陳佳靜，李彤彤，張則，盧安然，李陳飛，馮秀麗

(南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物細菌學重點實驗室/教育部“動物健康與食品安全”國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 南京 210095)

法氏囊是禽類中樞體液免疫器官。法氏囊源活性分子發(fā)揮了多種功能，如免疫調(diào)節(jié)[1-3]、促進B細胞分化[4-5]、抗氧化[6]及抗腫瘤[7-8]等功能。前期研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊源活性分子法氏囊五肽(BPP-I、BPP-IV)來源于同一種蛋白分子，即Cbl(Casitas b-lineage lymphoma)[9]。Cbl蛋白家族是具有Ring Finger結(jié)構(gòu)域的一種泛素化激酶(E3)。哺乳動物細胞中存在3種Cbl亞型，分別為c-Cbl，Cbl-b和Cbl-3[10]。Cbl-b蛋白可以通過充當銜接蛋白來調(diào)節(jié)細胞活化。在免疫系統(tǒng)中，Cbl-b可通過調(diào)節(jié)T細胞，B細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)激活途徑在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Cbl編碼906個氨基酸的多結(jié)構(gòu)域蛋白c-Cbl，其主要功能是調(diào)節(jié)酪氨酸激酶[12]。c-Cbl是一種120 kDa的蛋白質(zhì)，包含1個變異的SH2結(jié)構(gòu)域，1個RING結(jié)構(gòu)域，1個富含脯氨酸的區(qū)域和1個與泛素(Ub)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，與活性血小板衍生的生長因子、表皮生長因子和集落刺激因子-1受體結(jié)合并刺激其泛素化[13]。有研究表明，在P-選凝素活化β2整合素的信號通路中，存在有c-Cbl泛素化激酶介導的負反饋調(diào)控過程[14]，說明c-Cbl蛋白在炎癥反應(yīng)方面有著精細的調(diào)控作用。最近有研究表明，c-Cbl可以作為E3分子調(diào)控維甲酸誘導基因I(retinoic acid inducible-gene I, RIG-I)、干擾素調(diào)節(jié)因子8 (IRF8)等分子泛素化，與細胞Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生以及抗病毒反應(yīng)有密切的關(guān)系[15]。

自1992年在中國發(fā)現(xiàn)甲型H9N2流感病毒以來，已給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟損失[16-17]。前期研究發(fā)現(xiàn)，重組表達的Cbl能夠抑制H9N2亞型禽流感病毒(AIV)復制[18]，說明該蛋白具有一定的抗病毒復制功能。有文獻報道，H9N2作為一種臨床上常見的AIV亞型，為多種AIV亞型提供了基因片段，具有重要的公共衛(wèi)生意義[19]。基于此，本研究以人源細胞A549為宿主細胞模型，開展Cbl蛋白表達對H9N2亞型AIV增殖的影響研究。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及細胞

人肺腺癌細胞(A549)由本實驗室保存，采用含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。AIV毒株A/chicken/Shandong/LY1/2017 (H9) 由本實驗室于2017年分離、初步鑒定并保存。Cbl siRNA(表1)和陰性對照siRNA購自南京擎科生物科技有限公司。

表1 siRNA序列

1.2 主要試劑

GAPDH單抗，購于Enogene生物公司；HRP標記山羊抗兔IgG二抗，購于優(yōu)寧維生物公司；DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker、核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、Mix、核酸膠回收試劑盒、TRIzol試劑，購于TaKaRa公司；DMEM和胎牛血清(FBS)，購于Gibco公司；蛋白預染Marker、LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，購于Invitrogen公司；抗流感病毒A核蛋白抗體 (ab20343) 和c-Cbl蛋白抗體(ab32027)，購于Abcam公司。

1.3 Cbl基因的擴增

根據(jù)GenBank中Cbl基因(NM_204208.1)的序列設(shè)計特異性引物擴增基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為，F(xiàn)：5′-AAGCTTATGTCGGCTCCGCTGAAGAAGGG-3′，R：5′-GAA-TTCTTACAGGGATAACTTCGTCAGGTTACGCCTAGGC-TGAG-3′。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

