周文美，陶陶，吳霜，王廷龍，楊正奕，張瑩

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州貴陽市 550001；2.貴州省人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州貴陽市 550002；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，貴州貴陽市 550002；4.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽市550004

缺血性腦卒中通常由栓塞或血栓性動脈阻塞引起，導(dǎo)致腦血流量減少，引起缺氧和目標(biāo)腦區(qū)域葡萄糖供應(yīng)中斷，細胞出現(xiàn)能量代謝減慢、壞死和凋亡[1]。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是缺血性腦卒中的繼發(fā)損傷，由于側(cè)支循環(huán)建立，在缺血中心區(qū)周圍的半暗帶，細胞仍可維持部分代謝活力[2]。防止缺血半暗帶區(qū)演變?yōu)楣Ｋ绤^(qū)，恢復(fù)神經(jīng)細胞活性，是缺血性腦卒中治療研究的熱點。

豐富環(huán)境是一種非侵入性干預(yù)方法，它依賴于自愿的身體活動、無壓力的調(diào)節(jié)、社會互動和對新刺激的引入，已被證實可以促進腦缺血后神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù)[3]。缺氧誘導(dǎo)因子?1α (hypoxia inducible factor?1α,HIF?1α)是機體缺血缺氧時觸發(fā)內(nèi)源性保護機制的始動因子和共同途徑，能通過調(diào)控下游葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白?1(glucose transporter 1,GLUT1)和6?磷酸果糖?2?激酶/果糖?2,6?雙磷酸酶3 (6?phosphofructo?2?kinase/fruc?tose?2,6?bisphosphatase?3,PFKFB3)的表達，改善葡萄糖代謝[4?6]。豐富環(huán)境可上調(diào)CIRI 大鼠腦組織HIF?1α表達，參與大腦神經(jīng)功能保護[7?8]。

本研究觀察豐富環(huán)境對大鼠CIRI模型神經(jīng)功能的療效，觀察腦組織病理結(jié)構(gòu)改變，檢測缺血半暗帶區(qū)ATP、ADP 和AMP 含量，以 及HIF?1α 及其下游GLUT1、PFKFB3 mRNA 和蛋白的表達，探討豐富環(huán)境對CIRI大鼠的腦保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF 級成年雄性Sprague?Dawley 大鼠72 只，體質(zhì)量240～260 g，購于貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)批準號SCXK(黔)2018?0001。本實驗在貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室和貴州省食品藥品檢驗所進行，所涉及的動物操作嚴格遵循動物倫理學(xué)的相關(guān)規(guī)定和準則。

采用隨機數(shù)字表法，分為假手術(shù)組、模型組和豐富環(huán)境組，各24只。

1.2 主要試劑與儀器

HIF?1α 兔多克隆抗體、β?actin 兔多克隆抗體：博奧森公司。PFKFB3 兔單克隆抗體：ABCAM 公司。GLUT1兔多克隆抗體：PROTEINTECH公司。PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒：TAKA?RA 公司。線栓：北京西濃科技有限公司。ATP 標(biāo)準品(93.0%)、ADP 標(biāo)準品(85.3%)、AMP 標(biāo)準品(92.7%)：中國食品藥品檢定研究院。山羊抗兔抗體：THERMO FISHER公司。

LC?20AT 高效液相色譜儀：日本島津公司。實時熒光定量PCR 儀：美國ABI 公司。ND2000 型超微量紫外分光光度計：美國THERMO FISHER公司。所有引物均由上海生工設(shè)計和合成。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立[9]

大鼠術(shù)前禁食12 h。大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸外、頸總和頸內(nèi)動脈，依次結(jié)扎頸外和頸總動脈近心端，微動脈夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈。經(jīng)頸總動脈近分叉處剪口，將直徑約0.26 mm 的線栓(前端燒熔成半球形，18 mm處有標(biāo)記)插入頸內(nèi)動脈，至感受到輕微阻力，插入深度(距頸總動脈分叉口)約18.0 mm。60 min后，緩慢退出線栓。

