陳夢閣，李新，張旭，王曉岑，孫智超，張西臣，宮鵬濤，李建華

(吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062)

新孢子蟲是近年來發(fā)現(xiàn)的一種在細胞內(nèi)寄生的頂復門原蟲，主要是犬新孢子蟲(Neosporacaninum)，其可感染多種動物，引起牛、羊等中間宿主的生殖障礙等疾病，以及犬科動物等終末宿主的神經(jīng)紊亂，導致幼畜運動障礙、腦膜炎等疾病。新孢子蟲病呈世界性分布，已有40多個國家發(fā)現(xiàn)了新孢子蟲，美國、澳大利亞等國奶牛和肉牛新孢子蟲感染率一般為10%～82%，我國奶牛新孢子蟲感染率平均為20%～25%，據(jù)統(tǒng)計新孢子蟲病每年給世界經(jīng)濟造成約5.5億美金的損失，其中養(yǎng)牛業(yè)損失最大[1]。新孢子蟲能夠主動侵入包括免疫細胞在內(nèi)的多種宿主細胞，具有激活宿主細胞模式識別受體和相應通路的保守成分，引起機體的免疫應答。因此，探究新孢子蟲自身成分對宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)功能，有助于找到防控新孢子蟲病的新靶點。

果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose-1,6-biphosphatase, FBPase)是糖異生的關鍵調(diào)節(jié)酶，在生物的代謝及發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用[2]。在寄生蟲FBPase研究方面，曼氏血吸蟲FBPase參與糖異生，為寄生蟲的生長提供能量[3]。利什曼原蟲FBPase通過參與還原型輔酶Ⅱ合成來保護大鼠視網(wǎng)膜免受活性氧的侵害[4]。利什曼原蟲FBPase是蟲體的毒力因子，F(xiàn)BPase缺失使利什曼原蟲致病性降低[5]。華支睪吸蟲FBPase聚集在人類肝星狀細胞LX-2膜上，并促進LX-2細胞的增殖和活化，上調(diào)α-平滑肌肌動蛋白、I型膠原蛋白和III型膠原蛋白等關鍵纖維化因子，導致肝臟纖維化[6]。同時，F(xiàn)BPase在多種疾病發(fā)生中起關鍵作用，如在胰腺癌中，F(xiàn)BPase可以通過阻斷IQ結構域三磷酸鳥苷合酶-激活蛋白1-絲裂原活化蛋白激酶(IQGAP1-MAPK)相互作用，抑制細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)激活[7]。然而，關于新孢子蟲FBPase蛋白的功能及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究尚未見報道。

本研究利用原核表達系統(tǒng)獲得NcFBPase重組蛋白(rNcFBPase)，對NcFBPase蛋白進行了免疫調(diào)節(jié)研究，發(fā)現(xiàn)rNcFBPase通過激活小鼠腹腔巨噬細胞的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶B(AKT)信號通路誘導白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-12(IL-12)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)細胞因子的分泌，為后續(xù)研究NcFBPase蛋白的免疫功能及宿主抗新孢子蟲免疫機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲體、細胞和試驗動物

新孢子蟲速殖子Nc-1株、Vero細胞均由本實驗室凍存。6～8周齡野生型C57BL/6雌鼠購自遼寧長生實驗動物中心。

1.2 主要試劑

RPIM-1640培養(yǎng)基與胎牛血清，購自Biological公司；青鏈霉素、20×PBS、氨芐青霉素、IPTG誘導劑、PCR產(chǎn)物回收試劑盒，購自上海生物工程有限公司；巰基乙酸培養(yǎng)基，購自BD Biosciences公司；反轉錄試劑盒、Primer star Mix、T4連接酶、EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶，購自TaKaRa公司；pGEX-4T-1表達載體為實驗室凍存；大腸桿菌感受態(tài)DH-5α、BL21(DE3)和GST蛋白純化填料，購自全式金公司；質(zhì)粒小提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自天根生物公司；Triton X-114、P38/ERK/AKT抑制劑，購自Sigma公司；內(nèi)毒素檢測試劑盒，購自GenScript公司；RIPA細胞裂解液，購自碧云天公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒，購自Thermo公司；P-p38、p38、P-ERK1/2、ERK1/2、P-AKT、AKT和GAPDH抗體，購自Abcam公司；羊抗兔IgG-HRP，購自Proteintech公司；小鼠IL-6、IL-12、TNF-α細胞因子檢測試劑盒，購自Thermo Scientific公司。

