李 穎，王瑩瑩，蘇 旭，谷建田

（北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206）

0 引言

番茄(SolanumlycopersicumL.)，俗名西紅柿，原產(chǎn)南美洲，是管狀花目、茄科、番茄屬的一種草本植物，在中國(guó)南北方各地均普遍栽培。番茄屬于喜溫性蔬菜，耐寒性較差，在番茄的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段，需要相適應(yīng)的溫度，其中幼苗期的最適溫度20～25℃，夜溫10～15℃[1]。冷害會(huì)發(fā)生在番茄生長(zhǎng)發(fā)育的每個(gè)階段，導(dǎo)致番茄生長(zhǎng)發(fā)育不良、落花落果，使番茄年產(chǎn)量降低，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。番茄幼苗期是對(duì)冷害比較敏感的時(shí)期，為了提高番茄幼苗期的耐寒能力，增加番茄生產(chǎn)效益，有關(guān)番茄抗寒基因的功能研究逐漸成為熱點(diǎn)。MYB家族是植物中功能最多樣化、數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。在擬南芥中，已鑒定出超過(guò)1600個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，約占全基因組的6%[3]，而MYB家族約占擬南芥總轉(zhuǎn)錄因子家族的9%[4]。MYB轉(zhuǎn)錄因子不僅能對(duì)激素以及干旱高溫高鹽等逆境脅迫做出應(yīng)答[5-6]，而且廣泛參與植物初生和次生代謝反應(yīng)[7-8]，并對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成[9-10]具有重要的調(diào)控作用。已有研究表明番茄MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)低溫脅迫方面發(fā)揮著重要作用，如：過(guò)表達(dá)SlMYB41基因使番茄植株對(duì)低溫更加敏感，而將該基因沉默之后，植株則更能抵御低溫脅迫，表明SlMYB41基因是番茄低溫抗性的負(fù)調(diào)控因子[11]。過(guò)表達(dá)SlMYB113基因的表達(dá)量，能夠增加花青素的積累，提高了轉(zhuǎn)基因番茄植株的抗寒性，表明SlMYB113基因是番茄響應(yīng)低溫脅迫的正調(diào)控因子[12]。另外，超表達(dá)SlGAMYBL2基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草ABA、甘露醇以及低溫脅迫抗性[13]。番茄SlMYBL基因的表達(dá)在低溫脅迫下受到不同程度的誘導(dǎo)[14]。而SlMYB44基因作為MYB家族的一員，關(guān)于該基因在番茄響應(yīng)低溫脅迫中的功能研究甚少。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，篩選出差異表達(dá)基因SlMYB44開(kāi)展生物信息學(xué)分析，構(gòu)建表達(dá)載體pMDC43-MYB44進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，為后續(xù)研究番茄SlMYB44基因低溫響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為實(shí)驗(yàn)室自存俄羅斯普通番茄品種Bolgogragsky，煙草品種為本氏煙草。DH5α大腸桿菌感受態(tài)購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司；EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京華越洋生物科技有限公司；TRzol總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提快速試劑盒購(gòu)于北京博邁德基因技術(shù)有限公司。其他試劑盒為實(shí)驗(yàn)室常用試劑盒，其他生化試劑為分析純。試驗(yàn)在北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，于2020年8—12月進(jìn)行。