在50 μL PCR體系中加入反轉(zhuǎn)錄后的HD11 cDNA模板2.5 μL，上、下游引物各1 μL，rTaq酶mix 25 μL，補加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預變性 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，在16 ℃終止反應(yīng)。PCR結(jié)束后，回收PCR產(chǎn)物進行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)粒或目的片段1 μg、限制性內(nèi)切酶各2 μL、10 × Cutsmart buffer 5 μL、ddH2O補至50 μL。37 ℃酶切45 min，65 ℃ 5 min結(jié)束酶切反應(yīng)。清潔回收酶切產(chǎn)物，然后利用T4 DNA連接酶連接。16 ℃連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，在含有氨芐抗性的LB固體平板上37 ℃ 過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落進行菌液PCR鑒定，選取1～3個陽性克隆送南京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

A549細胞接種至24孔板中，待其貼壁生長至密度為60%～70%，利用Lip3000轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒至A549細胞中，其中FLAG-Cbl組轉(zhuǎn)染FLAG-Cbl質(zhì)粒，F(xiàn)LAG組轉(zhuǎn)染FLAG-N空載體，對照組則僅加入Lip3000轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后6 h更換培養(yǎng)液，用含2%血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。接種感染復數(shù)(MOI)為0.1的H9N2亞型病毒，在對應(yīng)時間點收集細胞沉淀制樣，進行SDS-PAGE檢測后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，于5%脫脂奶中室溫封閉2 h，用PBST洗膜3次，洗膜完成后根據(jù)蛋白Marker大小剪取所需蛋白大小的膜至稀釋好的對應(yīng)單抗中，4 ℃孵育過夜。清洗后置于5%脫脂奶稀釋的HRP標記山羊抗兔二抗中于37 ℃繼續(xù)孵育1 h。利用化學發(fā)光檢測試劑盒進行化學發(fā)光顯色，檢測蛋白表達情況。

1.6 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol裂解法提取細胞總RNA，并且反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 模板用于實時熒光定量 PCR，反轉(zhuǎn)錄體系為 20 μL：RNA 模板 6 μL；AccuRT reaction mix (4×) 2 μL；AccuRT Reaction Stopper (5×) 試劑2 μL；5× All-In-One RT MasterMix 試劑 4 μL；Nuclease-free H2O試劑6 μL；反應(yīng)程序為25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，最后85 ℃ 5 min。

1.7 熒光定量PCR設(shè)計合成

根據(jù) GenBank上公布的 H9N2 亞型 AIV 的血凝素(HA)、核蛋白(NP)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)基因序列，設(shè)計并且合成熒光定量 PCR引物，如表2所示。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 熒光定量PCR引物

1.8 熒光定量 PCR反應(yīng)體系和程序

反應(yīng)體系: EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10 μL，上下游引物各0.6 μL，模板DNA 2 μL，水6.8 μL。反應(yīng)程序為預變性95 ℃ 1 min，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，35個循環(huán)，采集信號分析結(jié)果。熒光定量PCR試驗數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

1.9 轉(zhuǎn)染siRNA

A549細胞接種至24孔板中，待其貼壁生長至密度為30%～40%，利用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染相應(yīng)siRNA各50 pmol，轉(zhuǎn)染后6 h后更換培養(yǎng)液為含2%血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)36 h。然后接種MOI=0.1的H9N2亞型AIV，分別在感染后不同時間段收集細胞樣品，采用熒光定量PCR檢測病毒HA基因相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核重組表達載體 FLAG-Cbl 構(gòu)建

以禽源HD11細胞的cDNA為模板，擴增出Cbl片段，大小為420 bp (圖1) ，與預估大小符合。將擴增產(chǎn)物Cbl與空載體FLAG-N連接后，以單菌落擴增后提取的質(zhì)粒為模板進行 PCR，瓊脂糖凝膠電泳顯示，在420 bp處有1條明顯條帶(圖2)，與預期結(jié)果一致。PCR陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)約3 779和420 bp 2條特異條帶，如圖3所示。這些結(jié)果說明，真核重組表達載體FLAG-Cbl已構(gòu)建成功。

