李安定，楊兆馨，高亞楠，劉海林，李闖，蔣桂韜，燕海峰*

(1. 瀏陽市農(nóng)業(yè)發(fā)展事務(wù)中心，湖南 瀏陽 410300；2. 湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410131；3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

動(dòng)物精子密度是精液質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[1]，在人工授精技術(shù)、利用冷凍精液保存動(dòng)物遺傳資源與雜交改良、動(dòng)物繁殖性能評(píng)價(jià)等方面有重要的作用[2-3]。目前常用的精子密度測(cè)定方法有：目測(cè)估計(jì)法，簡(jiǎn)單廉價(jià)但主觀性強(qiáng)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，是精子密度判定的唯一客觀方法，但操作繁鎖且要求非常熟練才準(zhǔn)確[4-5]；計(jì)算機(jī)輔助分析法，設(shè)備與耗材昂貴，且操作技術(shù)要求高；吸光度法，相對(duì)簡(jiǎn)單、快捷，成本較低，結(jié)果也相對(duì)準(zhǔn)確。吸光度法(包括分光光度計(jì)、密度儀等)測(cè)定精子密度，主要是用特定波長(zhǎng)的光照射精液后，檢測(cè)該光被吸收的程度來實(shí)現(xiàn)。精子越多，吸光度就越大，建立精液吸光度與精子密度之間的這種函數(shù)關(guān)系后，就能通過測(cè)定的吸光度來計(jì)算出精子密度。吸光度法已廣泛應(yīng)用到豬、俄羅斯鱘、蟹類、狐等的精子密度測(cè)定中[6]。

精子密度儀是把吸光度與精子密度的函數(shù)關(guān)系，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)植入儀器，測(cè)定時(shí)可以直接讀取被測(cè)物質(zhì)精子密度的儀器，省去通過吸光度查找，或者計(jì)算精子密度的步驟。進(jìn)口的精子密度儀(如minitube SDM1)使用成本高，且一般限定只能檢測(cè)一種動(dòng)物，只能讀取精子密度，不能讀取吸光度，因此不能根據(jù)用戶的需求建立針對(duì)性強(qiáng)、更準(zhǔn)確的精液吸光度-精子密度函數(shù)，很難實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用。國(guó)產(chǎn)的精子密度儀大部分是用坐標(biāo)描圖的方式查出結(jié)果。此外，在建立精液吸光度-精子密度函數(shù)的方法方面，不同研究報(bào)道差別很大，缺乏簡(jiǎn)單、規(guī)范的方案。

朱利琴等[6]利用分光光度計(jì)和手持式豬精子密度儀對(duì)雞精子密度進(jìn)行測(cè)定，但檢測(cè)樣品所用的稀釋液(簡(jiǎn)稱“檢測(cè)液”)是3%的NaCl溶液，該液需要專門配制且浪費(fèi)大。高亞楠等[7]報(bào)道，手持式豬精子密度儀檢測(cè)雞精子密度，用商品化的0.9% NaCl溶液代替3.0% NaCl溶液作為稀釋液可行，雞0.9% NaCl的精子密度-精液吸光度函數(shù)為Y=-0.264X3+1.23X2+0.468X+0.019 (R2=0.999)，且鴨3.0% NaCl的精子密度-精液吸光度函數(shù)為Y=1.283X3-0.99X2+0.994X-0.009 (R2=0.996)，與雞的非常相似。

本文建立了利用手持式豬精子密度儀簡(jiǎn)單快捷測(cè)定牛精子密度的方法，為實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用，降低動(dòng)物精子密度儀購買成本，高效經(jīng)濟(jì)地測(cè)定動(dòng)物精子密度等提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

種公牛，飼養(yǎng)于湖南省家畜育種工作站；手持式豬精子密度儀(型號(hào)為TY-8018)，北京田園奧瑞生生物科技有限公司生產(chǎn)；稀釋液為0.9%的NaCl溶液(250 mL)，武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)[7]；3.0%的NaCl溶液為自行配制。

1.2 方法

1.2.1 牛精液稀釋倍數(shù)-吸光度檢測(cè)