1.2 主要儀器

GHB-100金屬浴，杭州博日科技有限公司生產(chǎn)；85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)；EPS 100型電泳儀，上海天能科技有限公司生產(chǎn)；THZ-C-1臺(tái)式冷凍恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)生產(chǎn)；MLS-3750自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本SANYO公司生產(chǎn)；PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；ZHWY-103D恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司生產(chǎn)；DTY-ZBJ-100制冰機(jī)、超凈工作臺(tái)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；低溫生化培養(yǎng)箱，北京博宇寶威試驗(yàn)設(shè)備公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1SlMYB44基因生物信息學(xué)分析 從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心得到番茄SlMYB44mRNA序列，蛋白氨基酸序列FASTA格式：MAITTNSSKRDMDRVK GPWSPEEDELLQQLVQKHGPRNWS LISKSIPGRSG KSCRLRWCNQLSPQVEHRAFTPEEDETIIRAHARF GNKWATIARLLNGRTDNAIKNHWNSTLKRKCSSLS ADEGNELADQLFENQQPPLKRSVSAGSAMPVTGF HFSPGSPSGSDSDSSLHVTSSSQSQVFKPVARTGGV FPPSIDISSPPVDPPTSLSLSLPGVDLAESSNRSADST QSKNPFQWLLPPMQIPPPPPPPPPPLATTVPFERVSA IQQSLQNPDFGQNSGGEQPDKVFVPFSQELLGVM QEMIKTEVRNYMMGVEQKQQYQRQHYQQQQPQ QFQQQNHQLPSGLGLGLCMQQASDCFRDRAANR MGLSKFD。在NCBI中Conservation Domain程序進(jìn)行基因保守結(jié)構(gòu)域分析；將氨基酸序列輸入ExPASy ProtParam在線(xiàn)軟件中，分析SlMYB44的蛋白分子量、脂肪指數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、氨基酸組成等參數(shù)，ExPASy ProtScale在線(xiàn)軟件分析蛋白所對(duì)應(yīng)的每一個(gè)氨基酸的親疏水性；將該蛋白氨基酸的FASTA文件輸入TMHMM Server v.2.0進(jìn)行SlMYB44跨膜預(yù)測(cè)分析；利用在線(xiàn)網(wǎng)站Signa1P Server分析SlMYB44信號(hào)肽，設(shè)置Cut-off值為0.45，其他參數(shù)為系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)。C分?jǐn)?shù)為原始卵裂位點(diǎn)得分，CS網(wǎng)絡(luò)的輸出，可以區(qū)分信號(hào)肽切割位點(diǎn)與其他所有位點(diǎn)。S分?jǐn)?shù)為信號(hào)肽分?jǐn)?shù)。SP網(wǎng)絡(luò)的輸出，可以將信號(hào)肽中的位置與蛋白質(zhì)成熟部分中的位置以及沒(méi)有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)。Y得分為合并切割位點(diǎn)得分，即C分?jǐn)?shù)和S分?jǐn)?shù)的斜率的組合，比單獨(dú)的原始C分?jǐn)?shù)產(chǎn)生更好的切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)。當(dāng)S＞0.5時(shí)，為分泌蛋白且有信號(hào)肽，Y的最大值用來(lái)判斷信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)；利用SOPMA進(jìn)行SlMYB44蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，參數(shù)默認(rèn)為原始參數(shù)；利用Swiss Model軟件進(jìn)行同源建模預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；啟動(dòng)子分析運(yùn)用PlantCARE，統(tǒng)計(jì)并分析SlMYB44啟動(dòng)子所包含的順式作用元件。

1.3.2 亞細(xì)胞定位

（1）pMDC43-MYB44載體構(gòu)建

模板擴(kuò)增：利用Trizol法提取葉片RNA，然后用全式金的TransScript?第一鏈合成試劑盒將純化后的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃冰箱保存。根據(jù)NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列(LOC101249225)，利用設(shè)計(jì)好的引物，以番茄葉片cDNA為模板，對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR產(chǎn)物回收：加入4倍體積的Buffer CP到1.5 mL離心管；劇烈震蕩，短暫離心；把吸附柱放在收集管里；把步驟3的混合物轉(zhuǎn)入吸附柱；13800 r/min離心1 min，棄濾液；加入700 μL洗脫液，13800 r/min離心1 min，棄濾液；加入500 μL洗脫液，13800 r/min離心1 min，棄濾液；13800 r/min離心2 min，甩吸附柱上的乙醇；把吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL離心管，在其中心加入30 μL ddH2O，室溫放置1 min；13800 r/min離心2 min，濾液即是回收的DNA；PCR產(chǎn)物連接表達(dá)載體。

載體雙酶切及連接：配制20 μL（體積）的雙酶切連接體系：ddH2O 6 μL；10×FastDigest Green Buffer 2 μL；Vector 10 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。配制 10 μL LIC 連接體系 ：5×InFusion Mix 2 μL；target 5 μL；Vector 3 μL；FastDigest AscI or NcoI 1 μL；FastDigest SacI or PstI 1 μL。輕輕搖勻，短暫離心；50℃放置15 min；按照大腸桿菌DH5α說(shuō)明書(shū)步驟將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆進(jìn)行PCR陽(yáng)性驗(yàn)證。如果跑出條帶，則提取質(zhì)粒進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證。

