劉凡,郭磊，陳秀紅，邊海霞，郭亞男，姜肖軍，何生虎*

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏曉鳴農(nóng)牧股份有限公司，寧夏 銀川 750021)

雞滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae)是在20世紀(jì)50年代 Olson 等最先提出，臨床常引起明顯的呼吸道感染，同時(shí)可以引起雞和火雞的氣囊炎、滑膜炎，是禽類動(dòng)物中一種具有致病性的支原體。1960年起Chalquest將其單獨(dú)列為一個(gè)種屬開始研究，同年Lecce首次在傳染性滑膜炎的病禽中分離出該病原體。隨著時(shí)間推移，更多報(bào)道發(fā)現(xiàn)雞滑液囊支原體是以造成禽類關(guān)節(jié)滑液囊膜炎、黏液囊炎及腱鞘滑膜炎等傳染性滲出性炎癥為主要特征的傳染病病原，同時(shí)可以定殖在呼吸道引起呼吸道疾病，嚴(yán)重的甚至?xí)鹑硇該p傷[1]。雞群感染后可導(dǎo)致不同癥狀，如呼吸困難、流鼻涕、蜂窩織炎、關(guān)節(jié)腫大、跛行、發(fā)育緩慢、生長速度降低及胴體品質(zhì)降級(jí)[2]。更為嚴(yán)重的是，感染雞滑液囊支原體的病雞同時(shí)容易誘發(fā)新城疫病毒、禽流感病毒、大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒等病原微生物混合或者二次感染[3]。

雞滑液囊支原體是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有致病性的禽類支原體中危害最嚴(yán)重的支原體之一[4]。雖然該支原體感染造成的雞群死亡率僅10%左右[5]，但感染后難以根治，會(huì)造成生長發(fā)育遲緩、蛋品質(zhì)下降和免疫抑制等多方面問題，給家禽養(yǎng)殖帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。傳染性疾病的流行對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)及潛在的公共衛(wèi)生安全威脅逐年上升，病原變異也使疫病流行趨勢(shì)日漸復(fù)雜，防控工作難上加難[7]。

蛋白質(zhì)作為細(xì)胞功能的執(zhí)行者是生命活動(dòng)的重要載體，也是生命體內(nèi)遺傳信息表達(dá)最后的表現(xiàn)形式。通過各種技術(shù)手段發(fā)掘差異蛋白，探究其差異性在生理調(diào)控中發(fā)揮的具體作用，可以為畜牧業(yè)研究揭示生命現(xiàn)象規(guī)律提供新的方法和思路，同時(shí)還會(huì)對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐提供具體的理論指導(dǎo)[8]。非標(biāo)記(label-free)試驗(yàn)方法即非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，是不需要使用同位素標(biāo)簽作為標(biāo)準(zhǔn)，在其質(zhì)譜分析中通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段，依據(jù)相應(yīng)肽段出現(xiàn)不同信號(hào)強(qiáng)度從而對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)以及含量進(jìn)行相對(duì)定量[9]。近年來人們對(duì)雞滑液囊支原體的研究在不斷深入，對(duì)一些免疫原性蛋白也進(jìn)行過相關(guān)鑒定，現(xiàn)有進(jìn)展已發(fā)現(xiàn)甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(GDPD)是免疫原性蛋白[10]，細(xì)胞膜脂蛋白(LP78)、熱不穩(wěn)定延伸因子(EF-Tu)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)也具有免疫原性等[11]。但成果轉(zhuǎn)化為疫苗免疫防控研發(fā)都還在發(fā)展階段，病原具體的致病機(jī)理也還在探究之中。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作，雞滑液囊支原體第1代(G1)導(dǎo)致雞群發(fā)病， 95代傳代株(G95)不引起相應(yīng)臨床表現(xiàn)。本研究以支原體G1與G95傳代株為研究對(duì)象，應(yīng)用非標(biāo)記法定量蛋白組分析篩選2個(gè)代次支原體的差異蛋白質(zhì)，為后期繼續(xù)更深入地研究雞滑液囊支原體傳代株毒力減弱的機(jī)制奠定基礎(chǔ)[12]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(TMT)標(biāo)記試劑盒，購自Thermo公司；胰酶，購自Promega公司；甲酸，購自Fluka公司；碘代乙酰胺、三乙基碳酸氫銨(TEAB)、蛋白酶抑制劑，購自Calbiochem公司；磷酸酶抑制劑，購自Millipore公司；BCA試劑盒，購自碧云天。

