李松 董莉麗 孫麗 李剛 袁爽 王學(xué)博 王克

南陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（河南南陽473000）

子宮內(nèi)膜癌是一種具有較強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移能力的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率逐年增加，呈明顯的低齡化趨勢，治療后易復(fù)發(fā)，易產(chǎn)生化療耐藥性，尋找更為有效的策略用于子宮內(nèi)膜癌的治療至關(guān)重要［1-2］。目前，基因靶向治療被認(rèn)為是更精準(zhǔn)和安全的治療方式，在惡性腫瘤的臨床治療中顯示出廣闊應(yīng)用前景。微小RNA（microRNAs，miR?NAs）是指長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，主要通過與目的基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）結(jié)合調(diào)控mRNA翻譯，可作為候選生物標(biāo)志物用于疾病的診斷和治療［3-4］。

miR?191是一種高度保守的miRNA，在多種不同的癌癥類型中異常表達(dá)［5-6］。研究［7-9］證明，miR?191表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)肝癌、前列腺癌及胰腺癌的發(fā)展，是疾病預(yù)后不良的標(biāo)志物。然而，miR?191在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚不明確。本研究檢測了miR?191在子宮內(nèi)膜癌臨床樣本和人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)差異，探討其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及可能的作用機(jī)制，為臨床子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 組織來源104例患者的新鮮子宮內(nèi)膜癌組織及其癌旁組織來自本院2015年12月至2018年12月子宮內(nèi)膜癌手術(shù)切除標(biāo)本，已經(jīng)過病理診斷證實，取材后立即放置于液氮中，然后保存在-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 細(xì)胞人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。每2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.3 試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、MTT染色試劑盒、Transwell小室、基質(zhì)膠、結(jié)晶紫染液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；LipofectaminTM2000（美國Invitrogen公司）；miR?191 inhibitor及其陰性對照、雙熒光素酶報告質(zhì)粒pmirGLO均委托上海吉瑪公司構(gòu)建；Rever?tAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific公司）；引物（日本TaKaRa公司）；TET1兔源單克隆抗體、羊抗兔二抗（Santa Cruz Biotechnol?ogy）。

1.4 方法

1.4.1 RT?PCR檢測子宮內(nèi)膜癌組織及細(xì)胞miR?191及TET1的表達(dá)取子宮內(nèi)膜癌組織、癌旁組織和Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC細(xì)胞，加入裂解液抽提總RNA，使用RevertAidTM first Strand cD?NA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設(shè)計合成，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s、72℃延伸30 s，重復(fù)40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)，實驗重復(fù)3次。采用2?△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達(dá)水平變化。引物序列為：miR?191：5′?ACACTCCAGCTGGGCAACGGAATCCCAA?AAGC?3′；U6：5′?TTATGGGTCCTAGCCTGAC?3′；TET1：5′?CACTGCTTGCCTGGACTTCTG?3′，5′?CCC?AAAGAGCGGTTATCTTCTC?3′；GAPDH：5′?TGCTT?CACCACCTTCTTGA?3′，5′?TCACCATCTTCCAGGA?GC?3′。

1.4.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染收集Ishikawa細(xì)胞，以4×105個/孔的濃度接種到6孔板。將細(xì)胞分為inhibitor組、NC組和對照組。當(dāng)細(xì)胞生長融合至70%～80%時，參照LipofectaminTM2000試劑說明書，對inhibitor組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?191 inhibitor，NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?191 inhibitor NC，對照組細(xì)胞采用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染5 h后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后檢測細(xì)胞miR?191和TET1 mRNA表達(dá)量，方法同1.4.1。

1.4.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，以3×103個/孔的濃度接種到96孔板，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育4 h后棄上清，加入150 μL DMSO使結(jié)晶溶解，490 nm波長檢測吸光度（OD）值。

1.4.4 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力收集細(xì)胞，采用無血清培養(yǎng)基稀釋后以2×104個/孔接種于已鋪基質(zhì)膠的Transwell上室，每孔200 μL，下室加入600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出上室，甲醇固定20 min，擦掉上室殘余細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗后置于顯微鏡下觀察，選取4個高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取平均值。