（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和亞細(xì)胞定位：按照熱擊法，把測(cè)序正確的質(zhì)粒按照EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接種正確克隆于LB液體培養(yǎng)基中搖菌擴(kuò)繁，用等體積的buffer(10 mmol/LMES，200 μmol/L AS，10 mmol/L MgCl2)懸浮28℃培養(yǎng)至OD600=0.3的農(nóng)桿菌菌液，并在室溫下靜置4～6 h活化，然后由下表皮注射到4周大的煙草葉片背面，繼續(xù)培養(yǎng)4～6天后采集葉片置于激光共聚焦顯微鏡下，直接觀察葉片的熒光情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)分析

2.1.1 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域分析SlMYB44基因全長(zhǎng)1551 bp，編碼372個(gè)氨基酸，它除了含有典型的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的DNA結(jié)構(gòu)域，還含有PLN03091、REB1和SANT結(jié)構(gòu)域（圖1）。

圖1 SlMYB44基因保守結(jié)構(gòu)域分析

2.1.2 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白理化性質(zhì)分析 SlMYB44蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為41247.25，理論等電點(diǎn)PI為8.25，說(shuō)明蛋白偏堿性。蛋白質(zhì)的總分子式為C1797H2819N527O560S15，原子總數(shù)為5718。氨基酸數(shù)為372個(gè)，其中 Arg(R)21 個(gè)(5.6%)、Asn(N)17 個(gè)(4.6%)、Asp(D)18個(gè)(4.8%)、Cys(C)5個(gè)(1.3%)、Gln(Q)37個(gè)(9.9%)、Glu(E)17 個(gè)(4.6%)、Gly(G)23個(gè)(6.2%)、His(H)8個(gè)(2.2%)、Ile(I)12個(gè)(3.2%)、Leu(L)29個(gè)(7.8%)、Lys(K)16個(gè)(4.3%)、Met(M)10個(gè)(2.7%)、Phe(F)15個(gè)(4%)、Pro(P)38個(gè)(10.2%)、Ser(S)45個(gè)(12.1%)、Thr(T)15 個(gè)(4%)、Trp(W)6 個(gè)(1.6%)、Tyr(Y)15個(gè)(4%)、Val(V)18個(gè)(4.8%)。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp和Glu）為35個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg和Lys）為37個(gè)。SlMYB44蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為63.96，因此將該蛋白質(zhì)歸類(lèi)為不穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為62.12，總平均親水性為-0.732。預(yù)測(cè)該蛋白的半衰期為：在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中30 h，在酵母中大于20 h，在大腸桿菌中大于10 h。在該蛋白親疏水性分析中，最大疏水性值為1.533，最大親水性值為-3.411。如圖2所示，在SlMYB44蛋白中親水性的氨基酸明顯更多，說(shuō)明該蛋白屬于親水性蛋白。

圖2 SlMYB44蛋白的理化性質(zhì)分析

2.1.3 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白信號(hào)肽分析 切割位點(diǎn)C的最大值為0.132，位于29位氨基酸；信號(hào)肽分?jǐn)?shù)S的最大值為0.261，位于8位氨基酸；合并切割位點(diǎn)Y最大值為0.147，位于29位氨基酸。S平均值0.171，其預(yù)測(cè)的剪切點(diǎn)在1～28位氨基酸。S平均值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.5，說(shuō)明SlMYB44蛋白為非分泌蛋白，沒(méi)有潛在的信號(hào)肽位點(diǎn)（圖3）。

圖3 SlMYB44蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.1.4 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白跨膜域分析 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼的372個(gè)蛋白氨基酸均不在跨膜區(qū)，說(shuō)明SlMYB44蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白（圖4）。

圖4 SlMYB44蛋白跨膜域預(yù)測(cè)

2.1.5 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 SlMYB44蛋白中有233個(gè)氨基酸殘基組成不規(guī)則卷曲，含量高達(dá)62.63%，其次為α-螺旋，占25.54%，延伸鏈占8.06%，最少的是β-折疊，僅占3.76%（圖5）。

圖5 SlMYB44蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.6 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子所編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 為了解SlMYB44蛋白的三維結(jié)構(gòu)，利用Swiss Model軟件對(duì)其進(jìn)行同源建模，獲得三維效果圖（圖6）。