Easy-nLC 1200液相系統(tǒng)(ThermoFisher)，TGL-16A臺(tái)式冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀)，SDS-PAGE 電泳儀(北京市六一儀器廠)，ImageScanner掃描儀(EPSON), SCIENTZ-10N凍干機(jī)(寧波新芝),高pH分離液相色譜儀(Agilent)。

1.2 樣本采集

將實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱保存的雞滑液囊支原體G1代次和G95代次按1/10的比例接種于改良Frey液體培養(yǎng)基中，封口后置于37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱中進(jìn)行菌株的擴(kuò)增培養(yǎng)。等待液體培養(yǎng)基變成橙黃色后，12 000 r/min條件下離心3 min，棄去上清液，菌體沉淀用無菌PBS液體吹打洗滌，之后按相同條件離心棄掉上清液，重復(fù)洗滌 3 次后將樣品轉(zhuǎn)移至無菌離心管-80 ℃保存。

1.3 蛋白提取

樣品從-80 ℃條件取出后，分別加入 4 倍體積的裂解緩沖液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑，1%磷酸酶抑制劑)進(jìn)行超聲裂解?；旌弦和瓿沙暳呀夂笾糜? ℃，12 000 r/min離心 10 min，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，選擇 BCA 試劑盒進(jìn)行樣品蛋白濃度的測(cè)定。

1.4 胰酶酶解

將蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L后，56 ℃條件下還原 30 min。之后加入碘代乙酰胺使其終濃度為 11 mmol/L，在室溫避光孵育 15 min。最后將樣品的尿素濃度稀釋至低于 2 mol/L。接著以胰酶和蛋白按1/50 的質(zhì)量比例加入胰酶，37 ℃酶解過夜。再按胰酶與蛋白1/100的質(zhì)量比例加入胰酶，繼續(xù)酶解 4 h完成胰酶酶解。

1.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

肽段用液相色譜流動(dòng)相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。后肽段結(jié)束超高效液相系統(tǒng)分離后，被注入NSI離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)行Q ExactiveTMPlus質(zhì)譜分析。離子源電壓設(shè)置為2.0 kV，肽段母離子以及二級(jí)碎片使用高分辨的 Orbitrap 進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.6 數(shù)據(jù)庫搜索生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)

蛋白鑒定:將蛋白樣品原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Maxquant軟件(Maxquant v1.5.2.8)對(duì)二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，對(duì)各組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定和相對(duì)表達(dá)量的比較。本研究所采用的數(shù)據(jù)庫為 SwissProtMouse(16 964條序列)，添加反庫以計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR)，并且在數(shù)據(jù)庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響。

差異蛋白的鑒定及表達(dá)分析:在篩選出的可信蛋白基礎(chǔ)上，通過評(píng)估某一蛋白在樣品間的表達(dá)水平變化倍數(shù)(FC)值和經(jīng)t檢驗(yàn)計(jì)算的展現(xiàn)樣品間差異顯著性P值作為差異蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)C值≥1.5倍且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著蛋白質(zhì)。利用蛋白的表達(dá)量進(jìn)行主成分分析(PCA分析)，從不同維度展現(xiàn)樣本間的關(guān)系。

收集所有蛋白分組富集到的功能分類信息和對(duì)應(yīng)的富集P值，然后篩選出至少在一個(gè)蛋白分組中為顯著富集(P<0.05)的功能分類。參照Uniprot-GOA 數(shù)據(jù)庫將蛋白ID轉(zhuǎn)換為 Uniprot ID，之后用Uniprot ID去匹配 GO ID，并依據(jù)GO ID比對(duì)Uniprot-GOA數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相應(yīng)的信息進(jìn)行Gene Ontology的差異蛋白功能富集分析。將2組差異蛋白從細(xì)胞組成、分子功能、生物進(jìn)程三個(gè)方面，按照每個(gè)條目對(duì)應(yīng)-lgP值由大到小排序的各10條標(biāo)準(zhǔn)繼續(xù)進(jìn)行GO富集分析功能描述。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白鑒定