1.4.5 Western blot法檢測細(xì)胞TET1蛋白表達(dá)情況收集細(xì)胞提取蛋白，測定蛋白濃度，加入load?ing buffer混勻煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS?PAGE電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入不同的一抗稀釋液，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.4.6 雙熒光素酶靶標(biāo)實驗驗證miR?191與TET1的關(guān)系在TargetScan網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）檢索發(fā)現(xiàn)TET1是miR?191的潛在靶點，為檢測miR?191與TET1的靶向結(jié)合關(guān)系，設(shè)計與miR?191相結(jié)合的TET1的3′?UTR序列及其突變序列，將其構(gòu)建到雙熒光素酶報告基因載體pmirGLO上（此項工作委托上海吉瑪公司完成）。取Ishikawa細(xì)胞，按照5×104個/孔的密度接種到24孔板，待細(xì)胞融合到80%左右，向細(xì)胞轉(zhuǎn)染TET1?3′?UTR?NC/TET1?3′?UTR?WT/TET1?3′?UTR?MUT報告質(zhì)粒、miR?191及對照miR?NC質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，實驗重復(fù)3次，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織miR?191和TET1表達(dá)比較子宮內(nèi)膜癌組織中miR?191表達(dá)量顯著高于癌旁組織，TET1 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖1）。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織及癌旁組織miR?191和TET1 mRNA表達(dá)比較Fig.1 Comparison of miR?191 and Tet1 mRNA expression in endometrial cancer tissue and adjacent tissues

2.2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞miR?191和TET1表達(dá)比較以JEC細(xì)胞為參照，miR?191在Ishikawa、HEC?1?B和RL?952細(xì)胞中的表達(dá)量分別為（85.62±1.35）、（20.68±1.98）、（1.88±0.88）（圖2A），TET1 mRNA的表達(dá)量分別為（0.07±0.01）、（0.30±0.02）、（0.62±0.04）（圖2B）。選擇miR?191高表達(dá)和TET1低表達(dá)的Ishikawa細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞miR?191和TET1 mRNA表達(dá)比較Fig.2 Comparison of miR?191 and TET1 mRNA expression in endometrial cancer cells

2.3 抑制miR?191對TET1的表達(dá)水平的影響與對照組比較，NC組細(xì)胞miR?191和TET1表達(dá)無顯著變化（P>0.05）。與對照組和NC組比較，轉(zhuǎn)染miR?191 inhibitor使細(xì)胞miR?191表達(dá)降低，TET1表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖3）。

圖3 抑制miR?191對TET1表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of miR?191 inhibition on TET1 expression

2.4 抑制miR?191對Ishikawa細(xì)胞增殖能力的影響培養(yǎng)24、48、72 h后，與對照組比較，NC組細(xì)胞的增殖能力無顯著變化（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細(xì)胞的增殖能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖4）。

圖4 抑制miR?191對Ishikawa細(xì)胞增殖能力的影響Fig.4 Effect of miR?191 inhibition on proliferation of Ishikawa cells

2.5 抑制miR?191對Ishikawa細(xì)胞侵襲能力的影響NC組與對照組細(xì)胞穿膜數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細(xì)胞穿膜數(shù)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖5）。

2.6 Western blot法檢測miR?191對Ishikawa細(xì)胞TET1表達(dá)的影響NC組細(xì)胞TET1蛋白表達(dá)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與對照組和NC組比較，inhibitor組細(xì)胞TET1蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖6）。

圖5 抑制miR?191對Ishikawa細(xì)胞侵襲能力的影響Fig.5 Effect of miR?191 inhibition on invasion of Ishikawa cells

圖6 Western blot法檢測各組Ishikawa細(xì)胞TET1表達(dá)水平Fig.6 The expression of TET1 in Ishikawa cells was detected by Western blot

2.7 miR?191對TET1的靶向調(diào)控作用通過生物信息學(xué)網(wǎng)站對miR?191的靶基因進(jìn)行預(yù)測和鑒定，TET1被預(yù)測為miR?191的結(jié)合位點（圖7A）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示，加入miR?191后，共轉(zhuǎn)染TET1?3′?UTR?WT的Ishikawa細(xì)胞中熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），共轉(zhuǎn)染TET1?3′?UTR?MUT和TET1?3′?UTR?NC的Ishikawa細(xì)胞中熒光素酶活性無顯著變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖7B）。