1.3 細胞及新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)

1.3.1 Vero細胞的培養(yǎng)

將凍存的Vero細胞放入37 ℃水浴鍋中使其解凍，轉移至細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用含5%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基置于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待其長滿后進行傳代。

1.3.2 新孢子蟲速殖子的培養(yǎng)

將新孢子蟲接種于Vero細胞中進行培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含有2%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基，于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，每天更換培養(yǎng)基，待新孢子蟲從細胞中完全逸出后，吸出1 mL進行傳代培養(yǎng)，其余蟲體用Percoll法純化待用。

1.3.3 小鼠腹腔巨噬細胞(PMs)的分離及培養(yǎng)

用3 mL巰基乙酸培養(yǎng)基對小鼠進行腹腔注射，3～4 d后安樂處死小鼠，置于75%酒精中浸泡10 min，隨后在無菌條件下進行PMs的分離。用10 mL的注射器將適量1×PBS注入小鼠腹腔內(nèi)隨后吸出放于50 mL離心管，2 000 r/min離心10 min，用1 mL培養(yǎng)基重懸PMs，計數(shù)后按照需要鋪于細胞培養(yǎng)板，用添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素的RPIM-1640培養(yǎng)基于37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 NcFBPase的克隆、表達和純化

根據(jù)NcFBPase基因序列和原核表達載體pGEX-4T-1的多克隆位點設計引物，NcFBPase-F:5′-GGAATTCATGGCGACAAATGCACAGC-3′和NcFBPase-R:5′-CCTCGAGCTACGCGTTGTTAGTACCCA-3′，引物由庫美生物科技有限公司合成。以新孢子蟲cDNA為模板，PCR擴增NcFBPase基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對所擴增的NcFBPase基因進行純化。將NcFBPase基因的純化產(chǎn)物和pGEX-4T-1質(zhì)粒用EcoRⅠ和XhoⅠ快切酶進行37 ℃酶切20 min，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后利用T4連接酶于4 ℃過夜連接；將連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌感受態(tài)DH-5α中，37 ℃搖床培養(yǎng)1 h后涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)；挑取單菌落進行PCR驗證，對陽性菌液擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，進行雙酶切鑒定并送庫美生物科技有限公司進行測序。將pGEX-4T-1空載質(zhì)粒及pGEX-4T-1-NcFBPase重組質(zhì)粒轉入BL21感受態(tài)細胞，挑取單菌落于6 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)；菌液按1∶100的比例轉接于300 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)中，37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600值約為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37 ℃ 140 r/min誘導表達5 h；隨后將誘導表達的菌液8 000 r/min離心10 min，1×PBS重懸菌體，超聲破碎，再次離心分離沉淀和上清，同時收集誘導表達的空載體、未誘導的菌液作為陰性對照，菌液經(jīng)制樣后通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色進行可溶性分析，隨后用GST蛋白純化填料對目的蛋白進行純化。

1.5 rNcFBPase蛋白內(nèi)毒素的去除及含量檢測

將終濃度為1%的Triton X-114加入到rNcFBPase蛋白液中，劇烈振蕩，冰上放置10 min，隨后37 ℃水浴鍋中放置10 min；然后將樣品12 000 r/min離心10 min，吸取上層水相。將上述過程重復3次，收集含有蛋白質(zhì)的上層水相。

按照說明書步驟，使用ToxinSensorTM顯色LAL內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測rNcFBPase蛋白中的內(nèi)毒素含量。蛋白經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌，取部分測蛋白濃度，剩余蛋白保存在-80 ℃的冰箱內(nèi)。