對(duì)雞滑液囊支原體G1和G95傳代株蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，鑒定出樣品的可信蛋白總數(shù)為428個(gè)。

圖1中每個(gè)點(diǎn)代表試驗(yàn)中的1份檢測(cè)樣品，以不同灰度區(qū)分不同G1組和G95組。由圖中各組樣品在區(qū)間的分散點(diǎn)可知，G95組的樣品在空間分布較集中,即G95組的3個(gè)平行樣品的重復(fù)性要高于G1組。

2.2 差異蛋白表達(dá)分析

2.2.1 差異蛋白的篩選

基于已經(jīng)篩選出的可信蛋白(每組重復(fù)均以能鑒定到可信蛋白為基礎(chǔ)進(jìn)行分析)，計(jì)算得到差異顯著性P值和每組的差異倍數(shù)FC值，按P<0.05且FC值≥1.5倍為標(biāo)準(zhǔn)篩選出69個(gè)差異顯著蛋白。G95株相比G1株，出現(xiàn)了59個(gè)高表達(dá)量蛋白，10個(gè)低表達(dá)量蛋白，具體見表1。

圖1 PCA蛋白表達(dá)量分析

表1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

續(xù)表1蛋白ID蛋白名稱P值趨勢(shì)Q4A6E9推定相變血凝素0.014上調(diào)Q4A6H0推定相變血凝素>0.001上調(diào)Q4A6H7推定相變血凝素0.001上調(diào)Q4A6K3未表征的蛋白質(zhì)0.002上調(diào)Q4A6K4?；窠?jīng)氨酸裂解酶0.019上調(diào)Q4A6K5推定的N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-表異構(gòu)酶>0.001上調(diào)Q4A6K6未表征的蛋白質(zhì)0.001上調(diào)Q4A6K7N-乙酰甘露糖胺激酶0.041上調(diào)Q4A6K8N-乙酰氨基葡萄糖6-P脫乙酰酶0.008上調(diào)Q4A6L1未表征的蛋白質(zhì)0.006上調(diào)Q4A6L2推定的脂蛋白0.002上調(diào)Q4A6L4未表征的蛋白質(zhì)0.001上調(diào)Q4A6L5寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白OppD0.003上調(diào)Q4A6L6推定的寡肽ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白OppF0.001上調(diào)Q4A6L8推定的寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)通透酶蛋白0.005上調(diào)Q4A6P7亮氨酰氨肽酶0.001上調(diào)Q4A6Q4PTS系統(tǒng),葡萄糖特異性II ABC成分0.022上調(diào)Q4A6S4推測(cè)的鉀通道蛋白0.003上調(diào)Q4A6T7tRNA(鳥嘌呤-N(7)-)-甲基轉(zhuǎn)移酶0.001上調(diào)Q4A6V0谷氨酸-tRNA連接酶0.043上調(diào)Q4A6Y0未表征的蛋白質(zhì)>0.001上調(diào)Q4A6Y1未表征的蛋白質(zhì)0.033上調(diào)Q4A733DJ-1_PfpI含域蛋白>0.001上調(diào)

2.2.2 差異蛋白功能富集分析

69個(gè)差異蛋白通過GO分析從分子功能、細(xì)胞組成和生物進(jìn)程進(jìn)行GO富集分析。下調(diào)的差異蛋白一共富集到20條注釋，其中分子功能10條、細(xì)胞組成4條和生物進(jìn)程6條，具體見表2。上調(diào)差異蛋白一共富集到63條注釋，其中分子功能31條、細(xì)胞組成7條和生物進(jìn)程25條具體見表3。

