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        梅毒血清固定患者NLRP3炎癥小體及細(xì)胞因子表達(dá)的研究

        2021-05-28 05:59:18魯東平張榮王芬魏少鳳賈婕張偉蓮劉婷梁瑞楊文志
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2021年8期
        關(guān)鍵詞:血清

        魯東平 張榮 王芬 魏少鳳 賈婕 張偉蓮 劉婷 梁瑞 楊文志

        1深圳市寶安中醫(yī)院(集團(tuán))(廣東深圳518133);2深圳市寶安區(qū)慢性病防治院皮膚科(廣東深圳518133);3鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市婦幼保健院產(chǎn)科(湖北黃石435000);4深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院(廣東深圳518102)

        梅毒血清固定是早期梅毒治療后血清學(xué)結(jié)果長(zhǎng)期保持陽(yáng)性的一種特殊狀態(tài),隨著梅毒發(fā)病率增長(zhǎng)迅速,診斷為梅毒血清固定的病例也有明顯增加[1],梅毒血清固定患者體內(nèi)有沒(méi)有梅毒螺旋體(Tp)存在?有沒(méi)有必要反復(fù)治療?諸多疑惑困擾著患者,他們的身心健康及家庭關(guān)系受到影響[2]。在臨床隨訪工作中這種現(xiàn)象比較普遍,但是目前關(guān)于該病的成因還不清楚。

        核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白3(NLRP3)炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)多蛋白復(fù)合物,由NLRP3、凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和前體胱天蛋白酶?1(Pro?caspase?1)組成,是天然免疫中重要的模式識(shí)別受體,通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo),激活炎癥因子;一旦該信號(hào)通路被激活,會(huì)誘導(dǎo)IL?1β和IL?18的分泌和成熟,它們會(huì)在感知細(xì)菌、螺旋體等的感染的天然免疫中,以及在宿主對(duì)感染而產(chǎn)生的獲得性免疫反應(yīng)中起著重要作用[3-4]。已有報(bào)道證實(shí)在兔模型中NLRP3炎癥小體參與了梅毒感染引起的炎癥過(guò)程[5],但是它們是否與梅毒血清固的形成相關(guān)尚未見(jiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT?PCR)檢測(cè)梅毒血清固定患者及健康人的外周血單核細(xì)胞NLRP3炎癥小體的表達(dá),探討NLRP3信號(hào)通路相關(guān)因子在梅毒血清固定患者中的作用,從天然免疫方向來(lái)研究梅毒血清固定可能的發(fā)病機(jī)制,為該病的防治提供理論依據(jù)。

        1 對(duì)象與方法

        1.1 研究對(duì)象與分組病例的選擇:選取2018年9月至2020年9月在我院就診時(shí)已確診為梅毒血清固定患者50例作為實(shí)驗(yàn)組,其中男26例,女24例,年齡22~40歲,平均(26.3±4.2)歲;納入標(biāo)準(zhǔn):(1)配偶或患者有不潔性交史;(2)每例病人均已接受過(guò)規(guī)范的梅毒治療方案驅(qū)梅治療,無(wú)臨床癥狀或治療后臨床癥狀消失;(3)3年隨訪期間經(jīng)TRUST、TPPA檢測(cè)均陽(yáng)性,第一年每3個(gè)月有復(fù)查1次,第二年每6月復(fù)查血清1次,第三年復(fù)查血清1次;在隨訪期間滴度無(wú)下降或上升4倍的情況,TRUST滴度均≤1∶8;(4)HIV抗體檢測(cè)陰性;無(wú)生物學(xué)假陽(yáng)性;(5)配偶或性伴長(zhǎng)期性接觸未被傳染,育齡女性分娩的嬰兒未被傳染。實(shí)驗(yàn)組所有研究對(duì)象同時(shí)滿足以上5個(gè)條件[6]。

        健康對(duì)照組的選擇:根據(jù)兩組年齡和性別構(gòu)成選健康志愿者50例作為對(duì)照組,其中男24例,女26例,年齡24~41歲,平均(25.8±4.1)歲;納入標(biāo)準(zhǔn):(1)HIV抗體檢測(cè)陰性;(2)血清學(xué)TRUST連續(xù)兩次(間隔1月復(fù)查)檢查陰性。對(duì)照組所有研究對(duì)象同時(shí)滿足以上2個(gè)條件。兩組性別、年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究符合醫(yī)院倫理委員會(huì)要求。

        排除標(biāo)準(zhǔn):排除患有2型糖尿病、肥胖、痛風(fēng)、矽病、阿爾茨海默病及克羅恩病等已知的可以影響NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的疾??;排除各種急慢性感染性疾病、嚴(yán)重的肺部疾病、肝臟及腎臟疾病。

        1.2 方法

        1.2.1 樣本收集采集來(lái)我院就診的梅毒血清固定患者(50例)及健康志愿者(50例)的外周血。采集前,進(jìn)行常規(guī)消毒采集點(diǎn)及周圍皮膚,經(jīng)肘部靜脈采集外周靜脈血8 mL,共分二管,迅速置于肝素化的抗凝管中。

