孫亞華,程洪金,魯志毅,駱健美

簡單節(jié)桿菌表達對大腸桿菌抗逆性能的影響

孫亞華,程洪金,魯志毅,駱健美*

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室/天津科技大學;天津市工業(yè)微生物重點實驗室;天津市微生物代謝與發(fā)酵過程控制技術工程中心;生物工程學院/天津科技大學, 天津 300457

簡單節(jié)桿菌（）是工業(yè)上普遍使用的甾體C1,2脫氫菌株，轉化過程中常常需要添加乙醇等有機溶劑增加疏水性底物的溶解性，但高濃度的有機溶劑會對菌體產(chǎn)生毒害作用。課題組前期通過組學技術發(fā)現(xiàn)，海藻糖合成過程中的海藻糖合酶（TreS）與該菌株乙醇脅迫條件下的適應行為密切相關。在此基礎上，本文以工業(yè)菌株TCCC 11037基因組為模板進行的克隆及其生物信息學分析。結果表明，該菌株的氨基酸序列與來源于sp. J54的海藻糖合成酶基因的同源性最高，為94%。蛋白的相對分子質量65202.39 Da，等電點為4.66，具有不穩(wěn)定性和親水性，無跨膜螺旋結構，主要存在于細胞質中。的表達對大腸桿菌的生長性能無明顯影響，但能顯著提高其對甲醇、高滲和高鹽這三種壓力的耐受性。該工作對簡單節(jié)桿菌中基因克隆和表達的首次報道，為深入研究該基因的生物學功能提供基礎數(shù)據(jù)。

簡單節(jié)桿菌; 大腸桿菌; 抗逆性能

簡單節(jié)桿菌（）具有催化甾體C1,2脫氫的功能，因此在工業(yè)上普遍利用其作為反應菌株催化甾體轉化，為促進底物的溶解性，常常添加乙醇等有機溶劑[1]。在之前的研究中，我們研究了乙醇對實驗室保存的TCCC 11037菌體的一系列生理性能的影響，包括細胞生長、形態(tài)、細胞結構和組成、細胞生理性質等，獲得了簡單節(jié)桿菌乙醇壓力下適應行為的大量基礎數(shù)據(jù)[2-4]。通過比較菌株在有無乙醇壓力下的蛋白質組學數(shù)據(jù)，進一步獲得了一些與乙醇脅迫相關的重要蛋白，如海藻糖合成過程中的關鍵酶-海藻糖合酶[5-7]。

海藻糖合酶(Trehalose Synthase，TreS，EC 5.4.99.16)是近年來新被發(fā)現(xiàn)的一種酶，該酶屬于分子內葡糖苷轉移酶，能將麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉化為α-1,1糖苷鍵，從而形成海藻糖。海藻糖合酶具有底物專一性，只能以麥芽糖與海藻糖作為底物,且生成麥芽糖（逆反應）的速率會隨溫度升高明顯增大[8]。目前，已在水生棲熱菌（）、假單胞菌（）、結核分支桿菌（）和谷氨酸棒狀桿菌（）等細菌內發(fā)現(xiàn)了海藻糖合酶。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這些不同微生物來源的海藻糖合酶在一級結構上存在很大的相似性，大多具有Trp-Phe/Pro-Arg-Thr/ Pro-Ala-Val/ Ala-Phe或是Ala-Val-Phe/Ile-Tyr的保守區(qū)域[8]。目前，關于該酶在提高微生物抗逆性能方面的報道較少。

本論文以TCCC 11037基因組為模板，通過PCR進行基因的克隆及其生物信息學分析，之后利用大腸桿菌異源表達菌株的構建及其性能分析進一步確定其在微生物抗逆作用方面的效果。對簡單節(jié)桿菌中基因研究，本研究尚屬首次報道，研究結果也為基因的生物學功能的進一步研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒實驗所用的簡單節(jié)桿菌TCCC 11037(TCCC 11037)是實驗室保存菌株；克隆菌株DH5α和表達菌株BL21(DE3)來自于實驗室保藏菌株。pART2質粒來自Cristinel Sandu教授[10]的饋贈。