表2 下調(diào)差異蛋白GO分析

表3 上調(diào)差異蛋白GO分析

續(xù)表3編號(hào)GO分類條目描述屬于該條目的差異蛋白GO:0051205生物進(jìn)程蛋白質(zhì)插入膜Q4A5G5GO:0006424生物進(jìn)程谷氨酰-tRNA氨基?；疩4A6V0GO:0006427生物進(jìn)程組氨酰tRNA氨基?；疩4A5X2GO:0015031生物進(jìn)程蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)Q4A6L8; Q4A6L6; Q4A6L5; Q4A5I3; Q4A5G5GO:0015833生物進(jìn)程肽轉(zhuǎn)運(yùn)Q4A6L8; Q4A6L6; Q4A6L5GO:0006265生物進(jìn)程DNA拓?fù)渥兓疩4A691; Q4A580GO:0035999生物進(jìn)程四氫葉酸互變Q4A6B1GO:0019262生物進(jìn)程N(yùn)-乙酰神經(jīng)氨酸分解代謝過程Q4A6K5GO:0005975生物進(jìn)程碳水化合物代謝過程Q4A6K5; Q4A5V1GO:0006289生物進(jìn)程核苷酸切除修復(fù)Q4A5W3GO:0008033生物進(jìn)程tRNA加工Q4A5E9GO:0042254生物進(jìn)程核糖體生物發(fā)生Q4A5A0GO:0009401生物進(jìn)程磷酸烯醇丙酮酸依賴性糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)Q4A6Q4GO:0015986生物進(jìn)程ATP合成耦合質(zhì)子傳輸Q4A603; Q4A602GO:0006364生物進(jìn)程rRNA加工Q4A5P7GO:0006096生物進(jìn)程糖酵解過程Q4A5A8GO:0006412生物進(jìn)程翻譯Q4A5C5; Q4A5C9

為進(jìn)一步了解差異蛋白參與的代謝過程，GO富集分析前30條目顯示，下調(diào)蛋白、上調(diào)蛋白和總的差異蛋白的富集結(jié)果是下調(diào)蛋白存在于細(xì)胞組成分類下的細(xì)胞質(zhì)和分子功能的金屬離子結(jié)合過程的兩個(gè)方面。上調(diào)蛋白則在三個(gè)方面都有相應(yīng)條目，其中細(xì)胞組成條目占5個(gè)，染色體位列第一；生物進(jìn)程占6個(gè)，分別是蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA拓?fù)渥兓?、碳水化合物代謝過程和翻譯過程；分子功能包括10個(gè)條目，數(shù)值最高的是錳離子結(jié)合，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性也比較高。全部差異蛋白也有相應(yīng)三方面的功能注釋。具體條目分列的條形圖展示如圖2、3和4所示。

圖2 下調(diào)差異蛋白的前30條目GO富集分析

1. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；2. 肽轉(zhuǎn)運(yùn)；3. DNA拓?fù)渥兓?. 碳水化合物代謝過程；5. ATP合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸；6. 翻譯；7. 染色體；8. 細(xì)胞膜；9. 膜的組成部分；10. 質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶復(fù)合物；11. 細(xì)胞質(zhì)；12. 錳離子結(jié)合；13. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性；14. 水解酶活性；15. 鋅離子結(jié)合；16. 質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶活性結(jié)合；17. 腺苷三磷酸酶活性；18. ATP結(jié)合；19. DNA結(jié)合；20. 金屬離子結(jié)合；21. 核糖體的結(jié)構(gòu)成分

1. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；2. 肽轉(zhuǎn)運(yùn)；3. 磷酸烯醇丙酮酸依賴性糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)；4. DNA拓?fù)渥兓?. 碳水化合物代謝過程；6. 核糖體RNA加工；7. ATP合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸；8. 膜的組成部分；9. 翻譯；10. 染色體；11. 細(xì)胞膜；12. 質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶復(fù)合物；13. 細(xì)胞質(zhì)；14. 錳離子結(jié)合；15. 蛋白質(zhì)-N(PI)-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性；16. DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性；17. 甲基轉(zhuǎn)移酶活性；18. 水解酶活性；19. 激酶活性；20. 鋅離子結(jié)合；21. 質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合酶活性；22. 腺苷三磷酸酶活性；23. GTP結(jié)合蛋白

