孫廣瀚，劉 健*，萬 磊，劉 維，龍 琰，鮑丙溪，張 穎

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，安徽 合肥 230031

2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津 300000

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis，AGA）是一種關(guān)節(jié)疾病，其特征是尿酸單鈉（monosodium urate，MSU）晶體在關(guān)節(jié)及其周圍組織中積聚，屬于代謝性的風(fēng)濕病[1]。有研究表明MSU晶體主要通過激活Toll樣受體和含NACHT?LRR?PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3炎性小體信號傳導(dǎo)導(dǎo)致AGA的發(fā)作[2]。通過篩選和鑒定疾病中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，可以用于疾病發(fā)生發(fā)展的預(yù)測和診斷[3]。其中Raybiotech的抗體陣列有固定的抗體，可以鑒定培養(yǎng)基或體液中的分子生物，并用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，這些蛋白質(zhì)可以成為疾病的生物標(biāo)志物，如朱佳寧等[4]利用AAH?ΒLG?507芯片試劑盒檢測息肉狀脈絡(luò)膜血管病變血清特異性蛋白。

黃芩清熱除痹膠囊（Huangqin Qingre Chubi Capsules，HQC）具有清熱利濕、通絡(luò)止痛之功，是健脾化濕清熱法具體體現(xiàn)的代表方劑，前期研究表明HQC內(nèi)服配合芙蓉膏外敷治療AGA療效顯著[5?6]，而且能夠通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）?叉頭框蛋白O3a（forkhead box O3a,FOⅩO3a）?錳超氧化物歧化酶（manganese superoxide dismutase,superoxide dismutase 2，MnSOD）信號通路改善氧化應(yīng)激狀態(tài)[7]。本研究基于血清蛋白質(zhì)組學(xué)來識別可能引發(fā)AGA的特異性蛋白質(zhì)，然后觀察HQC改善AGA患者炎性反應(yīng)的情況，探究其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

HQC來自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心，批號Z20120503；兔抗白細(xì)胞介素?8（interleukin?8，ⅠL?8）抗體（批號AA01151）由Βioworld公司提供；兔抗腫瘤壞死因子受體超家族成員ⅠⅠ（tumor necrosis factor receptor ⅠⅠ，TNF?RⅠⅠ）抗體（批號00055382）由Proteintech公司提供；兔抗巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β（macrophage inflammatory protein 1β，MⅠP?1β）抗體（批號GR2351556）由Abcam公司提供；兔抗粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM?CSF）抗體（批號25）由CST公司提供；GM?CSF檢測試劑盒（批號GR2020?05）、ⅠL?8檢測試劑盒（批號GR2020?05）、MⅠP?1β檢測試劑盒（批號GR2020?05）、TNF?RⅠⅠ檢測試劑盒（批號GR2020?05）、超敏C?反應(yīng)蛋白（hypersensitive C?reactive protein，hs?CRP）檢測試劑盒（批號GR2020?05）、白細(xì)胞介素?1β（interleukin?1β，ⅠL?1β）檢測試劑盒（批號GR2020?05）、ⅠL?6檢測試劑盒（批號GR2020?05）、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）檢測試劑盒（批號GR2020?05）、轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor?β，TGF?β）檢測試劑盒（批號GR2020?05），以上檢測試劑盒都來自于武漢基因美科技有限公司。

1.2 受試者來源

1.2.1 差異蛋白篩選受試者 選取2019年6月至2019年12月在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科進(jìn)行治療的AGA患者為研究對象。應(yīng)用PEMS3.1統(tǒng)計軟件包生成隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)抽取10名AGA患者（AGA組），其中男9例、女1例，年齡17～78歲；通過體檢招募了10名健康志愿者作為對照組，其中男9例、女1例，年齡18～72歲，作為差異蛋白篩選受試對象。

1.2.2 ELⅠSA及Western blotting檢測受試者 應(yīng)用PEMS3.1統(tǒng)計軟件包生成隨機(jī)數(shù)字表，隨機(jī)抽取從2019年12月至2020年6月在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科進(jìn)行治療的AGA患者60名（治療組），其中男45例，女15例，年齡17～78歲，并通過體檢招募了60名健康志愿者作為對照組，其中男45例，女15例，年齡18～72歲，作為ELⅠSA檢測的試驗對象；其中隨機(jī)抽取2例男性患者，1名女性患者，年齡（57.67±10.21）歲及3例健康志愿者，其中2例男性，1名女性，年齡（50.67±12.37）歲，作為Western blotting檢測的試驗對象。