1.1.2 酶和試劑盒實驗中試劑購買廠家：革蘭氏陽性菌基因組提取試劑盒質粒購于Tiangen公司，DNA聚合酶HiFi DNA Polymerase購于Transgen公司，T4 DNA 連接酶和文中所用的H I與I限制性內切酶購于TaKaRa公司，質粒提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒購于OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 目標基因的克隆16S RNA基因比對結果表明，實驗室保存菌株TCCC 11037與的VKM Ac-2033D的親緣關系最近，利用其在GenBank公布的基因設計引物，引物序列如表1所示(酶切位點用方框標出）?；蚪M提取，按照細菌基因組提取試劑盒的說明書進行操作；擴增：基因組作為PCR模板，所用酶為HiFi DNA Polymerase酶；反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，各自Tm溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物驗證：利用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，對處于目標位置的DNA條帶進行切膠回收，回收后的DNA與pART2載體分別進行HI /I雙酶切，在16 ℃條件下用T4連接酶連接，轉入DH5α感受態(tài)后，涂布于LB平板，挑取單菌落培養(yǎng)后重提質粒，PCR及雙酶切驗證，將驗證正確的質粒送至深圳華大基因公司測序。

表1 PCR擴增引物序列

1.2.2 treS的生物信息學分析 (1)序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建利用軟件MEGA5構建系統(tǒng)發(fā)育樹，這些序列選取NCBI數(shù)據(jù)庫Blast得到的與目標DNA序列及其編碼的氨基酸序列最為相似的序列；(2) 生物信息學分析分析過程中軟件及相應的網(wǎng)站網(wǎng)址如下：蛋白質基本理化性質分析用ExPASy protparam Tool工具（http:// ca.expasy.org/tools/protparam. html），包括蛋白質的相對分子量、理論等電點、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)等；蛋白的親水性/疏水性利用ProtScale工具（http://ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析；蛋白跨膜區(qū)預測利用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM 2.0/）；蛋白質亞細胞定位利用PSORT II server（http://psor.tims.utokyo.ac.jp/form2.html）預測；蛋白二級結構利用SOPMA工具（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）進行預測。

1.2.3 重組大腸桿菌的構建純化PCR產(chǎn)物，將其與pART2質粒同時利用I/I進行雙酶切后連接，構建重組表達質粒pART2-。利用化學法將連接產(chǎn)物轉入DH 5α感受態(tài)細胞。挑取平板上的單菌落培養(yǎng)，依次進行質粒重提、PCR和雙酶切驗證，驗證正確的進行測序，進而獲得正確的DH 5α重組菌株。將上述驗證正確的pART2-重組質粒，再次通過化轉轉入BL21 (DE3) 感受態(tài)細胞。采用上述步驟進行驗證，最終獲得正確的BL21(DE3)/pART2-重組表達菌株。含有空質粒的BL21(DE3)/pART2作為對照菌株。

1.2.4 TreS蛋白的表達將重組菌BL21(DE3)/pART2-和對照菌株BL21(DE3)/ pART2分別接種于LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL卡那霉素）中，一級培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：200 r/min，37 ℃；培養(yǎng)12 h后進行二級轉接，接種量約1%，二級培養(yǎng)在250 mL錐形瓶中進行，瓶中裝有50 mL抗性LB液體培養(yǎng)基的，初始OD600值至0.02（可以用LB培養(yǎng)基調節(jié)），二級培養(yǎng)仍為200 r/min，37 ℃，約20 h后收集菌體，加入5×Loading Buffer，于沸水中煮10 min，在室溫下10000 r/min離心15 min，取上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳。

1.2.5 大腸桿菌無壓力條件下的生長特性分析菌株的一級和二級培養(yǎng)均與1.2.4的方法相同，二級接種后，每2 h取樣測定OD600，時間為橫坐標，OD600為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.6 重組大腸桿菌抗逆性能的分析（1）大腸桿菌在高濃度壓力沖擊下的存活能力分析菌株的一級和二級培養(yǎng)均與1.2.4的方法相同，二級培養(yǎng)至對數(shù)中后期時，取1 mL菌液離心10 min收集菌體，離心條件為室溫下6000 r/min，然后重懸于在5 mL LB液體抗性培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中含有不同壓力（分別為10%乙醇、15%甲醇、3 M山梨醇、2.5 M NaCl、pH=3.0以及0.1%的H2O2溶液），在37 ℃，200 r/min的條件下振蕩沖擊30 min。沖擊后的培養(yǎng)液制成均勻的系列稀釋液，稀釋方法采用梯度稀釋法，盡量使微生物細胞分散開，以單個細胞存在，選取合適的濃度，涂布于LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，計數(shù)平板上的菌落數(shù)。存活率=菌株壓力條件下的菌落數(shù)/菌株無壓力條件下的菌落數(shù)；（2）大腸桿菌在適當壓力條件下的生長特性分析菌株的一級和二級培養(yǎng)均與1.2.4的方法相同，在二級培養(yǎng)的初始加入不同的壓力（分別為4%乙醇、5%甲醇、1M山梨醇0.6 M NaCl、pH=5.0以及0.025%的H2O2），在37 ℃，200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，在12、24和48 h時取樣測定OD600值。相對OD600=菌株壓力條件下的OD600值/菌株無壓力條件下的OD600值。