假手術(shù)組大鼠行相同手術(shù)步驟，但不插入線栓。

術(shù)后24 h 采用改良神經(jīng)損害嚴重程度評分(modi?fied Neurological Severity Scores,mNSS)[10]進行神經(jīng)功能評估。取7～12分大鼠進行后續(xù)實驗，不合格大鼠剔除，按隨機抽樣原則抽取備用大鼠補齊。

1.3.2 豐富環(huán)境和標(biāo)準環(huán)境設(shè)置[11]

豐富環(huán)境組于造模后立即飼養(yǎng)在豐富環(huán)境中。85×50×75 cm 金屬網(wǎng)格籠，籠內(nèi)有爬梯、鏈條、不同形狀管道、色塊、積木、球類和跑輪等玩具，每3 天重新布置環(huán)境1 次；每天持續(xù)播放舒緩音樂及多色光照射2 h，每籠飼養(yǎng)6只。

假手術(shù)組和模型組均飼養(yǎng)在標(biāo)準環(huán)境中。25×15×20 cm 塑料籠，籠內(nèi)僅放置墊料，每籠飼養(yǎng)2 只大鼠。所有動物籠內(nèi)飼料、墊料和水均一致，12 h 明暗循環(huán)條件，共飼養(yǎng)28 d。

1.3.3 mNSS

于造模前(0 d)及造模后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d，每組各取8只大鼠由一名不了解實驗分組的研究者對各組大鼠行mNSS評定。評分越高，損傷越嚴重。

1.3.4 取材

各組于造模后1 d、28 d，行mNSS 評定后，10%水合氯醛3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉后，斷頭處死大鼠，冰板上快速取出腦組織，預(yù)冷PBS 緩沖液洗凈，切取缺血半暗帶區(qū)腦組織[12]，假手術(shù)組取對應(yīng)部位，液氮速凍6 min 后，-80 ℃冰箱保存，用于mRNA、蛋白，以及ATP、ADP、AMP 檢測。剩余腦組織4%多聚甲醛固定，用于HE染色。

1.3.5 HE染色

各組取3 只，腦組織4%多聚甲醛液固定24 h 以上，石蠟包埋，切片厚4 μm，常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcrip?tion real?time quantitative polymerase chain reaction,RT?qPCR)

各組取6只大鼠腦缺血半暗帶區(qū)組織，Trizol溶液提取總RNA，紫外分光光度計測定濃度和純度，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green 試劑盒進行實時熒光定量多聚酶鏈式反應(yīng)，計算2-ΔΔCt值。引物序列如下。

HIF?1α：上游5'?AGA GTG GTA CTC ACA GTC GG?3'；下游5'?CCC TGC AGT AGG TTT CTG CT?3'。

GLUT1：上游5'?AGA GTC CAT CCC ATC CAC CA?3'；下游5'?CCT GCC AAA GCG ATT AAC AA?3'。

PFKFB3：上游5'?ATT GAA TAT GCC GTC TCC?3'；下游5'?CAC AAG ATA CAC ACA TGG?3'。

β?actin：上 游5'?ATT TGG CAC CAC ACT TTC TAC?3'；下 游5'?ATC TGG GTC ATC TTT TCA CGG?3'。

1.3.7 Western blotting

各組6 只大鼠腦缺血半暗帶區(qū)組織，充分研磨成勻漿，離心取上清液，紫外分光光度計下測量蛋白濃度。10%SDS?PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)膜2 h 后，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入HIF?1α(1∶1000)、GLUT1(1∶1000)、PFKFB3(1∶3000)和β?actin(1∶5000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜，次日洗膜后加二抗(羊抗兔IgG，1∶3000)室溫孵育1 h，滴加ECL 液顯色。以β?actin為內(nèi)參，利用Image J 軟件分析各條帶相對灰度值，測量3次，取均值。

1.3.8 高效液相色譜法

各組取3 只，稱取缺血半暗帶區(qū)腦組織500 mg，冰上用0.4 mol/L HCLO4制成10%勻漿。超聲粉碎后，低溫離心取上清液。加3 mol/L K2CO30.1 ml中和，離心、過濾后制成試品溶液，-80 ℃儲存。