3 討論

本試驗(yàn)通過非標(biāo)記法利用數(shù)據(jù)庫檢索得到原始數(shù)據(jù)后，依照相關(guān)數(shù)據(jù)處理方式保留任意一組樣本有表達(dá)值的比例為≥50%的蛋白。峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后取數(shù)，即為可信蛋白鑒定出G1株與G95株的差異蛋白。也對(duì)差異蛋白進(jìn)行了GO分析，而蛋白質(zhì)本身存在結(jié)構(gòu)、功能等客觀差異，還有翻譯修飾、相互作用等多個(gè)更為復(fù)雜的動(dòng)態(tài)調(diào)控因素，所以此次差異蛋白質(zhì)的結(jié)果不具有唯一性。試驗(yàn)樣本雞滑液囊支原體是無細(xì)胞壁的原核生物，雖然結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單依靠宿主細(xì)胞生存，但與宿主細(xì)胞之間有著繁多復(fù)雜的相互作用。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其擁有入侵宿主并在體內(nèi)復(fù)制的能力，而且會(huì)引起免疫損傷導(dǎo)致雞群發(fā)病。雞滑液囊支原體可以與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合并且出現(xiàn)膜融合現(xiàn)象。同時(shí)自身合成代謝過程中也會(huì)產(chǎn)生溶細(xì)胞酶等有毒的代謝產(chǎn)物[13]。雞滑液囊支原體還可以侵入并掠奪宿主營養(yǎng)，消耗宿主染色體組蛋白中的精氨酸而引起合成障礙，最終導(dǎo)致宿主染色體損傷。雞滑液囊支原體的膜蛋白vlhA基因還能介導(dǎo)雞滑液囊支原體逃避宿主免疫應(yīng)答[14]。

非標(biāo)記法定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析對(duì)G1與G95代次菌株的蛋白分離鑒定出428個(gè)可信蛋白，數(shù)據(jù)篩選后得到69個(gè)差異蛋白，包括10個(gè)下調(diào)蛋白、59個(gè)上調(diào)蛋白，上調(diào)的差異蛋白中還存在4個(gè)期變血凝素蛋白，vlhA的產(chǎn)物也包括血凝素可以后續(xù)關(guān)注，其中14個(gè)差異蛋白還未有具體的GO功能顯示參考。上調(diào)差異蛋白的GO富集條目較多，共富集到63條注釋，分別是分子功能31條、細(xì)胞組成7條和生物進(jìn)程25條。其中分子功能主要是描述分子的化學(xué)活性，細(xì)胞組成主要是指細(xì)胞的特定成分，生物進(jìn)程是生物體內(nèi)同一系列分子有序的執(zhí)行某項(xiàng)特定功能也被稱為生理進(jìn)程。在分子功能ATP結(jié)合條目就有10個(gè)上調(diào)的差異蛋白，其他像DNA結(jié)合、錳離子結(jié)合、鋅離子結(jié)合、水解酶活性、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP和酶活性、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(ATP水解)活性和核糖體構(gòu)成過程也都富集到2個(gè)及以上的差異蛋白。在細(xì)胞組成分類的注釋中細(xì)胞膜成分、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)差異蛋白數(shù)目占比最大，而染色體和核糖體條目僅有個(gè)別差異蛋白涉及。生物進(jìn)程方面蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有5個(gè)差異蛋白參與，被動(dòng)運(yùn)輸有3個(gè)蛋白參與，DNA拓?fù)渥兓?、碳水化合物代謝過程、ATP合成質(zhì)子耦合運(yùn)輸以及翻譯都有2個(gè)差異蛋白參與，其余生物功能富集注釋都為1個(gè)差異蛋白。因本試驗(yàn)選取非標(biāo)記蛋白定量方法，與同位素標(biāo)記法有所不同的是所有蛋白都未進(jìn)行標(biāo)記而進(jìn)行測(cè)量，所以在差異蛋白中未發(fā)現(xiàn)NADH氧化酶和二氫硫辛酰胺脫氫酶這類已經(jīng)報(bào)道過的雞滑液囊支原體膜表面具有免疫原性的蛋白，但是該方法相較于其他蛋白鑒定方法而言，需要的蛋白量少，檢測(cè)覆蓋率更高。而其中上調(diào)的59個(gè)差異蛋白中，類似2，3-雙磷酸甘油酸非依賴性磷酸甘油酸變位酶可以催化2-磷酸甘油和3-磷酸甘油的相互轉(zhuǎn)化，且參與了D-甘油醛3-磷酸合成丙酮酸的亞通路生物過程，子通路又是糖酵解途徑的一部分，而糖酵解本身還是碳水化合物降解的一部分，關(guān)聯(lián)著整體生命基本代謝活動(dòng)的功能蛋白質(zhì)，可以影響激酶活性、D-氨基葡萄糖PTS滲透酶活性以及蛋白質(zhì)-N(PI)-磷酸組氨酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)，以及磷酸烯醇丙酮酸依賴糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)。最新的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)雞滑液囊支原體疫苗株MS-H帶有移碼突變，導(dǎo)致截短的寡肽滲透酶轉(zhuǎn)運(yùn)體OppF1表達(dá)。通過在MS-H基因組中引入OppF1基因的野生型拷貝體外研究突變對(duì)疫苗表型的影響，發(fā)現(xiàn)突變后的OppF1在MS-H中的染色體拷貝會(huì)被野生型OppF1所取代，但該突變對(duì)MS-H的生長和衰減的影響尚不清楚[15]。而MS-H是目前唯一的1株商品化弱毒溫度敏感型雞滑液囊支原體疫苗株。本試驗(yàn)鑒定結(jié)果在上調(diào)的59個(gè)差異蛋白中，有3個(gè)差異蛋白都是和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，Q4A6L6更是推測(cè)為ABC寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合蛋白OppF,影響ATP酶活性、ATP結(jié)合和肽轉(zhuǎn)運(yùn)。這一結(jié)果與其他研究結(jié)果的關(guān)聯(lián)性可以作為下步研究的重點(diǎn)方向。雖然還未出現(xiàn)雞滑液囊支原體致病機(jī)理的詳盡報(bào)道，但是作為G1和G95代次菌株鑒定出的差異蛋白結(jié)合其毒株弱化等特點(diǎn)，可以在今后的雞滑液囊支原體致病性等一系列的相關(guān)研究中作為重點(diǎn)篩查對(duì)象。