1.6 小鼠腹腔巨噬細胞活力的檢測

將小鼠PMs以1×104的密度鋪于96孔板中培養(yǎng)6 h，分別用PBS和濃度為12.5、25、50、100、200 μg/mL的rNcFBPase刺激PMs 24 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后在450 nm波長處測定吸光值。

1.7 Western blot檢測

將小鼠PMs以3×106個細胞/孔的密度鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，待其貼壁后，用PBS、終濃度為50 μg/mL的GST和rNcFBPase孵育細胞0.5、1、2、4、6 h。收取全細胞裂解液，使用BCA試劑盒檢測蛋白含量；每孔上樣30 μg，SDS-PAGE進行蛋白分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別4 ℃過夜孵育兔抗P-p38(1∶1 000)、兔抗總p38(1∶1 000)、兔抗P-ERK1/2(1∶1 000)、兔抗總ERK1/2(1∶1 000)、兔抗P-AKT(1∶1 000)、兔抗總AKT(1∶1 000)和兔抗GAPDH(1∶1 000)；TBST洗膜4次，10 min/次；羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜4次，10 min/次；膜通過增強化學發(fā)光液(ECL)顯色后經(jīng)Western blot檢測系統(tǒng)進行蛋白檢測，Image J進行灰度分析。

1.8 ELISA檢測

將小鼠PMs以5×105細胞/孔的密度鋪于24孔細胞培養(yǎng)板，待其貼壁后，用p38抑制劑(SB203580，30 mmol/L)、ERK抑制劑(PD98059，40 mmol/L)、AKT抑制劑(IV，10 mmol/L)或DMSO預處理PMs 1 h，再用rNcFBPase進行孵育細胞24 h，隨后收集上清并用細胞因子ELISA檢測試劑盒檢測IL-6、IL-12和TNF-α水平。具體操作參照試劑盒中說明書。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗進行3次重復，采用SPSS軟件對組內(nèi)數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。數(shù)據(jù)使用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 NcFBPase基因的擴增、重組質(zhì)粒的構建及重組蛋白的表達

瓊脂糖凝膠電泳結果顯示NcFBPase基因擴增產(chǎn)物大小約為1 050 bp，與預期目的基因片段大小相一致(圖1A)。重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結果表明，酶切產(chǎn)物大小與基因預期大小相符合(圖1B)。以上結果表明成功構建了pGEX-4T-1-NcFBPase重組質(zhì)粒。誘導表達后，考馬斯亮藍染色顯示rNcFBPase在上清和沉淀均有表達(圖1C)，并用GST填料純化rNcFBPase，成功獲得大小為65 ku的rNcFBPase(圖1D)。

2.2 rNcFBPase對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響

采用CCK-8法檢測rNcFBPase對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響，確定其最適刺激濃度。與空白組相比，rNcFBPase組在低于50 μg/mL的濃度下對細胞活力無影響(P>0.05)，而在100和200 μg/mL的濃度下，細胞活力極顯著降低(P<0.01)。因此，rNcFBPase對小鼠腹腔巨噬細胞作用的適宜濃度為50 μg/mL(圖2)。

2.3 rNcFBPase激活MAPK信號通路促進炎性細胞因子表達

為探討NcFBPase能否激活MAPK信號通路，采用Western blot檢測p38和ERK的磷酸化水平，并進行灰度分析。結果顯示，與對照組相比，rNcFBPase刺激PMs引起p38和ERK的磷酸化，p38(2 h)和ERK(4 h)的磷酸化水平達到峰值，之后隨時間的延長蛋白磷酸化水平恢復正常(圖3A、3B、3C)，表明rNcFBPase可以激活小鼠巨噬細胞MAPK信號通路。