采用高效液相色譜法測定ATP、ADP、AMP 含量。色譜條件：Waters Bridge R C18 反相色譜柱(4.6×150 mm,5 μm)。流動相：0.2 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉35.8 g、磷酸二氫鉀13.6 g、四丁基溴化氨1.61 g)，95%甲醇搖勻。檢測波長259 nm，流速1.0 ml/min，柱溫20 ℃，進樣量10 μl。

精密稱取標(biāo)準ATP 10.18 mg，ADP 10.87 mg，AMP 10.07 mg，超純水溶解，稀釋后ATP、ADP、AMP 的濃度分別為48.37 μg/ml、46.36 μg/ml、46.67 μg/ml。梯度稀釋(2、2.5、5、10、50、100 倍)，取各濃度梯度對照品溶液10 μl 進樣，得到標(biāo)準曲線，計算樣本ATP、AMP、ADP濃度，并進一步計算能量負荷(energy charge,EC)[13]。

每個樣本進樣3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以()表示，多組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 mNSS

各組造模前及假手術(shù)組各時間點mNSS 評分均為0，行為無異常；造模后1 d，模型組和豐富環(huán)境組均出現(xiàn)行走時向一側(cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈，感覺、平衡異常等神經(jīng)功能缺失癥狀，mNSS 評分高于假手術(shù)組(P ＜0.05)；術(shù)后14 d 開始，豐富環(huán)境組mNSS 評分較模型組降低(P ＜0.05)。見表1。

表1 各組各時間點mNSS比較

2.2 HE染色

假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)細胞規(guī)則排列，胞核居中，胞核胞質(zhì)染色均勻一致。術(shù)后1 d，模型組和豐富環(huán)境組腦組織出現(xiàn)明顯梗死區(qū)，可見細胞水腫，神經(jīng)元脫失或出現(xiàn)核固縮邊緣化、核仁消失，組織疏松呈空泡樣排列和拉網(wǎng)狀改變。術(shù)后28 d，模型組和豐富環(huán)境組水腫、神經(jīng)元脫失、核固縮、空泡等病理改變減少，豐富環(huán)境組細胞水腫等病理改變較模型組改善。見圖1。

圖1 各組腦病理改變(HE染色，bar=50 μm)

2.3 RT?qPCR

術(shù)后1 d，模型組和豐富環(huán)境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3 mRNA 均較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后28 d，模型組和豐富環(huán)境組HIF?1α、GLUT1 和PFKFB3 mRNA 表達雖有下降，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)，豐富環(huán)境組各mRNA表達高于模型組(P＜0.05)。見表2。

表2 各組HIF-1α、GLUT1和PFKFB3 mRNA表達(2-ΔΔCt)

2.4 Western blotting

術(shù)后1 d，模型組和豐富環(huán)境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3 蛋白量均較假手術(shù)組增高(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05)。術(shù)后28 d，模型組與豐富環(huán)境組HIF?1α、GLUT1和PFKFB3蛋白量降低，但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)；豐富環(huán)境組各蛋白量高于模型組(P＜0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組HIF-1α、PFKFB3和GLUT1蛋白表達(Western blotting)

表3 各組HIF-1α、PFKFB3和GLUT1蛋白表達(/β?actin)

2.5 高效液相色譜法

出峰次序依次為AMP、ADP 和ATP，保留時間分別為7.928 min、8.944 min 和13.438 min，與腦組織雜質(zhì)峰分離良好。見圖3。

圖3 高效液相色譜法分離ATP、ADP和AMP色譜圖

術(shù)后1 d，與假手術(shù)組相比，模型組、豐富環(huán)境組ATP、ADP 和EC 下降，AMP 上升(P ＜0.05)；術(shù)后28 d，模型組、豐富環(huán)境組ATP 和EC 低于假手術(shù)組(P ＜0.05)，但豐富環(huán)境組高于模型組(P ＜0.05)。見表4。

表4 各組ATP、ADP、AMP和EC變化

3 討論

CIRI 會加重腦組織損傷和神經(jīng)功能障礙[14]。腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)除受到生理、病理因素影響外，還與環(huán)境因素密切相關(guān)[15]。

