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        濃縮血小板的制備和保存過程中血小板表面組織因子的表達(dá)

        2021-05-28 05:59:18何博譚愛玲胡文娟陳小光黃小敏陳漢妹黃小琴
        實用醫(yī)學(xué)雜志 2021年8期
        關(guān)鍵詞:研究

        何博 譚愛玲 胡文娟 陳小光 黃小敏 陳漢妹 黃小琴

        1廣州血液中心(廣州510095);2廣州市醫(yī)學(xué)重點實驗室(血液安全重點實驗室)(廣州510095)

        血小板數(shù)量減少或者功能異常患者需要輸注大量血小板以預(yù)防或阻止出血[1]。這些以高濃縮血小板懸浮液的形式提供的血小板即血小板濃縮物(platelet concentrate,PC)[2]。PC輸注成功的關(guān)鍵是血小板具有良好的止血潛力。而血小板減少癥病患需要輸注大量血小板以預(yù)防或阻止出血[3]。特別是輸注PC治療病患時,必須高效、及時的止血[4]。

        由于多種原因,評估PC療效并不容易。輸注適應(yīng)癥存在異質(zhì)性,病患從意外創(chuàng)傷到大手術(shù)再到血液腫瘤和遺傳性或獲得性血小板疾病等包括多種類型。對于每種適應(yīng)癥,均難以實現(xiàn)患者群體一致性,并且所有患者并非都出現(xiàn)(嚴(yán)重)出血。此外,缺乏標(biāo)化的指標(biāo)客觀測量血小板在輸血功效中的作用。既往PC活力等檢測只反映濃縮方法的效率而并非血小板質(zhì)量。組織因子(tissue factor,TF)是凝血級聯(lián)反應(yīng)的啟動子,與血Ⅶ/Ⅶa結(jié)合形成復(fù)合物后,啟動外源性凝血途徑,并與血小板互作,形成纖維蛋白[5]。二者共同參與止凝血反應(yīng)過程,并扮演重要角色。前期研究表明血小板表面存在TF[5]。此外,在實驗條件控制良好的情況下,血小板顆粒和小管系統(tǒng)中含有活化的TF。然而,這種TF是血小板來源的,還是通過微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移機制從白細(xì)胞中獲得的,仍存在爭議。并且目前未見評估獻(xiàn)血員全血和輸血用PC表面TF表達(dá)的研究[6]。流式細(xì)胞術(shù)是研究血小板表面組織因子表達(dá)模式的有力工具,能夠反映血小板活化引起的變化。因此,本研究旨在探討PC的制備和保存過程中血小板表面TF的表達(dá)變化以及變化程度,并預(yù)測該蛋白是否可以作為血小板止血潛力的指標(biāo)。為了校準(zhǔn)分析,使用多個血小板激活標(biāo)記物,如P?選擇素(CD62P)[7]、纖維蛋白原[8]和GPIIb(CD41)[9]。本研究還在病患基線資料基礎(chǔ)上分析了獻(xiàn)血員ABO血型對TF和其他止血標(biāo)志物表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 血液采集和樣品制備收集自我中心的189名獻(xiàn)血員,男156例,女24例,包括O組(O型血)68例,A組(A型血)64例,B組(B型血)48例,AB組(AB型血)9例,全血共(452±53)mL置于CPD采血五聯(lián)袋。獻(xiàn)血員平均年齡(42.8±22.1)歲,血小板計數(shù)為(229.7±45.5)×109/L。在獻(xiàn)血日(第0天),從每個血袋中取500 μL用于流式細(xì)胞術(shù)分析血小板表面抗原表達(dá)。

        1.2 PC制備從采血(第1天)起24 h內(nèi),在我中心制備PC。采集后6 h內(nèi)分別對以上三組五聯(lián)袋采集的全血第一次離心(2 100 g×12 min);溫度(22±2)℃,分出白膜層血小板,靜置30 min后,再次離心(400 g×8 min),將血小板轉(zhuǎn)移至血小板袋內(nèi),即為濃縮血小板[10]。在(22±2)℃環(huán)境下靜置1~2 h,待其自然解聚后,輕輕搖動血袋,使其成均勻混懸液。全自動血細(xì)胞分析儀進行血小板計數(shù)。在同一天(第1天)和存儲3 d(第4天)或4天(第5天)后進行流式細(xì)胞術(shù)。

