表2）

表1 鼻黏液樣品GICA檢測(cè)結(jié)果Tab.1 GICA results of nasal mucus samples

由表1可知，5家寵物醫(yī)院206只寵物犬鼻黏液樣品犬瘟熱檢出率為46.60%，其中A醫(yī)院檢出率為32.43%，B醫(yī)院檢出率為66.07%，C醫(yī)院檢出率為54.55%，D醫(yī)院檢出率為50.00%，E醫(yī)院檢出率為32.79%。

表2 血液樣品GICA檢測(cè)結(jié)果Tab.2 GICA results of blood samples

由表2可知，5家寵物醫(yī)院206只寵物犬血液樣品犬瘟熱檢出率為48.54%，其中A醫(yī)院檢出率為32.43%，B醫(yī)院檢出率為67.86%，C醫(yī)院檢出率為59.09%，D醫(yī)院檢出率為53.33%，E醫(yī)院檢出率為34.43%。

2.2 鼻黏液和血液樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)表3、表4）

由表3可知，5家寵物醫(yī)院206只寵物犬鼻黏液樣品犬瘟熱檢出率為49.51%，其中A醫(yī)院檢出率為37.84%，B醫(yī)院檢出率為67.86%，C醫(yī)院檢出率為59.09%，D醫(yī)院檢出率為53.33%，E醫(yī)院檢出率為34.43%。

表3 鼻黏液樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果Tab.3 ELISA results of nasal mucus samples

由表4可知，5家寵物醫(yī)院206只寵物犬血液樣品犬瘟熱檢出率為54.37%，其中A醫(yī)院檢出率為40.54%，B醫(yī)院檢出率為75.00%，C醫(yī)院檢出率為68.18%，D醫(yī)院檢出率為53.33%，E醫(yī)院檢出率為39.34%。

表4 血液樣品ELISA檢測(cè)結(jié)果Tab.4 ELISA results of blood samples

2.3 各型犬瘟熱發(fā)病及治愈結(jié)果（見(jiàn)表5）

表5 各型犬瘟熱發(fā)病及治愈結(jié)果Tab.5 Incidence and cure results of canine distemper 單位：%

由表5可知，采用ELISA檢測(cè)血液樣品，5家寵物醫(yī)院206只寵物犬各類型犬瘟熱的檢出率為54.36%、治愈率為74.11%、死亡率為25.89%。其中，肺炎型檢出率為33.93%、消化道型檢出率為48.21%、神經(jīng)型檢出率為7.14%、皮膚型檢出率為10.71%；肺炎型治愈率為71.05%、消化道型治愈率為87.04%、神經(jīng)型治愈率為12.50%、皮膚型治愈率為66.67%；肺炎型死亡率為28.95%、消化道型死亡率為12.96%、神經(jīng)型死亡率為87.50%、皮膚型死亡率為33.33%。

3 討論

犬瘟熱作為一種高致病性傳染性疾病[16]，少數(shù)病犬表征明顯（皮膚型），多數(shù)通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺部，使其發(fā)生炎癥（肺炎型），隨后侵染呼吸道相鄰的組織器官，如腸道、肝臟等（消化道型），少數(shù)病原還可以感染神經(jīng)元（神經(jīng)型）。其中,皮膚型、肺炎型、消化道型的治愈率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于神經(jīng)型[17]。

犬瘟熱在美國(guó)、澳大利亞[18]、韓國(guó)[19]、巴西[20]、不丹[21]、坦桑尼亞[22]及中國(guó)[23]等都有不同程度的大流行，多種動(dòng)物如犬、海獺、貓、獅子、土狼、浣熊等均會(huì)被其感染。根據(jù)犬瘟熱類型的不同，成年犬科動(dòng)物一旦感染，致死率可達(dá)30%~80%，幼年動(dòng)物致死率甚至高達(dá)80%~90%[24]，是一種寵物犬養(yǎng)殖過(guò)程中不可忽視的疾病。盡管近年來(lái)在寵物犬上廣泛使用疫苗進(jìn)行預(yù)防，但防治效果卻并不理想。其原因可能是犬瘟熱病毒是一種單鏈RNA病毒，由于RNA單鏈結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，導(dǎo)致其很容易發(fā)生變異[25]。因此，為了解湖南省長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)寵物犬的犬瘟熱的流行及治療情況，本研究通過(guò)對(duì)該地區(qū)5家動(dòng)物醫(yī)院進(jìn)行為期一個(gè)月的走訪調(diào)查、定點(diǎn)采樣來(lái)收集樣品，再以GICA檢測(cè)法、ELISA檢測(cè)法獲得寵物犬犬瘟熱流行情況。結(jié)果表明，ELISA檢出率比GICA檢出率高，與秦鳳英[26]在2014年使用GICA檢測(cè)法與ELISA檢測(cè)法檢測(cè)梅毒特異性抗體的所表現(xiàn)的差異性相同。GICA檢測(cè)法表現(xiàn)出更高的靈敏性，與王逸群等[27]在2018年使用GICA檢測(cè)法與ELISA檢測(cè)法檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體所表現(xiàn)出的靈敏性相同。所以，本研究使用GICA檢測(cè)法與ELISA檢測(cè)法檢測(cè)犬瘟熱病毒的結(jié)果是可信的。

利用兩種方法檢測(cè)出來(lái)的犬瘟熱感染率在48.54%~54.36%，明顯高于趙九州等[28]在2019年調(diào)查大熊貓自然保護(hù)區(qū)（栗子坪）周邊區(qū)域的犬瘟熱感染率（4.7%），也明顯高于陳秀[29]在2012年在菏澤地區(qū)調(diào)查的犬瘟熱流行情況（27.8%），與張昕等[30]在2018年成都地區(qū)的犬瘟熱感染率50.71%相似。本研究調(diào)查的地點(diǎn)為5家寵物醫(yī)院，而一般只有在寵物患病的情況才會(huì)送來(lái)醫(yī)院治療，造成本次調(diào)研結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。本研究所采集的樣品均來(lái)源于湖南省長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)，只有206只寵物犬，其橫向空間不夠廣、數(shù)據(jù)量不夠多。本研究開(kāi)展時(shí)間正值春季，其檢測(cè)結(jié)果也與張昕等[30]所統(tǒng)計(jì)的春季犬瘟熱病毒的檢出率56.19%相似。所以，本次針對(duì)長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)的犬瘟熱檢測(cè)結(jié)果具有相當(dāng)?shù)目尚哦?。本次調(diào)研所有患病犬的治愈率為74.11%，致死率為25.89%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于白建等[31]在2012年統(tǒng)計(jì)犬瘟熱的致死率（93%），與李昊洋[32]于2017年所做的犬瘟熱防疫與治療方案研究結(jié)果相似（75%）。出現(xiàn)這種現(xiàn)狀的原因是近年來(lái)對(duì)犬瘟熱的治療研究更加成熟，李昊洋[32]對(duì)該疾病治療方案的不斷探索，才使得該地區(qū)治愈率如此高。

4 結(jié)論

綜上所述，湖南省長(zhǎng)沙市芙蓉區(qū)的寵物犬犬瘟熱的病發(fā)率以使用ELISA檢測(cè)血液樣本為準(zhǔn)為54.36%，治愈率為74.11%，死亡率為25.89%。本次調(diào)研為該地區(qū)此類疾病的流行情況及治愈情況調(diào)查提供參考。