豐富環(huán)境通過配備各種有康復(fù)作用的玩具，提供溫馨的生活環(huán)境，給予研究對象感覺、運動、社會交往等方面的綜合刺激，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[16?17]。神經(jīng)功能依賴于腦組織能量代謝，而能量代謝障礙在腦組織器質(zhì)性病變發(fā)生之前就已經(jīng)出現(xiàn)[18]。長期豐富環(huán)境干預(yù)可通過增強突觸活動、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)等方式，恢復(fù)缺血后能量代謝紊亂，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[19?20]。

腦的能量代謝狀況可通過ATP 的變化觀察。在腦缺血模型中，ATP 從缺血核心區(qū)到缺血半暗帶區(qū)呈增加趨勢，細胞也表現(xiàn)出從壞死向凋亡的轉(zhuǎn)變[21]。本研究顯示，豐富環(huán)境干預(yù)28 d 后，缺血半暗帶區(qū)腦組織ATP 較模型組增高，反映細胞能量狀態(tài)的EC 進一步增大；同時，神經(jīng)功能改善，缺血半暗帶組織病理改變減輕。

Amaral 等[22]發(fā)現(xiàn)，腦缺血缺氧后，糖酵解成為腦組織的主要能量來源，缺氧細胞傾向于消耗更多葡萄糖滿足能量需求。葡萄糖轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵蛋白GLUT1 表達增高代表這種適應(yīng)性轉(zhuǎn)變[23?24]。PFKFB3有很強的凈激酶活性，抑制PFKFB3 導(dǎo)致糖酵解減少，其介導(dǎo)的葡萄糖代謝是神經(jīng)保護的重要靶點[25]。本研究顯示，豐富環(huán)境干預(yù)后，GLUT1、PFKFB3 表達上調(diào)，提示豐富環(huán)境可能增加葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖酵解速度，改善能量供應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

HIF?1α 可改善缺血后神經(jīng)元存活，促進神經(jīng)功能恢復(fù)[26?27]。本研究顯示，腦缺血后，缺血半暗帶區(qū)HIF?1α表達立即增加，豐富環(huán)境干預(yù)后，HIF?1α表達較模型組增高。與以前的研究相符[7?8]。組織缺氧時，HIF?1α主要通過與其下游低氧反應(yīng)元件結(jié)合，介導(dǎo)相應(yīng)蛋白產(chǎn)物表達，激活機體應(yīng)對缺血缺氧引起的病理性損傷[5]。HIF?1α激活后，上調(diào)GLUT1表達，為糖酵解途徑補充葡萄糖[28]。在PFKFB3基因增強子區(qū)域中含有2 個拷貝的HIF?1α 結(jié)合基序(5'?ACGTG?3')[29]，在缺氧條件下通過HIF?1α 介導(dǎo)PFKFB3 表達上調(diào)[30]，進而增強糖酵解途徑，提高細胞對缺氧的耐受。本研究顯示，豐富環(huán)境干預(yù)后，缺血半暗帶區(qū)HIF?1α、GLUT1、PFKFB3 的mRNA 與蛋白表達趨勢一致，推測豐富環(huán)境可能通過上調(diào)HIF?1α 的表達，上調(diào)GLUT1 和PFKFB3 的表達，改善缺血區(qū)葡萄糖代謝，促進神經(jīng)元的存活。

綜上所述，豐富環(huán)境可促進CIRI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，其機制之一可能通過上調(diào)腦缺血半暗帶區(qū)HIF?1α及其下游GLUT1、PFKFB3 的表達，提高葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖酵解速度，調(diào)節(jié)腦損傷后能量穩(wěn)態(tài)，從而改善其神經(jīng)功能。進一步可通過敲除或過表達HIF?1α 基因，來檢測GLUT1、PFKFB3 表達水平，明確豐富環(huán)境對HIF?1α以及GLUT1、PFKFB3的調(diào)控關(guān)系。

豐富環(huán)境作為一種輔助手段，對腦卒中患者神經(jīng)功能，特別是認知功能和日常生活能力有促進作用[31]，有良好的應(yīng)用前景。但臨床豐富環(huán)境的設(shè)置及干預(yù)時間、強度等問題還需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。