        1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT?PCR)采用Ficoll?Hypaque淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法,分離各樣本PBMCs;采用Trizol(大連TaKaRa公司)法提取PBMCs中的mRNA;用BioMate 3S分光光度計(jì)測(cè)量260 nm和280 nm波長(zhǎng)處理的OD值檢測(cè)mRNA純度、含量及完整性;使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(大連TaKaRa公司)進(jìn)行qRT?PCR。簡(jiǎn)要步驟為先去除基因組DNA;隨后立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,體系如下:37℃,15 min;85℃,5 s;4℃保存;最后于Bio?熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)BIO?RAD公司)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增;擴(kuò)增條件:預(yù)變性95℃,30 s;PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán),變性95℃,5 s;復(fù)性延伸60℃,30~60 s;PCR各基因所用引物引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列如表1;結(jié)果目的基因的表達(dá)水平通過(guò)GAPDH(glyceraldehyde?3?phosphate de?hydrogenase)進(jìn)行歸一化處理,采用2?ΔΔCt法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量。

        表1 qRT?PCR所用引物Tab.1 Primers used for qRT?PCR in this study

        1.2.3 ELISA測(cè)定血清IL?1β和IL?18的含量取抗凝血4 mL,迅速室溫1 000×g離心30 min收集樣本,小心取上清,分裝后-20℃儲(chǔ)存。采用Hu?man IL?1β High Sensitivity ELISA Kit(人白介素1β高敏ELISA試劑盒)和Human IL?18 ELISA Kit(人白介素18 ELISA試劑盒)購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,測(cè)定IL?1β和IL?18的含量,步驟嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

        1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示?;蛳鄬?duì)表達(dá)量及細(xì)胞因子水平的組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,梅毒血清固定組PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)均低于健康組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1),mRNA具體的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。

        圖1 梅毒血清固定患者PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的表達(dá)水平Fig.1 Expression of NLRP3,ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs of patients with syphilis serofast state

        表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative expression of NLRP3,ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

        表2 PBMCs中NLRP3、ASC及Caspase?1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.2 The relative expression of NLRP3,ASC and Caspase?1 mRNA in PBMCs ±s

        Group Health Serofast state t值P值Case 50 50/ /NLRP3 mRNA 1.18±0.19 0.99±0.15 5.53<0.001 ASC mRNA 1.07±0.19 0.89±0.17 5.02<0.001 Caspase?1 mRNA 1.08±0.18 0.90±0.18 4.96<0.001

        2.2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β及IL?18mRNA的表達(dá)水平均較健康者低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2),mRNA具體的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表3。

        圖2 梅毒血清固定患者PBMCs中IL?1β和IL?18 mRNA的表達(dá)水平Fig.2 Expression of(A)IL?1β and(B)IL?18 mRNA in PBMCs of patients with syphilis Serofast state

        2.3 梅毒血清固定患者血清中的IL?1β和IL?18含量統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示,梅毒血清固定患者血清 中IL?1β和IL?18的含量均低于健康者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3),具體表達(dá)量見(jiàn)表4。

        表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

        表3 PBMCs中IL?1β及IL?18 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Tab.3 The relative expression of IL?1β and IL?18 mRNA in PBMCs±s

        GroupCaseIL?1β mRNAIL?18 mRNA Health500.91±0.160.88±0.15 Serofast state t值P值50/ /0.66±0.10 9.24<0.001 0.56±0.11 11.87<0.001

        圖3 梅毒血清固定患者血清中IL?1β和IL?18的水平Fig.3 IL?1 β and IL?18 in serum of patients with syphilis serofast state

        表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

        表4 血清中IL?1β及IL?18水平的差異Tab.4 Difference of IL?1β and IL?18 levels in serum±s

        GroupCaseIL?1β(pg/mL)IL?18(pg/mL)Health images/BZ_84_1404_2704_1566_2755.png3.55±0.90249.58±22.26 Serofast state502.98±0.87193.75±14.82 t值/3.2514.76 P值 /0.0016<0.001