M.DNA Marker;1～3.Cbl的PCR產(chǎn)物

M.DNA Marker;1～5.FLAG-Cbl的重組載體PCR產(chǎn)物

2.2 Cbl蛋白對H9N2病毒在A549細胞中復制的影響

2.2.1 從蛋白水平上檢測Cbl蛋白對病毒復制的影響

FLAG-Cbl 重組載體和FLAG空載體轉(zhuǎn)染A549細胞24 h，然后接種H9N2病毒，分別于6、12、24和36 h后收樣，檢測不同時間點病毒NP蛋白的表達情況，如圖4。結(jié)果顯示，在接毒6 h后FLAG-Cbl組的NP蛋白表達低于FLAG空載組。該結(jié)果表明表達的Cbl蛋白抑制了H9N2 病毒在A549細胞中的早期復制。

M.DNA Marker;1～3.雙酶切FLAG-Cbl重組載體

圖4 Western blot檢測病毒NP蛋白的表達

利用 Image J 軟件進行結(jié)果分析，分析不同細胞組的NP蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH蛋白的比值，結(jié)果如圖5所示。接毒6 h時，F(xiàn)LAG-Cbl組的NP蛋白水平明顯低于對照和FLAG組(P<0.05)。接毒12 h時，F(xiàn)LAG-Cbl組的NP蛋白水平也低于對照組，不過沒有達到差異水平(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2.2 從mRNA水平上檢測Cbl蛋白對病毒復制的影響

FLAG-Cbl重組載體和FLAG空載體轉(zhuǎn)染 A549 細胞24 h，分別于接種H9N2亞型病毒6、12、24和36 h收樣，進行熒光定量PCR檢測。結(jié)果如圖6所示，接毒6、12和24 h時，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NP基因相對水平顯著低于對照和FLAG組(P<0.05，P<0.01)，表明重組表達的Cbl蛋白抑制了H9N2亞型AIV在A549細胞中的早期復制。在病毒接種36 h時，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NP基因相對水平低于FLAG空載體組(P>0.05)，不過極顯著高于對照組(P<0.01)。

**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

同時，采用定量PCR技術(shù)檢測了H9N2病毒的HA、NS基因表達水平。結(jié)果顯示，在接毒6和12 h，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NS基因相對水平明顯比FLAG空載體組低(P<0.05，P<0.01)(圖7)，且該組的HA基因相對水平明顯低于FLAG空載體組(P<0.05)(圖8)。在病毒接種24 h時，各試驗組的NS和HA基因表達水平差異不大(P>0.05)。在病毒接種36 h時，F(xiàn)LAG-Cbl組的病毒NS和HA基因相對水平低于FLAG空載組，不過高于對照組。

圖7 熒光定量PCR檢測NS基因相對表達水平

2.3 敲低內(nèi)源性Cbl蛋白對H9N2病毒增殖的影響

為了探究內(nèi)源性Cbl蛋白對于H9N2病毒的影響，在A549細胞中分別轉(zhuǎn)染對照和3條靶向Cbl蛋白的siRNA (Cbl-1、Cbl-2和Cbl-3) 敲低Cbl蛋白的表達。轉(zhuǎn)染72 h后，經(jīng)Western blot和熒光定量PCR驗證敲低效率。與對照相比，siRNA-Cbl-1、-2和-3均敲低細胞中Cbl蛋白的蛋白表達及基因表達水平明顯減少，其中以siRNA-Cbl-1敲低Cbl蛋白和基因表達最為明顯(P<0.05)(圖9、10)。

圖8 熒光定量PCR檢測HA基因相對表達水平

圖9 Western blot檢測siRNA對Cbl蛋白的敲低作用

***表示差異極顯著(P<0.001)。下同

基于上述結(jié)果，選擇敲低效果最顯著的siRNA-Cbl-1進行后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)染siRNA-Cbl-1 36 h后，以MOI=0.1的H9N2病毒感染，分別在感染后 6、12、24和36 h收集細胞樣品，做熒光定量PCR驗證。結(jié)果如圖11所示，在A549細胞中敲低Cbl蛋白表達12～36 h時，病毒HA基因水平明顯上升(P<0.001)，說明敲低細胞內(nèi)Cbl時，病毒復制增強，暗示細胞內(nèi)的Cbl蛋白能夠在一定程度上抑制H9N2病毒的復制。

