徐 迪，蘇 超，張 洋

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學院生物工程學院，安徽蕪湖 241000)

0 引言

食物在儲存過程中經(jīng)常容易被微生物污染.為了確保食物的安全，人們需要采取有效的抑菌、抑霉菌毒素和抗氧化措施.眾所周知，化學合成的食品防腐劑對消費者和環(huán)境具有有害影響，而含有揮發(fā)性成分的各種植物精油具有較強的抗菌和抗氧化活力[1].目前已有一些植物精油由于其良好的抑菌效果及安全性，被加工成食品熏蒸劑，用于降低食品貯藏過程中的污染損失及延長食品的貨架期[2].

曼地亞紅豆杉(TaxusmediaRehder)是1918年美國學者發(fā)現(xiàn)的由母本東北紅豆杉(Taxuscuspidata)和父本歐洲紅豆杉(Taxusbaccata)自然雜交得到的品種[3]，現(xiàn)在被廣泛用于水土保持、環(huán)境改善與園林美觀等.其樹皮和枝葉中含有豐富的天然抗癌物質(zhì)紫杉醇，對CCl4誘導的大鼠肝纖維化有抑制作用[3-4].此外，紅豆杉枝葉中還含有大量芳香性揮發(fā)油、生物黃酮、鞣質(zhì)、植物酵素和前青花素等抗氧化劑類物質(zhì)[5-6].本研究從曼地亞紅豆杉中提取分離精油并進行組分分析鑒定，對其抑菌活性展開研究，以期為曼地亞紅豆杉植物資源的有效開發(fā)利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

曼地亞紅豆杉：購自安徽金寨縣天堂寨天馬紅豆杉科技有限公司；供試菌種：購于中國科學院微生物菌種保藏中心；歐萊博HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(山東博科科學儀器有限公司)；數(shù)顯控溫不銹鋼DB-2A電熱板(常州市儀都儀器有限公司)；FK-A組織搗碎機(金壇市精達儀器制造有限公司)，揮發(fā)油提取器(揚州滬武教學設(shè)備有限公司)；GC-MS(HP 5890 II 型氣相色譜儀，5972質(zhì)譜儀，安捷倫公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 精油提取 參考文獻[7]，采用水蒸氣蒸餾提取法進行精油的提取.取去雜新鮮曼地亞紅豆杉嫩葉1 000 g，用粉碎機粉碎；將原料粉末與30 g食鹽攪拌均勻后裝入蒸餾瓶中，通入蒸氣蒸餾處理2.5 h；收集油水混合物，20 000 r/min，離心10 min，收集上層油相，計算精油得率(圖1).

圖1 曼地亞紅豆杉精油的提取工藝流程Fig.1 Extraction process of essential oil from Taxus media

1.2.2 精油成分鑒定 精油的組成成分采用HP 5890 II 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行鑒定[8-9].色譜條件：毛細管色譜柱30 m×0.32 mm，0.25 μm；初始溫度60 ℃，保持10 min，以4 ℃/min升至220 ℃并保持10 min，之后以1 ℃/min升至240 ℃并保持5 min；載氣為氦氣，流量1 mL/min；樣品用1:1(體積比)乙醚稀釋，進樣體積2 μL；電離方式為電子轟擊(EI)，電子能量為70 eV；離子源溫度為200 ℃；掃描范圍為35～450 u.

1.2.3 抑菌活性分析 供試菌種包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，兩種革蘭氏陽性菌；大腸桿菌(Escherichiacoli)，普通變形桿菌(Proteusvulgaris)兩種革蘭氏陰性菌；以及酵母菌(Rhodotorulaglutinis)和黃曲霉菌(Aspergillusflavus)兩種特殊的真菌.四種細菌選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，兩種真菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基.采用紙片擴散法和瓊脂稀釋法[10]對曼地亞紅豆杉精油的抑菌活性進行測定，以慶大霉素(20 μg/mL)和兩性霉素(80 μg/mL)分別作為細菌和真菌抑菌活性的陽性對照.

紙片擴散法分析精油的抑菌活性：經(jīng)過培養(yǎng)，使菌落平板或液體培養(yǎng)基中微生物的濃度達到107CFU/mL或108孢子/mL，將4 μL精油裝入直徑為6 mm的濾紙片，然后將濾紙片放在凝膠瓊脂板上，6種細菌在(37±1)℃培養(yǎng)24 h，酵母菌在(28±1)℃培養(yǎng)48 h，黃曲霉菌在(25±1 )℃培養(yǎng)7 d，觀察并記錄抑菌圈直徑(DD).

瓊脂稀釋法分析精油的抑菌活性：無菌環(huán)境中將4 mL吐溫80溶液和1 mL精油混合并劇烈攪拌2 min使精油均勻分散，將母液濃度從100 μg/mL濃縮至500 μg/mL，并倒入培養(yǎng)皿中，細菌在(37±1)℃培養(yǎng)24 h，酵母菌在(28±1) ℃培養(yǎng)48 h，黃曲霉菌在(25±1)℃培養(yǎng)7 d，以培養(yǎng)皿中不長菌時的精油質(zhì)量濃度，確定為精油抑菌的最低質(zhì)量濃度(MIC).