        1.3 流式細(xì)胞儀分析BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測,CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。通過常規(guī)方法,單抗免疫熒光標(biāo)記測定平均熒光強度或特異性熒光抗體結(jié)合陽性血小板的百分率來檢測血小板的活化情況。將5 μL獻(xiàn)血員全血或PC樣品添加到100 μL PBS中,分別加入飽和濃度的TF?FITC,CD62P?FITC,纖維蛋白原?FITC,CD41?FITC(均采購自Invitrogen流式細(xì)胞儀抗體,美國)。使用同型對照IgG?FITC抗體作為陰性對照。所有標(biāo)記均在流式細(xì)胞儀試管中進行(Attune NxT,Invitrogen)。在室溫20 min后,將樣品稀釋于600 μL PBS中,并立即通過流式細(xì)胞儀進行分析。對于每個標(biāo)記,記錄陽性血小板占血小板總數(shù)的百分比;數(shù)據(jù)同時分析為以任意單位表示的平均熒光強度(aver?age fluorescence intensity,MFI),熒光信號強度與抗原密度直接相關(guān)。并計算第4天或第5天與第1天的值之間的陽性血小板或MFI的百分比差異。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)檢測變量的分布,采用t檢驗比較計量資料兩組之間的差異。在P<0.05時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PC制備對血小板TF的影響見圖1,與獻(xiàn)血員全血(非黑色柱)相比,PC(黑色柱)中的TF和其他標(biāo)志物的表達(dá)明顯高于全血(P<0.05)。其中TF增加48%[血小板陽性率(14.8±5.4)%],纖維蛋白原增加38.2%[血小板陽性率(23.9±10.2)%],CD62P增加150%[血小板陽性率(26.5±13)%]和CD41增加10.3%[MFI(9 920±2 761)單位],說明PC制備可促進TF活化。

        圖1 PC(黑色柱)制備對血小板表面上的TF、纖維蛋白原、CD62P和CD41的表達(dá)影響Fig.1 Expression of TF,fibrinogen,CD62P,and CD41 on platelet surface in freshly prepared PC(black bars)

        2.2 PC儲存對血小板TF的影響在PC儲存期間,從第1天到第5天,TF以及其他血小板標(biāo)記物的水平持續(xù)增加(圖2)。特別是在第5天,TF的陽性血小板百分比(平均升高)增加了32%(相對于第1天,P<0.05),纖連蛋白原的上升了31%(P<0.05),CD62P水平上升了148%,CD41隨時間MFI逐漸上升,說明PC儲存可促進TF活化。

        2.3 各組獻(xiàn)血員全血血小板中TF分析見圖3。流式細(xì)胞儀分析的全部獻(xiàn)血員及其ABO血型的全血血小板中TF的表達(dá)。TF陽性血小板的平均百分?jǐn)?shù)為(10±6.7)%。與A組(9±5.2)%,B組(8.4±5.3)%和AB組(7.9±4.9)%獻(xiàn)血員相比,O組的血液樣本顯示TF陽性的血小板百分比(11.7±4.8)%高于前兩組(均P<0.05)。說明TF存在于各組獻(xiàn)血員血小板表面,且O型血TF表達(dá)顯著高于非O型血。

        2.4 ABO血型組濃縮后與各指標(biāo)關(guān)系根據(jù)ABO血型分析顯示(表1),除TF抗原密度在A組血小板中最低,與其他血型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外,其他評估指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。說明除TF外,ABO血型對活化各指標(biāo)無影響。

        圖2 PC儲存對血小板止血指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of PC storage on platelet hemostatic markers

        圖3 健康獻(xiàn)血員全血中血小板表面的TF表達(dá)Fig.3 TF expression on platelet surface in donor whole blood

        3 討論

        血小板以高濃縮血小板懸浮液的形式提供,即所謂的PC,通過單采血液從單個獻(xiàn)血員或合并多個隨機獻(xiàn)血員富含血小板的血漿中獲得[11]。由于存在細(xì)菌污染風(fēng)險和所謂的“血小板儲存損傷”現(xiàn)象[12],一般建議盡快使用PC;在我國,通常是在準(zhǔn)備PC后的5 d內(nèi)使用[13]。關(guān)于凝血受體,一些研究表明血小板表面存在TF[14-15]。TF是一種膜糖蛋白,是血漿凝血因子Ⅶ的高親和力受體。TF/FVIIa復(fù)合物觸發(fā)外在途徑,最終導(dǎo)致凝血酶生成和纖維蛋白形成[16]。此外,在良好控制的實驗條件下,血小板在α顆粒和小管系統(tǒng)中含有功能性活性TF[17-19]。按以上結(jié)果表明,獻(xiàn)血員全血血小板存在TF,在PC制備和保存過程中其表達(dá)得以保留。