對(duì)差異蛋白進(jìn)行GO富集分析功能進(jìn)一步描述，下調(diào)差異蛋白涉及細(xì)胞組成分類下的細(xì)胞質(zhì)和分子功能的金屬離子結(jié)合過程的兩個(gè)方面，而上調(diào)蛋白則包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、肽轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA拓?fù)渥兓?、碳水化合物代謝過程和翻譯等多個(gè)生物學(xué)功能都有條目表達(dá)。從GO富集分析前 30 條目結(jié)果得出，差異蛋白GO注釋中蛋白質(zhì)運(yùn)輸條目富集最多，而翻譯出現(xiàn)的頻數(shù)最低。

綜上，試驗(yàn)通過選擇減少標(biāo)定定量對(duì)樣品限制的非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析，在檢測(cè)樣品中鑒定出428個(gè)雞滑液囊支原體可信蛋白，通過條件篩選出2個(gè)不同代次的支原體，共有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、胸苷激酶、組氨酸-tRNA連接酶等一共69個(gè)差異蛋白，其中包括14個(gè)無特征蛋白質(zhì)。相比于G1株傳代株G95株的差異蛋白有10個(gè)下調(diào)、59個(gè)上調(diào)。GO富集分析結(jié)果顯示下調(diào)和上調(diào)的差異蛋白在分子功能、細(xì)胞組成和生物進(jìn)程注釋下都有不同數(shù)目的富集，依據(jù)差異蛋白的GO ID對(duì)應(yīng)Unipot的蛋白功能注釋以及前人的研究成果，Q4A6L6作為寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合蛋白，后續(xù)值得繼續(xù)關(guān)注研究其更為具體的生理過程。其他差異蛋白結(jié)果也會(huì)有助于對(duì)雞滑液囊支原體相關(guān)調(diào)控機(jī)理等問題的深入探究。