1.2.4 統(tǒng)計分析 結(jié)果用平均值±標準差表示.運用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計和單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 精油中的化學成分

用水蒸氣蒸餾法提取曼地亞紅豆杉中的精油，精油提取率為新鮮樣品重量的0.31%.用GC-MS氣相色譜質(zhì)譜儀進行分析(圖2)，通過儀器配備的計算機譜庫檢索并與標準質(zhì)譜圖對照，鑒定出了30種化合物，占精油混合物成分中的97.14%(表1)，主要化合物為順式-3-己烯-1-醇(29.42%)、3，3-二甲基酸(18.13%)、戊乙烯甲醇 (15.61%)、4-羥基-2-對甲基苯乙酮(6.02%)、蒎烯-2-酮-4馬鞭草烯酮(5.03%)、3，5-二甲氧基苯酚(4.34%)、1-己醇(1.98%)、香桃木醇(1.34%)、萜品醇(1.26%)、辛基乙醇(1.12%)、安息香醛(1.10%)、橙花基乙醇(1.04%).檢測出的化合物中含量從大到小依次為醇類(61.37%)，酸類(18.54%)，酮類(7.84%)，腈類(4.34%)，酯類(2.18%)，醛類(1.10%)，烷烴類(0.98%)，烯烴類占(0.79%)(表2)[11].目前只有6篇是關(guān)于紅豆杉中提取精油的文獻記載[6].與王艇[12]、Merajuddin[13]和Radulovic[14]等人的報道相比，本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)的精油化合物成分及其百分比均有明顯的不同，而Dragoljub[11]等人發(fā)現(xiàn)的主要成分是棕櫚酸(35.66%)、9-十六碳烯酸9-十六碳烯酯(11.28%)、3-辛醇(4.47%)、1-苯-1,2-丙二酮(4.3%)、N-苯基-1-萘胺(3.57%)、1,2-苯二羧酸(2-甲基丙基)二酯(3.57%)、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮(3.24%)、3,7-二甲基-1-辛烯-3-醇(3.08%)、苯甲醛(2.31%)等.其中14,17-環(huán)二氧-28-r-15-蒲公英賽烯-2,3-二醇化合物只在這次研究中被發(fā)現(xiàn)，這很有可能是由于植物生長所處的地理位置和環(huán)境的變化所導致.

圖2 曼地亞紅豆杉精油GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 GC-MS chromatogram of total ion flow of essential oil from Taxus media

表1 曼地亞紅豆杉精油的化學成分與含量Tab.1 Main chemical composition of Taxus media essential oil

表2 曼地亞紅豆杉精油中化合物主要類別及百分比Tab.2 Composition of the essential oil of Taxus media by chemical class

2.2 抑菌活性

紅豆杉精油的抑菌效果取決于它的有效化學成分.曼地亞紅豆杉精油的抑菌活性如表3所示.從紙片擴散法的結(jié)果中可以得出，該精油具有很強的抑菌能力，且對細菌的抑制效果要好于真菌.數(shù)據(jù)顯示，供試菌中大腸桿菌對精油最敏感，其抑菌圈直徑最大(27 mm)；酵母菌對精油最不敏感，其抑菌圈直徑最小(15 mm).對細菌而言，揮發(fā)油對G+菌和G-菌的抑制圈直徑分別為20～23 mm和25～27 mm.相比之下，真菌對精油的抵抗性要高于細菌，酵母菌對精油較為敏感.從表3可見，金黃色葡萄球菌的MIC最低(137.16 μg/mL)，酵母菌的MIC最高(168.1 μg/mL).

表3 曼地亞紅豆杉精油的抑菌活性Tab.3 Antimicrobial activities of Taxus media essential oil by the diameter inhibition zones and MIC method

總體來說，曼地亞紅豆杉精油具有很好的抑菌活性且對細菌的抑制效果要強于真菌，這可能是因為精油中有順式-3-己烯-1-醇、戊乙烯甲醇、14,17-環(huán)二氧-28-r-15-蒲公英賽烯-2,3-二醇、苯甲醛等[15]物質(zhì).已有報道[16]，順式-3-己烯-1-醇，戊乙烯甲醇對于植物生長過程中起重要保護作用，能有效抑制受傷區(qū)域引起細菌增殖.Tresvenzol等[17]研究證明了苯甲醛對多種微生物均具有良好的抑制效果.曼地亞紅豆杉精油的抑菌活性可能是由于多種化合物的協(xié)同作用[18].隨著人們對芳香療法的青睞，物美價廉的曼地亞紅豆杉精油將是一種新型抗菌精油的潛在來源[19].

nd: 未檢出；DDa:抑菌圈直徑(mm)；MICb:最低抑菌質(zhì)量濃度(μg/mL).

3 結(jié)論與討論

用水蒸氣蒸餾提取法從曼地亞紅豆杉中提取精油，運用GC-MS對其進行分析鑒定，用紙片擴散法和瓊脂稀釋法對精油的抑菌活性進行測定.得到實驗結(jié)果為：精油得率為0.31%，共鑒定出30種化合物，主要化合物為順式-3-己烯-1-醇(29.42%)，3,3-二甲基酸(18.13%)，戊乙烯甲醇 (15.61%).通過抑菌圈直徑和最低抑菌質(zhì)量濃度的測定證實了曼地亞紅豆杉精油對常見腐敗微生物具有較高的抑菌活性，且對細菌的抑制效果高于真菌.與已報道的白豆杉葉的精油成分[20]和南方紅豆杉葉的精油成分[12]相比較，曼地亞紅豆杉精油與其相同成分不多，這可能有助于我們了解紅豆杉科內(nèi)各屬間系統(tǒng)關(guān)系.總的來說，具有良好抑菌活性和愉悅香味的曼地亞紅豆杉精油在食品工業(yè)和化妝品工業(yè)的應(yīng)用及潛在價值將會受到人們極大的關(guān)注.