        表1 ABO血型各指標(biāo)關(guān)系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

        表1 ABO血型各指標(biāo)關(guān)系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

        所有組O組A組B組AB組4.7±5.514.1±6.614.5±3.816.5±7.615.7±6.1 655±223755±269562±116651±166647±187 TF平均百分?jǐn)?shù)(%)MFI纖維蛋白原平均百分?jǐn)?shù)(%)MFI CD62P平均百分?jǐn)?shù)(%)MFI CD41平均百分?jǐn)?shù)(%)MFI 1 23.7±10.4 815±415 26.6±12.8 1 038±425 100 9 923±2758 24.8±11.1 768±308 25.3±11.3 1 025±465 100 9 375±3 275 23.3±8.1 792±471 26.6±15.2 985±355 100 9 668±2 210 22.5±12.5 952±332 26.6±19.3 1 126±355 100 10 875±1 750 23.5±11.3 738±365 25.3±15.6 1 026±386 100 9 785±2 021

        PC輸血成功的關(guān)鍵是血小板具有良好的止血潛力[20]。特別當(dāng)給予PC來停止正在進行的出血事件時,血小板止血作用必須是有效且快速的?,F(xiàn)在有大量研究支持以下證據(jù)[21-23]:血小板不僅通過形成血小板栓塞參與原發(fā)止血過程,而且還可以通過提供特定的高親和力受體,蛋白酶,酶原和輔因子來積極促進凝血級聯(lián)的傳播,從而有助于將凝血酶的產(chǎn)生定位在血管損傷的部位[24]。不管血小板TF的來源如何,它的存在顯著促進凝血作用。以上均強調(diào)PC保持TF表達(dá)的重要性,并本研究表明,PC制備和儲存后,血小板表面的TF沒有被去除,TF增加分別為48%、32%。在PC存儲期間TF陽性血小板的百分比增多。P?選擇素是測量血小板活化的經(jīng)典標(biāo)志物。本研究數(shù)據(jù)顯示,在PC制備和儲存過程中,標(biāo)志物的表達(dá)均顯著增加,這與以前的報道是一致的。P?選擇素這被認(rèn)為是最敏感的血小板活化標(biāo)記,無論是從全血處理到PC和存儲期間均呈現(xiàn)顯著增加。在PC儲存結(jié)束時,與全血相比,P?選擇素陽性血小板的百分比增加了約150%。表明TF可能是另外一個有潛在標(biāo)志物,并且,TF對于血小板活化的臨床療效,可能更具有直接意義。目前的工作還評估了ABO血型對血小板止血參數(shù)的影響,這一領(lǐng)域還在初步探索階段。早期已證明ABO血型對血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)和凝血因子VIII有顯著影響[25],這兩種標(biāo)記物的循環(huán)水平O組受試者比非O組受試者更低。筆者觀察到,來自O(shè)組的血小板對TF的陽性率最高。但在PC制備后,在ABO血型之間的血小板止血標(biāo)志物的差異消失了。結(jié)果顯示血型并不會影響PC制備后止血標(biāo)記物的表達(dá)。

        本研究的局限性歸納為以下幾點:首先,本研究僅納入180名獻(xiàn)血員。其次,僅利用流式細(xì)胞儀評估制備及儲存對于血小板的影響。最后,依然是單中心研究。因此,進一步研究需要經(jīng)多種類型的血液自動分析儀進行大規(guī)模的多中心分析,以驗證本研究結(jié)果的可靠性。

        總之,以上結(jié)果均表明,在PC制備過程中直至儲藏期結(jié)束,血小板表面均有TF表達(dá)。當(dāng)然,凝血分子機制極為復(fù)雜,研究僅局限在TF表達(dá)方面,并且臨床醫(yī)生及研究小組的科學(xué)能力會影響結(jié)果評估。血小板與TF表達(dá)之間有密切關(guān)系,血小板在止血、凝血及血栓性疾病發(fā)病方面起著其他重要的作用,因此在輸血實踐中,將進一步研究對接受受試者的止血平衡產(chǎn)生臨床相關(guān)影響。

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