在不影響種公牛凍精生產(chǎn)的同時(shí)，于2019年3至4月，選健康、圈養(yǎng)的13頭西門塔爾牛(其中9歲的4頭、2.5歲的9頭)、5頭安格斯牛(其中6歲的紅安格斯2頭、2.5歲的黑安格斯3頭)、3頭6歲的利木贊牛和7頭4歲的荷斯坦奶牛，共28頭種公牛用于采精。每頭牛每周采精2～4次，保證精液樣品無尿液、血液等污染物，采精量平均每頭為0.4 mL，用離心管收集多頭牛精液至4～5 mL，顛到混勻。

密度儀開機(jī)穩(wěn)定后，取2 000 μL 0.9% NaCl稀釋液于干凈待用的比色皿中，將比色皿放入手持式豬精子密度儀中，調(diào)零；用移液器吸取待測(cè)精液樣品200 μL，于含2 000 μL稀釋液的比色皿中(該過程待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)為11倍)，同時(shí)將移液器的槍頭浸入液體深處，分別在比色皿4個(gè)角落反復(fù)吹打1～2次后，壓住比色皿口，顛倒混勻3次左右，立即檢測(cè)吸光度。

根據(jù)上述所測(cè)樣品的吸光度及其稀釋倍數(shù)，估算出建立與驗(yàn)證曲線函數(shù)所需0.1、0.3、0.5、0.7、0.9等吸光度精液樣品的稀釋倍數(shù)。再從混合精液中分別取樣，根據(jù)估算的稀釋倍數(shù)分別進(jìn)行稀釋，分別獲得0.1、0.3、0.5、0.7、0.9等吸光度對(duì)應(yīng)的精液樣品。高倍稀釋需分2步進(jìn)行，每步取樣量大于50 μL。每個(gè)倍數(shù)取原精制作平行樣，每個(gè)平行樣讀取3次吸光度，得到牛精液稀釋倍數(shù)-吸光度表。試驗(yàn)于不同日期進(jìn)行9個(gè)批次的試驗(yàn)。

1.2.2 牛精液精子密度檢測(cè)

以上9個(gè)批次的牛精液，每個(gè)批次均用3% NaCl稀釋到適合計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)(一般為121倍，吸光度為0.1左右)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法獲得精子密度，方法見參考文獻(xiàn)[7]。計(jì)數(shù)時(shí)取原精制作3個(gè)平行樣，每個(gè)平行樣檢測(cè)3次以上(即重復(fù)數(shù)為9次)，通過計(jì)數(shù)密度推算出其他稀釋倍數(shù)樣品的精子密度，得到用于函數(shù)建立與驗(yàn)證所需的精液吸光度-精子密度數(shù)據(jù)表。

1.2.3 牛精液吸光度-精子密度函數(shù)的建立、驗(yàn)證與完善

上述9個(gè)批次試驗(yàn)，前6個(gè)批次的數(shù)據(jù)用于建立函數(shù)，后3個(gè)批次的數(shù)據(jù)用于驗(yàn)證函數(shù)。最后，為增加函數(shù)的可靠性，將9個(gè)批次數(shù)據(jù)匯總再次建立牛精液吸光度-精子密度函數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Excel軟件和SPSS 24.0軟件，分析和擬合牛精液吸光度-精子密度函數(shù)，建立回歸方程；用SPSS 24.0軟件，對(duì)函數(shù)計(jì)算密度和計(jì)數(shù)密度數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)樣品t檢驗(yàn)的差異顯著性分析。 數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛精液吸光度-精子密度數(shù)據(jù)

前6個(gè)批次牛精液吸光度測(cè)定，稀釋倍數(shù)在11～165倍，精液吸光度在0.1～1.176之間(見表1)。

表1 不同批次牛精液吸光度-精子密度測(cè)定(0.9% NaCl)

由表1可見，以0.9% NaCl為稀釋液對(duì)牛精液樣品分別稀釋11～165倍，用計(jì)數(shù)板法測(cè)定精子密度，計(jì)數(shù)密度在0.053億/mL～1.148億/mL 之間。由表2可見，以3% NaCl為稀釋液對(duì)牛精液樣品進(jìn)行精子密度測(cè)定(函數(shù)建立測(cè)定6次，驗(yàn)證測(cè)定3次)，計(jì)數(shù)的平均變異系數(shù)為9.64%，但稀釋88倍、165倍和其中2次121倍的變異系數(shù)大于10%，9個(gè)批次牛精子密度范圍在8.215億/mL～12.631億/mL。

