李友英，藍嵐，潘瑤，3，楊丹嬌，吳建平，李松明，程川，王德云*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 甘孜 626000；3. 西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；4. 理塘縣動物疫病預(yù)防控制中心，四川 理塘 624300)

梨形蟲病是由梨形蟲寄生于牛羊等動物紅細胞及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞內(nèi)引起的一種蜱傳寄生蟲病[1-2]，臨床癥狀主要以發(fā)熱、黃疸、貧血、血紅蛋白尿等為主，發(fā)病率和死亡率高，給養(yǎng)殖戶造成巨大損失[3-5]。迄今為止，發(fā)布的牛梨形蟲病病原主要有牛巴貝斯蟲(BabesiaBovis)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)、分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)、卵形巴貝斯蟲(Babesiaovalis)、大巴貝斯蟲(Babesiamacrocephala)、東方泰勒蟲(Theileriaorientalis)、環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)、小泰勒蟲(Theileriaparva)、中華泰勒蟲(Theileriasinensis)和瑟氏泰勒蟲(Theileriasergenti)等[6-8]。青藏高原地區(qū)，感染牦牛與藏綿羊的泰勒蟲主要有中華泰勒蟲(Theileriasinensis)、環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)、東方泰勒蟲(Theileriaorientalis)、綿羊泰勒蟲(Theileriaovis)、呂氏泰勒蟲(Theilerialowenshuni)等[8-9]。本病需通過蜱吸食牛羊的血液進行傳播，該病的流行與當(dāng)?shù)仳绲南L、活動密切相關(guān)，具有明顯的季節(jié)性[10-11]。了解其流行規(guī)律可制定相應(yīng)的防治措施預(yù)防控制該病。

牦牛是甘孜州畜牧業(yè)的主要養(yǎng)殖品種，是高原地區(qū)牧民的主要經(jīng)濟動物，甘孜州轄18 個縣，其中理塘為五大牧區(qū)縣之一，牦牛為其優(yōu)勢畜種[12-15]。牦牛梨形蟲病是危害牦牛養(yǎng)殖業(yè)的主要寄生蟲病之一[12]。擁崩扎[16]調(diào)查發(fā)現(xiàn)牛梨形蟲病不受年齡限制，以2 歲內(nèi)的牛發(fā)病最多，但癥狀輕，死亡率較低；成年牛發(fā)病率較低，但病情嚴重，死亡率達70%～80%。2018年我們對甘孜藏族自治州(甘孜州)全部18個縣(市)牦牛梨形蟲的感染情況進行調(diào)查，采集牦牛全血1 381 份，梨形蟲平均陽性率高達31.72%，泰勒蟲占比86.29%；其中理塘縣達30.68%，泰勒蟲占比90%，說明理塘縣牦牛感染泰勒蟲情況較為嚴重。該病是造成全州牦牛夏秋季死亡的主要疫病之一[17]，但一直未有對甘孜州牦牛泰勒蟲流行規(guī)律的確切報道。本試驗通過分析理塘縣牦牛泰勒蟲感染的季節(jié)規(guī)律、年齡段、性別特點、體重變化及優(yōu)勢蟲種鑒定，對理塘縣牦牛感染泰勒蟲的流行規(guī)律進行調(diào)查，對指導(dǎo)牦牛梨形蟲病防治，提高畜牧業(yè)經(jīng)濟效益，促進農(nóng)牧民增收具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 牦牛血樣采集

2019年5—11月和2020年4—10月定點從理塘縣多個牧場采集臨床健康且未驅(qū)蟲牦牛全血345 份，標(biāo)記時間、年齡、體重及性別，裝于一次性真空抗凝管中，置冰盒帶回實驗室檢測。所有的血樣均放在-20 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 全血總DNA提取

吸取150 μL全血加入離心管中，然后采用酚-氯仿法提取DNA，置于抗凝管中2～8 ℃保存。

1.2.2 18S rRNA引物的設(shè)計

采用文獻[18]報道的以18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法進行檢測。引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.3 梨形蟲18S rRNA序列的PCR擴增