圖11 熒光定量PCR檢測敲低細胞內(nèi)Cbl對病毒HA基因表達的影響

3 討論

H9N2亞型AIV已給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，并造成了嚴重的公共衛(wèi)生安全隱患[16-17]。開展抗AIV的功能機制研究已成為眾所關(guān)注的重要課題。本研究前期發(fā)現(xiàn)，Cbl為法氏囊源活性分子的同源蛋白[9]。Cbl作為一種泛素化激酶(E3)，是細胞內(nèi)泛素化生物過程的重要組成[20-21]。有研究顯示，E3泛素連接酶可通過促進TBK1 泛素化修飾來調(diào)控其表達及活化[22]，也可與TRAF3相互結(jié)合并對其進行K29泛素化修飾，增強下游信號分子IRF3的活化，從而促進Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來抑制病毒復制[23]。那么，Cbl對H9N2亞型AIV的復制影響如何，有待于進一步探索。

本試驗成功構(gòu)建了FLAG-Cbl真核表達載體，并將其轉(zhuǎn)染至A549細胞中，感染H9N2亞型AIV后，經(jīng)Western blot和熒光定量PCR檢測NP等病毒蛋白的表達情況，發(fā)現(xiàn)在病毒感染6和12 h時，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染的細胞中病毒NP、NS和HA基因表達水平均明顯低于FLAG組，且低于對照組，這說明Cbl蛋白在H9N2亞型病毒早期復制有一定的抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)，病毒感染24 h時，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染組、FALG組和對照組細胞中病毒NS和HA基因表達水平相似，而在病毒感染36 h時，F(xiàn)LAG-Cbl轉(zhuǎn)染組細胞中病毒NP、NS和HA基因表達水平均低于FLAG組，但高于對照組。我們推測可能是因為24 h以后，細胞內(nèi)病毒總量復制增加，Cbl雖然具有一定抑制病毒的能力，但病毒可能通過一些機制仍在不斷增加，以至于Cbl蛋白不能充分發(fā)揮抑制病毒復制的功能，這些側(cè)面說明了Cbl蛋白僅在病毒早期發(fā)揮抑制病毒復制的作用。至于其中的功能機制尚不清晰，還有待深入探索。

HA蛋白是H9N2亞型AIV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，不僅介導病毒吸附及穿入宿主細胞，而且是一種保護性抗原[24]。本試驗用RNAi技術(shù)敲低細胞內(nèi)Cbl蛋白后，以HA基因水平反映H9N2亞型AIV的入侵宿主細胞及其在宿主細胞中的復制情況。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)病毒HA基因水平明顯增高。這說明細胞內(nèi)Cbl蛋白降低后，細胞內(nèi)AIV增多，暗示著細胞內(nèi)Cbl蛋白降低后，AIV復制增強。該結(jié)果與FLAG-Cbl轉(zhuǎn)染過表達的結(jié)果具有一定的負相關(guān)關(guān)系。這也反過來暗示了Cbl蛋白對于H9N2亞型流感病毒復制有一定的抑制作用。鄭陽等[18]報道，重組表達的Cbl蛋白能夠在犬MDCK 細胞上抑制H9N2亞型AIV的復制。本研究以A549細胞為模型，采用不同的重組表達載體，取得了與此相似的研究結(jié)果。這暗示著Cbl能夠在不同宿主細胞內(nèi)發(fā)揮抑制H9N2亞型AIV復制的功能。許多研究都證實，E3泛素連接酶家族成員可通過泛素化途徑來調(diào)控干擾素水平從而影響病毒復制情況[23]。那么，Cbl蛋白抑制AIV早期復制的作用機制是否與其泛素化調(diào)節(jié)干擾素的功能機制相關(guān)，還有待進一步研究。

總之，本研究證實法氏囊源多肽同源蛋白Cbl的重組蛋白能夠在人源細胞模型中抑制H9N2亞型AIV的早期復制，為深入研究Cbl蛋白抗病毒復制機制提供了重要的試驗依據(jù)，同時為開展抗H9N2亞型AIV藥物提供了重要參考。