        3 討論

        早期梅毒患者確診后經(jīng)規(guī)范用驅(qū)梅治療,絕大部分患者的臨床癥狀完全消失,達(dá)到臨床治愈,但有部分患者治療后梅毒血清學(xué)試驗(yàn)在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不會(huì)轉(zhuǎn)陰,表現(xiàn)為梅毒血清固定,已有報(bào)道其發(fā)生率約為15%~44.4%[7-8]。在臨床隨訪過(guò)程中這樣的患者有很多,目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,讓醫(yī)患都感到困惑。該病的相關(guān)研究主要在獲得性免疫方面,關(guān)楊等[9-10]認(rèn)為梅毒血清固定患者存在嚴(yán)重的細(xì)胞免疫失衡和免疫抑制,從而使少量的TP逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的捕獲,導(dǎo)致慢性感染;周平玉[11]則認(rèn)為:梅毒血清固定可能是機(jī)體的一種特殊的免疫狀態(tài)而非TP的持續(xù)存在。為了弄清楚其成因,近來(lái)國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)天然免疫在梅毒血清固定形成中的作用開(kāi)展了一些研究,并認(rèn)為天然免疫在其中也有重要的作用[12-14]。NLRs家族的NLRP3炎癥小體在調(diào)節(jié)天然和獲得性免疫反應(yīng)時(shí),因其具有參與免疫和抗微生物等重要作用而備受關(guān)注[15]。已有研究表明NLRP3炎癥小體在梅毒感染免疫中發(fā)揮了重要作用[15],但目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)關(guān)于NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關(guān)系的報(bào)道。本研究采用病例對(duì)照研究的方法,通過(guò)qRT?PCR檢測(cè)梅毒血清固定患者和健康者PBMCs中NLRP3炎癥小體及細(xì)胞因子,探究NLRP3炎癥小體與梅毒血清固定的形成關(guān)系。

        NLRP3炎性小體是NLRs家族成員中被研究最多的受體,它是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的蛋白復(fù)合物,由NLRP3、ASC和Pro?caspase?1組成;ASC是NLRP3炎性小體的重要的接頭蛋白,連接上游的NLRP3和下游的Pro?caspase?1,caspase?1是NLRP3炎性小體的效應(yīng)蛋白,是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡的一類蛋白酶家族[16]。正常情況下,它以無(wú)活性的前體形式存在,其激活依賴于炎性復(fù)合體被外源入侵微生物或者由組織損傷產(chǎn)生的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào),激活后將無(wú)活性Pro?caspase?1轉(zhuǎn)變成有活性的caspase?1,進(jìn)而能將無(wú)活性的促炎細(xì)胞因子IL?1β和IL?18的前體剪切加工為成熟的IL?1β和IL?18[17];這兩個(gè)細(xì)胞因子均屬于IL1家族成員,具有多樣生物學(xué)活性,是Th1細(xì)胞生長(zhǎng)和分化因子;可以誘導(dǎo)活化B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN?γ;還可以通過(guò)上調(diào)Fasl表達(dá)來(lái)促進(jìn)NK細(xì)胞毒性;它們作為促炎癥細(xì)胞因子而參與炎癥反應(yīng),參與機(jī)體的抗感染免疫,及時(shí)有效地清除病原體[18-20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示梅毒血清固定患者PBMCs中的NLRP3、ASC及Caspase?1mRNA表達(dá)明顯低于健康者(P<0.05),提示梅毒血清固定患者體內(nèi)參與天然免疫的NLRP3信號(hào)通路存在異常,且該信號(hào)通路下游的IL?1β和IL?18的表達(dá)和分泌也均低于健康者(P<0.05),推測(cè)此類患者體內(nèi)IL?1β和IL?18的下調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞、Th1型細(xì)胞因子、T細(xì)胞減少或表達(dá)失衡,導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能抑制,在梅毒感染免疫的過(guò)程中機(jī)體對(duì)Tp的免疫清除能力降低,形成梅毒血清固定現(xiàn)象。相關(guān)研究顯示梅毒血清固定患者外周血中NK細(xì)胞顯著降低,NK細(xì)胞數(shù)量降低可能是導(dǎo)致該現(xiàn)象形成的重要原因[21]。國(guó)內(nèi)外已有的研究表明梅毒血清固定患者存在外周血Th1型細(xì)胞因子、Th17和CD4+T細(xì)胞減少,會(huì)導(dǎo)致Th1/Th2型細(xì)胞因子的失衡、Treg/Th17和CD4+T/CD8+T細(xì)胞免疫失衡,致使機(jī)體的梅毒感染免疫應(yīng)答受到抑制,小部分Tp逃過(guò)機(jī)體的細(xì)胞免疫,未能被及時(shí)徹底清除,形成梅毒血清固定[10,22-23]。說(shuō)明NLRP3炎癥小體及下游細(xì)胞因子可能在抗Tp感染免疫的過(guò)程中,對(duì)正常啟動(dòng)獲得性免疫起到了關(guān)鍵性調(diào)控作用,并參與了梅毒血清固定的形成。

        綜上所述,筆者認(rèn)為梅毒血清固定患者存在天然免疫異常,其體內(nèi)的NLRP3炎癥小體表達(dá)下調(diào)可能會(huì)影響到信號(hào)通路的下游細(xì)胞因子和相關(guān)細(xì)胞參與的梅毒感染免疫反應(yīng),導(dǎo)致梅毒血清固定形成。但具體免疫網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)細(xì)胞因子間互相調(diào)節(jié)的分子機(jī)制并不是十分清晰,后續(xù)還需就其具體的分子機(jī)制進(jìn)行深入的研究。

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