圖6 SlMYB44蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.1.7 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子順式作用元件分析 利用軟件Plant CARE對(duì)SlMYB44基因啟動(dòng)子序列上的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分類(lèi)整理，如表1所示。表明在SlMYB44基因順式作用元件中，大部分與逆境脅迫、激素響應(yīng)等元件相關(guān)。

表1 SlMYB44基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.2 SlMYB44轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位

2.2.1 pMDC43-MYB44載體構(gòu)建

（1）引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增

根據(jù)NCBI上提供的番茄SlMYB44基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（表2），選取SlMYB44基因擴(kuò)增編碼區(qū)cDNA序列片段，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，得到了全長(zhǎng)1119 bp的目的片段（圖7）。

表2 引物設(shè)計(jì)列表

圖7 KOD-FX擴(kuò)增

（2）pMDC43-MYB44的菌落PCR鑒定

PCR產(chǎn)物回收后，根據(jù)無(wú)縫連接試劑盒，進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。分別挑取4～8個(gè)克隆PCR鑒定，PCR擴(kuò)增所用引物為載體上的測(cè)序引物(43F/43R)（圖8）。

圖8 載體pMDC43-MYB44菌液PCR結(jié)果

2.2.2 亞細(xì)胞定位及熒光觀察 網(wǎng)站ProtComp 9.0預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明SlMYB44蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)氨基酸表達(dá)分析和熒光形態(tài)白場(chǎng)位置判斷，自發(fā)光的信號(hào)來(lái)自于葉綠體，從圖中可以看出，綠色和紅色沒(méi)有重合，說(shuō)明SlMYB44蛋白沒(méi)有在葉綠體中表達(dá)。SlMYB44蛋白的熒光信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞核上，陰性對(duì)照的空載熒光信號(hào)分布在細(xì)胞核以及細(xì)胞膜上。說(shuō)明SlMYB44蛋白大部分表達(dá)于細(xì)胞核，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖9）。

圖9 亞細(xì)胞定位圖

3 討論與結(jié)論

R2R3-MYB蛋白是植物特有的最豐富的物種，在植物的基因組中大約有100多個(gè)R2R3-MYB成員，積極參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝調(diào)控、生物和非生物脅迫應(yīng)答[15]。MYB44是典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)基因槍介導(dǎo)法將帶有AtMYB44基因的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入小麥幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，證明擬南芥AtMYB44基因?qū)π←溈共∧芰Υ嬖谟绊慬16]。將擬南芥AtMYB44基因轉(zhuǎn)入水稻，表明該基因過(guò)量表達(dá)明顯提高了水稻對(duì)低溫脅迫的耐受性[17]。馬鈴薯StMYB44、StMYB44b基因能夠在植物響應(yīng)蔗糖中起重要的調(diào)控作用[18]。茄子SmMYB44轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)激活亞精胺合酶的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)抗病能力[19]。擬南芥AtMYB44通過(guò)依賴(lài)于SA防衛(wèi)信號(hào)通路正調(diào)控其抗病性[20]。馬鈴薯StMYB44通過(guò)抑制磷轉(zhuǎn)移相關(guān)基因StPHO1表達(dá)負(fù)調(diào)控磷的轉(zhuǎn)運(yùn)[21]，說(shuō)明MYB44基因在響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮著重要的作用。番茄SlMYB44基因順式作用元件分析也表明大部分與逆境脅迫、激素響應(yīng)等元件相關(guān)，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明SlMYB44蛋白大部分表達(dá)于細(xì)胞核。該結(jié)果對(duì)于探索SlMYB44在番茄抗寒過(guò)程中發(fā)揮的作用，豐富MYB基因家族成員的研究提供生物信息學(xué)參考。為了更深入地探尋該基因在番茄耐冷脅迫中發(fā)揮的作用，下一步可構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體并對(duì)番茄外殖體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，對(duì)過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株進(jìn)行低溫處理并測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)。同時(shí)也可以根據(jù)亞細(xì)胞定位結(jié)果進(jìn)行蛋白互作位置研究，進(jìn)一步探究番茄SlMYB44基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因調(diào)控、蛋白互作和分子調(diào)控機(jī)制。