2 結果與分析

2.1 簡單節(jié)桿菌中treS基因的克隆

由圖1可知，TCCC11037菌株的基因組的電泳條帶清晰完整，說明DNA提取良好完整，并可用于下一步實驗。

覆膜集雨種植能顯著提高作物的產(chǎn)量和生物產(chǎn)量[2-4]。在西北干旱地區(qū)，覆膜被作為提高農作物產(chǎn)量最有效地方式大力倡導。本研究發(fā)現(xiàn)，地膜處理下啤酒大麥產(chǎn)量高于露地處理，出苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期也較早，但是倒伏較嚴重，倒伏面積是露地處理下的2倍，其余性狀差別不顯著。

圖 1 簡單節(jié)桿菌TCCC 11037基因組電泳圖

M: DNA Marker；1:簡單節(jié)桿菌基因組

圖2 treS基因擴增結果

M：DL5000 DNA Marker；1：PCR產(chǎn)物

基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳結果如圖2所示?；虻牡念A期大小為1704 bp，圖中電泳條帶出現(xiàn)在1700 bp附近，條帶清晰且無雜帶存在。說明獲得簡單節(jié)桿菌中的基因的擴增產(chǎn)物。

2.2 簡單節(jié)桿菌中treS的生物信息學分析

2.2.1 簡單節(jié)桿菌中treS的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建將基因的核苷酸與氨基酸同源比對后構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果如下：TCCC 11037中的核苷酸和氨基酸序分別與sp78和sp. J54的同源性最高，分別達到87%和94%。利用TCCC 11037的構建的核苷酸和氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。由圖3可知，進化分析表明TCCC 11037的基因與氨基酸序列分別與諾卡氏菌的兩個菌株中的序列最為接近，說明在親緣關系上，與諾卡氏菌最近。

圖 3 treS核苷酸(A)與氨基酸(B)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

遺傳距離用Tamura-Nei公式計算，系統(tǒng)發(fā)育樹用Neighb Joint (NJ)法構建，枝長代表分歧程度，各枝上的數(shù)字是1000次bootsrap重抽樣分析的支持百分比

2.2.1 簡單節(jié)桿菌中TreS蛋白的生物信息學分析（1）理化性質分析簡單節(jié)桿菌中TreS蛋白質的分子量是65202.39 Da，等電點（pI）為4.66，分子式C2948H4395N785O854S22，該蛋白質不穩(wěn)定性參數(shù)為44.65高于閾值40，可視為不穩(wěn)定蛋白質，根據(jù)軟件，預估其半衰期分別為30 h（體外哺乳動物網(wǎng)狀細胞），大于20 h（酵母體內）；大于約10 h（大腸桿菌體內）。

圖 4 TreS蛋白各氨基酸親疏水值

圖 5 TreS蛋白跨膜結構分析

如圖4可知，TreS蛋白在374個氨基酸處的疏水性最大，為2.456；在221個氨基酸處疏水性最小，為-2.400，并利用分析軟件判斷該蛋白為親水性蛋白。

（2）蛋白跨膜結構及位置預測由圖5可知，TreS蛋白不含跨膜螺旋結構，因此初步判斷該蛋白不是跨膜蛋白。且預測可能存在于細胞質中。

（3）蛋白二級結構預測由圖6可知，TreS蛋白的二級結構中無規(guī)則卷曲含量最高，為47.97%，其次是α-螺旋，含量為26.98%，延伸鏈為19.93%以及β-折疊5.11%。