第一輪反應(yīng)：PremixTaq酶(購自 TaKaRa 公司)12.5 μL，外引物F/R各1 μL(10 μmol/μL)，樣本DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。第二輪反應(yīng)：PremixTaq酶12.5 μL，內(nèi)引物 F/R 各1 μL(10 μmol/μL)，第一輪PCR產(chǎn)物1 μL，ddH2O 9.5 μL。95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；16 ℃反應(yīng)結(jié)束。將第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 蟲種鑒定

將全部牦牛梨形蟲核酸陽性樣本共計65 份的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。通過NCBI上的BLAST對序列進行比對。采用MEGA 7軟件以Neighbor-Joining法(Bootstrap值為1 000)基于梨形蟲序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，運用Lasergene 7.0軟件對所測得的序列進行同源性比對分析，根據(jù)構(gòu)建的進化樹及同源性分析結(jié)果鑒定泰勒蟲蟲種。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用 IBM SPSS Statistics 20 軟件進行方差分析和多重比較。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準誤” 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 理塘縣牦牛泰勒蟲檢測

理塘縣采集血樣345 份，經(jīng)巢式PCR擴增其18S rRNA部分基因序列，其中有65份樣本擴增出目的條帶，泰勒蟲陽性率為18.84%。部分樣本PCR電泳結(jié)果見圖1。

M.D2000 DNA Marker；P.陽性對照；N.陰性對照(去離子水)；1～12.牦牛全血樣本

2.2 牦牛感染泰勒蟲的季節(jié)規(guī)律

5、6月牦牛泰勒蟲陽性率較高，高于其他月份，分別為30.00%(12/40)、29.03%(18/62)。最低為11 月，陽性率為8.7%(65/345)。見表2。

表2 牦牛感染泰勒蟲的季節(jié)規(guī)律

2.3 不同年齡段牦牛泰勒蟲的感染情況

0～2歲組牦牛泰勒蟲陽性率為 19.70%(13/66)，2～5歲組為24.67%(37/150)，5歲以上組為11.63%(15/129)。0～2歲與2～5歲組牦牛泰勒蟲陽性率顯著高于5歲以上組(P<0.05)。見圖2。

字母不同表示差異顯著 (P<0.05)，字母相同表示差異不顯著 (P>0.05)

對同一年齡組的泰勒蟲陽性牦牛與陰性牦牛的平均體重進行分析，0～2 歲組，泰勒蟲陽性牦牛平均體重低于陰性牦牛，差異不顯著(P>0.05)；而2～5 歲組、5 歲以上組泰勒蟲陽性牦牛平均體重顯著低于對應(yīng)的陰性牦牛(P<0.05)。說明感染泰勒蟲的牦牛體重普遍較低。

同一年齡組進行性比較，字母不同表示差異顯著 (P<0.05)，字母相同表示差異不顯著 (P>0.05)

2.4 不同性別牦牛泰勒蟲的感染情況

由表3可知雄性牦牛泰勒蟲陽性率為19.34%(41/212)，雌性牦牛為18.05%(24/133)，雄性牦牛泰勒蟲陽性率稍高于雌性牦牛，但差異不明顯。

表3 不同性別牦牛泰勒蟲的感染情況

2.5 牦牛泰勒蟲種鑒定

2.5.1 牦牛泰勒蟲蟲種檢測

將全部牦牛梨形蟲陽性樣本PCR產(chǎn)物測序鑒定，成功測序58 份，鑒定得到2 個蟲種。其中中華泰勒蟲占比為98.28%(57/58)，呂氏泰勒蟲占比為1.72%(1/58)。各月泰勒蟲蟲種情況詳見表4。