A.PCR產(chǎn)物電泳圖：M.DNA分子量；1.NcFBPasePCR產(chǎn)物；

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。下同

為了進一步研究rNcFBPase通過MAPK信號通路對細胞因子的影響，采用ELISA檢測IL-6、IL-12和TNF-α細胞因子的分泌量。結果顯示，與空白組及DMSO組相比，rNcFBPase組IL-6、IL-12和TNF-α細胞因子的分泌量顯著升高。與rNcFBPase組相比，SB203580預處理組IL-6分泌量降低約1.5倍(P<0.01，圖3D)，IL-12的分泌量降低約2倍(P<0.01，圖3E)，TNF-α 的分泌量降低約1.7倍(P<0.001，圖3F)；PD98059預處理組IL-6分泌量降低約1.5倍(P<0.05，圖3D)，IL-12的分泌量降低約2.2倍(P<0.001，圖3E)，TNF-α的分泌量降低約1.7倍(P<0.001，圖3F)。阻斷MAPK信號通路后，rNcFBPase介導的細胞因子產(chǎn)生減少，表明rNcFBPase通過MAPK信號通路調(diào)控宿主細胞炎性細胞因子產(chǎn)生。

2.4 rNcFBPase激活AKT信號通路促進炎性細胞因子表達

為探討NcFBPase是否激活AKT信號通路，采用Western blot檢測rNcFBPase刺激小鼠PMs不同時間點時AKT蛋白的磷酸化水平。如圖所示，AKT自1 h起磷酸化水平升高，4 h達到峰值，隨后AKT蛋白磷酸化水平隨時間增加逐漸降低，表明NcFBPase蛋白可以激活AKT信號通路(圖4A、4B)。

為了探討rNcFBPase誘導的細胞因子分泌是否與AKT相關。ELISA結果顯示，與rNcFBPase組相比，IV預處理組IL-6分泌量降低約1.8倍(P<0.01，圖4C)，IL-12的分泌量降低約1.9倍(P<0.001,圖4D)，TNF-α的分泌量降低約1.6倍(P<0.001，圖4E)。表明NcFBPase可通過激活AKT通路誘導炎性細胞因子的分泌。

3 討論

FBPase參與多種細胞的代謝和發(fā)育，具有促進細胞生長、分化和抑制腫瘤細胞生長等多方面作用。在干細胞中，F(xiàn)BPase主要用于提供NADPH，對L-賴氨酸的產(chǎn)生具有重要作用，且外源FBPase的過表達能加速干細胞生長[8]。在心肌細胞、平滑肌細胞和衛(wèi)星細胞中，F(xiàn)BPase存在于細胞核內(nèi)，參與細胞分化。而在肝細胞中，F(xiàn)BPase通過調(diào)節(jié)鈣離子參與糖異生[9]。在絲狀真菌中，F(xiàn)BPase的磷酸酶結構域突變引起替代氧化酶的轉錄激活和糖異生途徑[10]。對寄生蟲FBPase研究發(fā)現(xiàn)，曼氏血吸蟲FBPase參與糖異生，與蟲體生長有關[3]；利什曼原蟲FBPase是蟲體的毒力因子[5]；華支睪吸蟲FBPase是致宿主肝臟纖維化的分子[6]。最近研究發(fā)現(xiàn)FBPase在多種癌癥發(fā)生中起作用，如在前列腺癌中，F(xiàn)BP1抑制癌細胞增殖、降低遷移速度和侵襲能力，且siRNA-FBP1通過提高波形蛋白的表達，激活MAPK信號通路，從而加速癌細胞的上皮細胞間質(zhì)轉型[11]。乳腺癌中FBPase調(diào)節(jié)Wnt/β-Catenin通路[12]。本實驗室前期對新孢子蟲胞外囊泡進行蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)新孢子蟲胞外囊泡中存在FBPase[13]，而關于NcFBPase的功能尚不清楚。本研究確定NcFBPase蛋白調(diào)控小鼠巨噬細胞信號通路和細胞因子分泌，表明該蛋白與蟲體誘導宿主免疫應答有關。