圖 6 TreS的二級結構

2.3 重組大腸桿菌的構建

由圖7可知，各取上述重組菌株中提取的質粒pART2-分別進行PCR和雙酶切，電泳后產(chǎn)物條帶位置與預期位置相同，說明表達重組菌已經(jīng)構建成功。

圖7 重組質粒pART2-treS的PCR和雙酶切結果

M: DNA Marker；1: 重組質粒的PCR擴增產(chǎn)物; 2: 重組質粒雙酶切后的產(chǎn)物

圖 8 TreS在大腸桿菌中的表達

M:蛋白質分子質量標準；1:BL21(DE3)/pART2-treS; 2:BL21(DE3)/pART2

2.4 TreS在大腸桿菌中的表達

由圖8可知，相對于對照組，重組菌株BL21(DE3)/pART2-多一條蛋白條帶，該條帶位于約65 kDa處，與TreS蛋白的理論大小相吻合，說明已在大腸桿菌中成功表達。

2.5 treS基因表達對大腸桿菌生長特性的影響

圖9是對照菌株及重組菌株在無壓力條件下的生長曲線。由該圖可知，重組菌株和對照菌株的生長階段無明顯的差異，在0~4 h間生長緩慢，為延滯期，在4 h后OD600迅速增加，即4-16 h為對數(shù)期，培養(yǎng)約16 h后菌體OD600沒有明顯變化，說明菌體生長進入穩(wěn)定期。培養(yǎng)至18 h時菌體OD600達到最大值，約為1.10。在生長的各個周期，重組菌和對照菌株的生長差別不大，綜上所述，基因表達對大腸桿菌生長特性沒有明顯影響。

2.6 簡單節(jié)桿菌treS表達對大腸桿菌抗逆性能的影響

2.6.1表達對大腸桿菌高濃度壓力沖擊下存活情況的影響由圖10可知，酸性條件（pH=3.0）、0.1%H2O2和10%乙醇沖擊30 min后，重組菌株存活率未發(fā)現(xiàn)明顯提高。而當沖擊壓力分別為15%甲醇、2.5 M NaCl和3 M山梨醇三種壓力沖擊后，重組菌株的存活率相對于對照菌均有了不同程度的提高。其中，甲醇沖擊時，BL21/ pART2-的存活率為0.76，相對于對照菌株0.46，提高了約65%。3 M山梨醇和2.5 M NaCl沖擊后，重組菌株的存活率分別為0.70和0.66，相對于對照菌株0.37和0.33，均提高了約一倍。這說明，簡單節(jié)桿菌中基因的表達提高了大腸桿菌耐受甲醇、高滲透壓力以及高鹽壓力的沖擊的能力。值得注意的是，的表達對大腸桿菌在高濃度有機溶劑壓力沖擊后的存活能力產(chǎn)生了不同的影響，其中，該基因能顯著提高菌株在甲醇壓力沖擊下的存活性能但卻對乙醇壓力沖擊下的存活性能沒有明顯改善。

圖 9 E. coli BL21/pART2和E. coli BL21/ pART2- treS重組菌株在無壓力條件下的生長曲線

圖10 E. coli BL21/pART2（Control）和E. coli BL21/ pART2- treS（treS）高濃度壓力沖擊下存活情況

2.6.2 海藻糖合成酶表達對大腸桿菌耐受適當壓力的影響由圖11可知，重組菌株在4%（v/v）乙醇、5%（v/v）甲醇、1 M山梨醇和0.6 M NaCl壓力下的生長性能明顯提高。其中，4%（v/v）乙醇培養(yǎng)48 h時的，對照菌株相對OD值為0.5重組菌株為0.6，約為對照菌的1.2倍，當壓力條件為5%（v/v）甲醇培養(yǎng)12 h時，對照菌株為0.34，重組菌為0.46，重組菌是對照菌株的1.35倍；1 M山梨醇壓力下培養(yǎng)12 h后時間后的相對OD值為0.20，比對照菌株（0.42）提高了110%，0.6 M NaCl壓力下培養(yǎng)12 h后的相對OD值為0.41，比對照菌株（0.24）提高了71%。而在0.025%H2O2氧化壓力和pH=5.0的弱酸壓力下，和對照菌株相比，重組菌的相對OD提高較小。其中，氧化壓力下培養(yǎng)12 h下的相對OD值為0.26，比對照菌株（0.23）提高了13%，pH=5.0酸性壓力下培養(yǎng)48 h的相對OD值為0.81，比對照菌株（0.77）提高了約5%。綜上可知，來源于的基因的可以明顯提高大腸桿菌對有機溶劑、高滲和高鹽壓力的沖擊壓力，但是對氧化和酸性耐受抵抗效果提升不明顯。