2.5.2 分子種系發(fā)育分析

基于梨形蟲18S rRNA基因序列建立進化樹進行牦牛泰勒蟲蟲種鑒定。由圖4可見，理塘縣檢測出的57 株序列(Yak1～55、Litang-5-4、Litang-5-5)與GenBank中已發(fā)表的中華泰勒蟲甘肅、河南分離株(EU274472.1、KF559355.1、KX115427.1)之間的同源性為94.60%～100.00%，聚為一大枝，57株序列間同源性為92.9%～100.00%，鑒定為中華泰勒蟲。理塘檢測出的1 株序列(Litang-5-7)與已發(fā)表的呂氏泰勒蟲甘肅分離株(JX469521.1、JX469527.1、JF719833.1)之間的同源性為99.70%～100.00%，聚為一大枝，鑒定為呂氏泰勒蟲。

表4 牦牛泰勒蟲蟲種檢測結(jié)果

Yak1～55代表中華泰勒蟲55個樣本序列，▲代表其他樣本序列

3 討論

巢式PCR較常規(guī)PCR方法特異性更高，可用于診斷亞臨床感染[19-22]。Mahmoud等[23]使用間接熒光抗體試驗方法 (IFAT)及巢式PCR方法對驢和馬的血液寄生蟲感染情況進行檢測，IFAT的檢出率低于巢式PCR。18S rRNA具有保守性和高變性，不僅能檢測出是否有梨形蟲感染，還可通過梨形蟲核酸陽性樣本進行PCR產(chǎn)物測序，基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行蟲種鑒定。沈雪鷹等[24]采用18S rRNA為靶基因的套氏PCR檢測云南省騰沖市牛羊梨形蟲的感染情況，采集758頭牛、羊的血樣，總陽性率27.31%，檢出蟲種包括巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬13種，牛感染6種泰勒蟲和4種巴貝斯蟲，羊感染3種泰勒蟲和2種巴貝斯蟲。藍嵐等[17]采用18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法，對1 381份牦牛全血進行梨形蟲檢測，梨形蟲平均陽性率為31.72%，包括巴貝斯蟲和泰勒蟲兩屬，鑒定蟲種6個。18S rRNA基因作為分子標(biāo)記以及其測序方法具有較高的檢出率和準確率，在牦牛和藏綿羊的梨形蟲檢測中應(yīng)用廣泛且效果良好[25-27]。本試驗采用以18S rRNA為靶基因的梨形蟲巢式PCR方法，對四川省理塘縣牦牛泰勒蟲病原進行檢測，并通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹及同源性分析進行蟲種鑒定。

擁崩扎[16]對甘孜州鄉(xiāng)城縣牛雙芽巴貝斯焦蟲病的流行病學(xué)進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病在鄉(xiāng)城縣12個鄉(xiāng)(鎮(zhèn))時有發(fā)生，主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，以7—10月份為發(fā)病高峰期，12月份有極少數(shù)牛發(fā)病。Li等[6]于2015年4—7月，對甘肅天祝白牦牛350份血樣進行檢測，梨形蟲陽性率為38.3%，鑒定蟲種4個，中華泰勒蟲、東方泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、陽性率分別為26.0%、9.7%、8.3%、7.7%。鐘維等[27]于2016年9—10月，對采自四川阿壩州5個縣牦牛梨形蟲進行檢測，牦牛梨形蟲感染率為8.3%～100%，感染蟲種單一，均為中華泰勒蟲。劉道鑫[28]調(diào)查發(fā)現(xiàn)青海天峻地區(qū)牦牛泰勒蟲感染率為24.18%，2～3歲組感染率最高，為29.86%。甘孜州牦牛泰勒蟲感染情況較為嚴重，然而，到目前為止，一直未見對甘孜州牦牛感染泰勒蟲的季節(jié)、年齡、體重、性別等規(guī)律的確切報道。本試驗基于這一現(xiàn)狀，采集不同月份牦牛血樣，對理塘縣牦牛泰勒蟲感染季節(jié)規(guī)律、年齡段、性別特點、蟲種進行調(diào)查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰勒蟲平均陽性率為18.84%，5、6月牦牛泰勒蟲陽性率明顯高于其他月份，2～5歲組牦牛泰勒蟲陽性率最高，顯著高于5歲以上組牦牛，與0～2歲組牦牛差異不顯著；公牦牛感染率略高，差異不顯著。鑒定牦牛泰勒蟲蟲種2個，其中中華泰勒蟲占比為98.28%，呂氏泰勒蟲占比1.72%，結(jié)果表明中華泰勒蟲為理塘縣牦牛感染的優(yōu)勢蟲種。該調(diào)查為理塘縣梨形蟲病流行的預(yù)防及控制提供依據(jù)，在提高牦牛的生產(chǎn)性能方面，需要考慮梨形蟲感染造成的影響。