2.2 牛精液吸光度-精子密度函數(shù)的建立與驗(yàn)證

前6個(gè)批次的數(shù)據(jù)(見表1)擬合出精液吸光度-精子密度回歸方程，為Y6=0.404X3-0.115X2+ 0.487X+0.06(R2=0.982)。

后3個(gè)批次通過配對(duì)樣品t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)吸光度在0.108～1.131之間，函數(shù)密度與計(jì)數(shù)密度無顯著差異(P>0.05)，平均相對(duì)誤差為9.5%，可以采用本研究的儀器、方法與函數(shù)來計(jì)算牛精液的精子密度。4月24日5種倍數(shù)的數(shù)據(jù)相對(duì)誤差均超過10%，剔除該天的數(shù)據(jù)后，函數(shù)多次測(cè)定樣品的平均相對(duì)誤差為5.61%(見表3)。

表2 不同批次牛精液計(jì)數(shù)板法測(cè)定精子密度(3% NaCl)

表3 不同批次牛精液吸光度-精子密度函數(shù)的驗(yàn)證(n=12)

2.3 牛精液吸光度-精子密度函數(shù)的完善

將9個(gè)批次的數(shù)據(jù)匯總，擬合函數(shù)方程為Y=0.403X3-0.165X2+0.533X+0.001(R2=0.980)，曲線見圖1。

牛0.9% NaCl曲線為本試驗(yàn)結(jié)果，其余曲線數(shù)據(jù)來源于參考文獻(xiàn)[7]

3 討論

3.1 精子密度儀的選擇與使用

目前動(dòng)物精子密度儀主要為豬的，其中原裝進(jìn)口的已把精液吸光度-精子密度函數(shù)植入儀器，讀數(shù)直接顯示精子密度。這些進(jìn)口密度儀也存在一些不足：1)無法修改函數(shù)，也不顯示吸光度，只能適應(yīng)某一種動(dòng)物，通用性不強(qiáng)；2)無法用精子計(jì)數(shù)等方法校正，影響儀器的準(zhǔn)確性；3)大部分儀器使用的是專用樣品池，使用成本高。國(guó)產(chǎn)的精子密度儀大部分需根據(jù)“精液吸光度-精子密度表”查詢結(jié)果，同樣這個(gè)數(shù)據(jù)表的通用性與準(zhǔn)確性也值得考慮。

本文中手持式豬精子密度儀，內(nèi)置的是豬精液吸光度-精子密度函數(shù)，檢測(cè)液不清楚，初次在湖南地方豬精子密度測(cè)定中使用，誤差較大。該密度儀使用的是通用比色皿，購買容易且價(jià)格低，方便檢測(cè)大量樣品，而且同時(shí)顯示密度與吸光度，給儀器校正與實(shí)現(xiàn)一機(jī)多用提供了可能。另外，該儀器在樣品測(cè)定結(jié)束后，應(yīng)立即將比色皿取出，因?yàn)楸壬笫疑w上后看不見里面是否有樣液，同時(shí)手持式豬精子密度儀不大，很容易在忘記拿出樣品液時(shí)整理儀器，導(dǎo)致樣品液潑灑在比色皿室內(nèi)，損壞儀器。

3.2 精子密度儀標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立方法

目前標(biāo)準(zhǔn)曲線使用的檢測(cè)液有雙蒸水、3% NaCl、2.9%檸檬酸鈉等，其中雙蒸水、3% NaCl等能殺死精子，精子在其中的均勻度可能受影響，測(cè)定時(shí)對(duì)混勻程度以及混勻后多久進(jìn)行測(cè)試都有較高的要求。而用0.9% NaCl時(shí)，精子活力很長(zhǎng)時(shí)間不會(huì)下降，可以減輕這種精子難混合均勻的影響，同時(shí)0.9% NaCl相對(duì)廉價(jià)且容易購買[7-8]。

已有報(bào)道，關(guān)于牛精液吸光度-精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，精液樣品的獲得全部是隨機(jī)采取單只牛精液，要得到0.1～1.0多種吸光度的精液樣品，且使樣品具有代表性，則需要很多牛只，難度很大[9-16]。高亞楠等[7]采取多個(gè)動(dòng)物的混合精液，通過稀釋得到所需不同吸光度的精液樣品，只計(jì)數(shù)1個(gè)適合計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)(即吸光度為0.1左右)樣品的密度，然后由這個(gè)計(jì)數(shù)密度推算其他稀釋倍數(shù)樣品的密度，建立了家禽精液吸光度-精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，降低了難度[7]。