3 討論

圖7 miR?191與TET1 3′UTR潛在結(jié)合點及熒光素酶活性Fig.7 Potential binding site and luciferase activity of 3′UTR of mir?191 and TET1

子宮內(nèi)膜癌在我國的發(fā)病率逐年升高，尋找更有效的療法和靶標(biāo)是當(dāng)前子宮內(nèi)膜癌臨床治療亟待解決的關(guān)鍵［10］。研究證明，成熟的miRNA可以通過3′?UTR、5′?UTR區(qū)域甚至mRNA編碼序列的不精確互補(bǔ)來調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)［11-13］。miR?191是一種高度保守的miRNA，最初在鼠類基因中被發(fā)現(xiàn)，后被證實在人類基因中也存在，在多種惡性腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，通過調(diào)控相應(yīng)的靶基因促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲［14-17］。然而，miR?191在子宮內(nèi)膜癌中的作用尚不明確。

為探討miR?191對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)功能是否具有調(diào)控作用，本研究檢測了miR?191在子宮內(nèi)膜癌及其癌旁組織中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中miR?191的表達(dá)量顯著高于癌旁組織。同時，本研究檢測了Ishikawa、HEC?1?B、RL?952、JEC四種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miR?191的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，Ishikawa細(xì)胞中miR?191表達(dá)水平最高。向Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?191抑制物可降低細(xì)胞的增殖和侵襲活力，以上結(jié)果提示miR?191與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)功能密切相關(guān)，抑制miR?191可直接影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

為進(jìn)一步探究miR?191對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究在TargetScan網(wǎng)站對miR?191的靶基因進(jìn)行預(yù)測，檢索發(fā)現(xiàn)TET1是miR?191的潛在靶點。TET1基因是甲基胞嘧啶雙加氧酶家族的重要成員，能夠?qū)??甲基胞嘧啶氧化參與DNA去甲基化途徑，調(diào)控胚胎干細(xì)胞發(fā)育，并與神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及腫瘤疾病的發(fā)生密切相關(guān)［18-19］。研究證明，上調(diào)TET1基因可抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲，是腫瘤治療的潛在靶點［20-21］。猜測miR?191可能通過調(diào)節(jié)TET1影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織中TET1 mRNA的表達(dá)量顯著低于癌旁組織，在miR?191高表達(dá)的Ishikawa細(xì)胞中，TET1 mRNA的表達(dá)量最低。向Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR?191抑制物后，TET1 mRNA的表達(dá)量升高，細(xì)胞的增殖和遷移能力降低。與上述結(jié)果一致，當(dāng)Ishikawa細(xì)胞miR?191表達(dá)被下調(diào)后，TET1蛋白表達(dá)水平顯著增加，表明miR?191可能是通過調(diào)節(jié)TET1的表達(dá)改變子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。為進(jìn)一步證明miR?191對子宮內(nèi)膜癌的作用是通過靶向TET1基因來調(diào)控的，采用雙熒光素酶靶標(biāo)實驗驗證miR?191與TET1的關(guān)系，結(jié)果顯示，miR?191只能抑制野生型TET1?3′?UTR?WT Ishikawa細(xì)胞中的熒光素酶活性，而對突變型TET1?3′?UTR?MUT Ishikawa細(xì)胞中熒光素酶活性無影響，表明TET1是miR?191的潛在靶基因，miR?191對TET1基因的表達(dá)存在顯著的調(diào)控作用。

本研究探討了miR?191對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，結(jié)果顯示miR?191在子宮內(nèi)膜癌組織和子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞中高表達(dá)，能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲，這種作用可能是通過靶向抑制TET1的表達(dá)而實現(xiàn)的。然而本研究僅在細(xì)胞水平展開，實驗性質(zhì)較為單一，未進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證。本課題組下一步將在子宮內(nèi)膜癌動物模型中探討miR?191的作用，為miR?191在子宮內(nèi)膜癌中的作用提供理論依據(jù)。