本次調(diào)查僅在5月份檢測出了呂氏泰勒蟲，檢出率較低。蜱是梨形蟲病原傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。呂氏泰勒蟲主要以青海血蜱為宿主。唐天才[29]自甘孜州石渠縣采集蜱蟲1 352只，鑒定為青海血蜱和西藏革蜱，其中青海血蜱占29.13%；西藏革蜱占70.87%，優(yōu)勢種。該調(diào)查發(fā)現(xiàn)，青海血蜱僅分布于海拔相對較低的半農(nóng)牧區(qū)的3個鄉(xiāng)。理塘縣屬于純牧業(yè)區(qū)，采樣地海拔均高達4 000 m，而青海血蜱主要分布于海拔相對較低的半農(nóng)牧區(qū)，推測其為呂氏泰勒蟲檢出率較低的原因。但有關(guān)理塘縣蜱的種類及攜帶病原情況的資料幾乎為零，且青藏高原地區(qū)牦牛感染呂氏泰勒蟲的報道相對較少。除此之外，本次調(diào)查僅對理塘縣部分地區(qū)進行調(diào)查，所以其流行規(guī)律及機制尚待進一步深入研究。

梨形蟲病臨床特征以高熱、黃疸、貧血、消瘦和血紅蛋白尿為主，嚴重者可導(dǎo)致宿主死亡，亞臨床感染可出現(xiàn)牦牛產(chǎn)肉量下降、生長發(fā)育遲緩、繁殖性能下降等[5,27]。本次檢測牦牛均未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀，但是體重普遍偏輕，大大降低了牧民的經(jīng)濟收入，應(yīng)該引起高度重視，做好各項預(yù)防工作，將農(nóng)牧民的財產(chǎn)損失降到最低。

本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)理塘縣牦牛泰勒蟲5、6月感染情況較為嚴重，可能與其所在地理位置有關(guān)。理塘縣境內(nèi)地表平均海拔4 300 m左右，5—10月降水量集中，氣溫相對較高；11月至次年4月，氣候干燥寒冷，多大風(fēng)天氣，11月至次年3月平均氣溫多在0 ℃以下。每年5—6月份氣溫開始升高，植被增多，蜱蟲開始活躍，增加了蜱侵襲牦牛和傳播梨形蟲的機會，所以應(yīng)在每年多發(fā)季節(jié)前進行預(yù)防性給藥和滅蜱工作。此次調(diào)查表明，不同年齡的牦牛感染陽性率不同，且2～5歲組的牦牛感染陽性率較高，為23.46%。因此，不同年齡的牦牛防治措施應(yīng)該不同，應(yīng)加強對2～5歲齡牦牛梨形蟲病的防治，這樣才能有效減少該病的感染率。

本研究首次對理塘縣牦牛感染泰勒蟲的流行規(guī)律進行調(diào)查，該縣牦牛泰勒蟲感染率較高，平均陽性率為18.84%，5、6月明顯高于其他調(diào)查月份；2～5歲組牦牛顯著高于0～2歲組牦牛，公牦牛感染率較高，優(yōu)勢蟲種為中華泰勒蟲，為理塘縣牦牛梨形蟲病防控提供了重要參考。梨形蟲病的主要傳播媒介為蜱，但本試驗未對蜱的種類和分布進行調(diào)查，還需進一步調(diào)查研究。