A.p38和ERK的磷酸化水平；B、C.灰度分析；D.IL-6表達；E.IL-12表達；F.TNF-α表達。B、C圖中僅與對照組比較差異顯著性

A.AKT的磷酸化水平；B.灰度分析；C.IL-6表達；D.IL-12表達；E.TNF-α表達。B圖中僅與對照組比較差異顯著性

目前研究發(fā)現(xiàn)，新孢子蟲及蟲體蛋白能夠誘導宿主細胞產(chǎn)生多種細胞因子。新孢子蟲感染導致了宿主Th細胞的分化，刺激宿主產(chǎn)生IL-6、IL-12、IFN-γ和INF-α等T淋巴細胞1(Th1)型細胞因子反應，同時引起氧自由基、一氧化氮及其代謝物的產(chǎn)生，這些細胞因子對新孢子蟲均具有殺傷作用[14]。冷滅活的新孢子蟲能夠誘導強烈的IL-12、IFN-γ和INF-α的分泌，促使Th1型免疫應答，而熱滅活的新孢子蟲無此效應[15]。目前已報道新孢子蟲蟲體蛋白與宿主細胞因子的分泌相關。棒狀體蛋白5、棒狀體蛋白16和致密顆粒蛋白7參與調(diào)控宿主巨噬細胞IFN-γ的分泌及其下游細胞免疫因子GBP1的表達[16-17]。棒狀體蛋白16促進新孢子蟲對宿主細胞信號轉導和轉錄激活因子3的激活[17]。14-3-3蛋白參與調(diào)控小鼠腹腔巨噬細胞IL-6、IL-12和INF-α的分泌[13]。新孢子蟲表面蛋白(SRS2)和表面抗原1(SAG1)重組蛋白可激發(fā)機體產(chǎn)生Th1型和Th2型免疫反應，誘導宿主IFN-γ和IL-4的分泌[18]。本研究發(fā)現(xiàn)rNcFBPase可以促進小鼠巨噬細胞IL-6、IL-12和TNF-α的表達。

MAPK通路能被多種因子激活，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和發(fā)育，還能夠調(diào)節(jié)Th1免疫反應相關的炎性細胞因子分泌，進而影響宿主對寄生蟲感染的免疫應答[19]。在新孢子蟲和弓形蟲感染中，巨噬細胞通過激活p38 MAPK信號通路介導IL-12的產(chǎn)生，抑制蟲體增殖[20]。弓形蟲的GRA24蛋白從囊泡運輸?shù)剿拗骷毎丝捎|發(fā)宿主細胞p38 MAPK的磷酸化[21]。新孢子蟲以及蟲體蛋白(全蟲蛋白、分泌抗原和胞外囊泡)能夠激活小鼠PMs中MAPK和NF-κB通路[13]。已報道胰腺癌和前列腺癌細胞中的FBPase也參與調(diào)控MAPK信號通路[7.11]。但NcFBPase是否參與調(diào)控MAPK信號通路尚無報道。本研究用rNcFBPase刺激小鼠PMs，發(fā)現(xiàn)p38和ERK均發(fā)生磷酸化。而p38和ERK通路抑制劑預處理小鼠PMs，能顯著抑制由rNcFBPase誘導的IL-6、IL-12和TNF-α分泌。以上這些結果說明NcFBPase通過激活MAPK信號通路調(diào)節(jié)巨噬細胞炎性細胞因子分泌。

最近研究發(fā)現(xiàn)新孢子蟲的全蟲蛋白以及胞外囊泡也能激活宿主細胞AKT信號通路，誘導IL-6和IL-12產(chǎn)生[13]。但FBPase是否與AKT通路的激活相關尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)rNcFBPase能誘導小鼠PMs中AKT蛋白的磷酸化。用AKT通路的抑制劑IV預處理細胞能顯著降低由rNcFBPase誘導的IL-6、IL-12和TNF-α的分泌量。以上結果表明NcFBPase可通過激活AKT通路誘導細胞因子的分泌。

綜上，本研究表達rNcFBPase蛋白，并探究rNcFBPase與宿主信號通路和細胞因子之間的關系，發(fā)現(xiàn)rNcFBPase可以激活小鼠腹腔巨噬細胞的MAPK和AKT信號通路，并誘導IL-6、IL-12和TNF-α的分泌，為進一步揭示宿主抗新孢子蟲感染免疫應答機制提供依據(jù)。