圖 11 E. coli BL21/pART2（Control）和E. coli BL21/ pART2- treS（treS）適當壓力下生長情況

3 討 論

本文報道了來源于的海藻糖合酶編碼基因的異源表達可以明顯提高大腸桿菌對有機溶劑、高滲和高鹽壓力的沖擊壓力，但是對氧化和酸性脅迫的耐受效果提升并不明顯。之前的研究較多關注的是海藻糖合成過程中的6-磷酸海藻糖合成酶（OtsA）和6-磷酸海藻糖酯酶（OtsB）在提高菌株耐受性方面的工作。如Nguyen等[11]發(fā)現(xiàn)基因的表達顯著提高了大腸桿菌對有毒物質——粗脂肪酸及過氧化物的耐受性。Miller等[12]發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌中過表達能明顯提高菌株的耐鹽和抗脫水能力，進而將乙醇的產(chǎn)率提高至90%。這些研究結果都說明，利用分子操作提高海藻糖的含量是顯著提高微生物脅迫耐受性的有效手段，但目前關于海藻糖合酶的報道還相對較少，對于該基因的研究尚待加強。

4 結 論

本研究以實驗室保存的簡單節(jié)桿菌TCCC 11037菌株為模板，依靠分子生物學技術獲得目標t基因并對其進行研究。結果表明，基因有1704 bp的核苷酸與sp. 78的同源性最高，編碼產(chǎn)物為含有567個氨基酸的蛋白，sp. J54的同源性最高，分別為87%和94%。生物信息學分析的結果表明，該蛋白質的分子量是65202.39 Da，等電點pI=4.66，該蛋白具有親水性、非跨膜蛋白，可能存在于細胞質中。結果表明，簡單節(jié)桿菌中基因的表達對大腸桿菌無壓力條件下生長特性沒有明顯影響，重組菌株在有機溶劑、高滲和高鹽適當壓力下的生長性能和高濃度壓力沖擊后的存活性能均明顯提高，但對酸性和氧化壓力的耐受性沒有明顯提高。這些結果說明，簡單節(jié)桿菌中的treS基因對大腸桿菌的抗逆性能發(fā)揮著重要作用。

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The Heterologous Expression offromand Its Effects on the Resistance Performance of

SUN Ya-hua, CHENG Hong-jin, LU Zhi-yi, LUO Jian-mei*

300457,

with steroids C1,2 dehydrogenation ability has been widely used in the industry. During the biotransformation process, organic solvents (such as ethanol) are generally added to increase the solubility of hydrophobic substrates, but its high amount is tended to generates toxic effects on cells. Our previous omics analysis found that trehalose synthase (TreS) involved in the trehalose formation was closely related to cell adaptive behavior under ethanol stress condition. Based on it the geneswas amplified by PCR using the genome of an industrial strainTCCC11037 as the template and its bioinformatics analysis was performed. The results showed that amino acid sequence of thad the highest homology with the trehalose synthase gene derived fromsp. J54and the ratio were 94%. The molecular weight and the isoelectric point of the protein were predicted to be 65202.39 Da and 4.66, respectively. The protein was unstable, hydrophilic, and had no transmembrane helix, probably locating in the cytoplasm. The expression of this gene inBL21 (DE3) did not change obviously the cell growth performance, but significantly improved the cell tolerance to methanol, osmoticpressure and salt . This work is the first report on the cloning and expression ofgene from, which will provide basic data for further study of its biological function.

;;resistance performance

Q786

A

1000-2324(2021)02-0234-07

10.3969/j.issn.1000-2324.2021.02.013

2019-05-17

2020-01-04

國家自然科學基金面上項目(21978220);天津市自然科學基金重點項目(18JCZDJC32500)

孫亞華(1989-),女,碩士研究生,研究方向:微生物抗逆機制. E-mail:sunyahuavc@163.com

Author for correspondence. E-mail:luojianmei@tust.edu.cn