3.3 畜禽精液吸光度-精子密度測(cè)定方法的準(zhǔn)確性

在早期的牛精液吸光度-精子密度研究中，很少有已經(jīng)置入函數(shù)的精子密度儀，主要采用的是分光光度計(jì)，且有直線、對(duì)數(shù)曲線、二次曲線等函數(shù)關(guān)系[9-16]。另外，還發(fā)現(xiàn)用同一研究的計(jì)數(shù)密度與函數(shù)密度差異不顯著，但不同研究者即使采用同一型號(hào)的儀器與相似的條件，函數(shù)也有直線與二次函數(shù)的差異[14-15]。

高亞楠等[7]報(bào)道，不同研究者使用同一儀器、同樣的方法獲得的吸光度-精子密度曲線類似，均為三次函數(shù)，但不同物種、不同檢測(cè)液的曲線有較大差異，牛的精子密度相對(duì)于其他3種動(dòng)物是最低的，精子密度越小曲線越平坦。當(dāng)吸光度在0.5以下時(shí)，幾種曲線幾乎都接近直線，尤其是雞、鴨的曲線，幾乎重合(如圖1)，這也許是很多研究報(bào)道吸光度在0.5以下測(cè)定相對(duì)更準(zhǔn)確，以及很多報(bào)導(dǎo)曲線為一次函數(shù)的原因。此外也提示，可以研發(fā)出畜禽精子密度測(cè)定通用儀器，但要統(tǒng)一檢測(cè)液與限定吸光值范圍。

黃紅衛(wèi)[17]用進(jìn)口分光光度計(jì)對(duì)20份水牛精液樣本(其中摩拉水牛l2份，尼里/拉菲水牛8份)進(jìn)行檢測(cè)，并與國(guó)產(chǎn)型分光光度計(jì)、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)差異不顯著。趙鵬等[18]檢測(cè)北京奶牛中心提供的50頭份牛冷凍精液，發(fā)現(xiàn)人工計(jì)數(shù)法的檢測(cè)結(jié)果(0.12億/mL)與進(jìn)口精子質(zhì)量計(jì)算機(jī)輔助精液分析(CASA)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果(0.11億/mL)之間差異不顯著。

有報(bào)道，待測(cè)樣品稀釋后到測(cè)定的時(shí)間間隔、待測(cè)樣品在比色皿中的混勻方式、稀釋液的種類與稀釋倍數(shù)等均對(duì)吸光度有顯著影響，移液器取樣方法、待測(cè)樣品進(jìn)入比色皿(一般是11倍稀釋)后的混勻方式對(duì)結(jié)果有顯著影響[7-8]。此外， 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法隨機(jī)誤差較大, 每次計(jì)數(shù)值都可能有較大的差異，操作者熟練與不熟練，相對(duì)誤差分別為10.11%與19.55%[19]。這也許就是以上研究出現(xiàn)分歧的原因。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)待測(cè)樣品吸入比色皿后的混勻方式進(jìn)行了改進(jìn)，方法的精度與可操作性上取得了較好效果。

然而，以上所有研究沒有討論所建立的精液吸光度-精子密度曲線的校正問題、使用的準(zhǔn)確性以及長(zhǎng)期使用后的穩(wěn)定性等，而這些恰恰是精子密度儀推廣應(yīng)用的前提。由于將校正與函數(shù)計(jì)算等程序置入密度儀有一定的難度，可以將以上函數(shù)計(jì)數(shù)開發(fā)為用手機(jī)APP來簡(jiǎn)化。

本文選用了小巧實(shí)用的手持式豬精子密度儀，簡(jiǎn)化了精液吸光度-精子密度函數(shù)建立方法，獲得了簡(jiǎn)單快捷、相對(duì)準(zhǔn)確的牛精子密度測(cè)定方法。建立的牛精液吸光度-精子密度為三次函數(shù)，Y=0.403X3-0.165X2+0.533X+0.001(R2=0.980)，將讀取的待測(cè)樣品吸光度代入方程，計(jì)算值乘以待測(cè)樣品總的稀釋倍數(shù)，即原精到待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)(如果不必稀釋則乘以1)與待測(cè)樣品加到比色皿中產(chǎn)生的稀釋倍數(shù)(一般為11倍)二者的乘積，即可得到原精樣品的精子密度，單位為億/mL。