本研究通過天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號TYLL2018[K]字023），所有參與者均提供書面知情同意書。

1.2.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn) 診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2015年美國風(fēng)濕病學(xué)會/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（ACR/EULAR）痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合AGA診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）患者同意本治療方案，能配合隨訪治療，并取得患者簽署的知情同意書。

1.3 治療方法

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的60名AGA患者（AGA組）口服HQC，3次/d，3粒/次，連續(xù)治療3周為1療程，以3療程為限。

1.4 血清樣本采集

取AGA患者和健康志愿者全血5 mL，室溫血液自然凝固10～20 min，2000～3000 r/min離心20 min，收集上清并于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 特異性蛋白質(zhì)的篩選

將來自10位AGA患者和10位健康志愿者的20份血清樣品進(jìn)行Raybiotech抗體陣列檢測[9]。應(yīng)用QAH?ⅠCM?1試劑盒并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將數(shù)據(jù)可視化展示，使用R包“ggfortify”對特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行散點圖及火山圖處理，使用R包“gplots”對特異性蛋白質(zhì)進(jìn)行分層聚類分析，將特異性蛋白質(zhì)及組別進(jìn)行分類，使用R包“ggbiplot”進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），選取前2個主成分，直觀地對樣本進(jìn)行分類處理。

1.6 Western blotting檢測特異性蛋白質(zhì)表達(dá)

首先從HQC治療前后AGA患者和健康志愿者外周血中提取單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PΒMCs），進(jìn)行細(xì)胞收集及蛋白的提取，室溫孵育2 h后加入PΒST，每次洗滌10 min，共洗滌3次。離心細(xì)胞后加RⅠPA細(xì)胞裂解液，收集總蛋白，進(jìn)行蛋白定量、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，漂洗去轉(zhuǎn)膜液后加入5%脫脂奶粉，封閉2 h；加入TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF一抗，緩慢搖動孵育過夜；洗滌10 min，3次；參考二抗說明書，按照1︰20 000用稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。室溫孵育1.5 h。再次洗滌后用ECL檢測蛋白，用Ⅰmage J軟件測定膜上各條帶的積分吸光度值。

1.7 ELISA檢測特異性蛋白和炎癥因子水平

參考ELⅠSA試劑盒說明書檢測HQC治療前后患者血清特異性蛋白水平；按照ELⅠSA試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測對照組健康志愿者和治療組患者治療前后血清中炎癥因子ⅠL?1β、ⅠL?6、TNF?α、TGF?β、hs?CRP的水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較及治療前后比較，符合正態(tài)分布采用t檢驗，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗，3組間比較采用方差分析，P＜0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AGA特異性蛋白質(zhì)的篩選

利用Raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片測定10位AGA患者和10位健康志愿者血清中50種蛋白質(zhì)水平，其中22個蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，28個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，根據(jù)log2FC（fold change）的絕對值＞0.263篩選出4種最顯著差異表達(dá)蛋白TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF，進(jìn)行火山圖及散點圖可視化，其中在AGA患者體內(nèi)ⅠL?8、MⅠP?1β和TNF?RⅠⅠ表達(dá)上調(diào)，GM?CSF表達(dá)下調(diào)（圖1?A、Β）。分層聚類分析，樣本分為3個主要類別，其中GM?CSF和ⅠL?8聚為一類，MⅠP?1β和TNF?RⅠⅠ各自聚為一類（圖1?C）。PCA確定了在2組中差異表達(dá)的2個主成分蛋白質(zhì)。每個樣品的前2個主要成分（PC1和PC2）分別顯示出58.97%和26.76%的總變異性，這表明遠(yuǎn)離大多數(shù)樣本點的離群點，即對照組與AGA組無相關(guān)性（圖1?D）。

圖1 通過芯片檢測AGA組和對照組中的蛋白質(zhì)表達(dá)譜Fig.1 Detection of protein expression profiles in AGA group and control group by chip

2.2 HQC治療前后特異性蛋白質(zhì)表達(dá)變化

選擇AGA患者和健康志愿者最顯著差異表達(dá)的4種蛋白TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示對照組與AGA患者治療前比較，TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF蛋白水平差異顯著，AGA患者治療前TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，GM?CSF蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)。與治療前比較，AGA患者經(jīng)HQC治療后血清TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8水平顯著降低，GM?CSF水平顯著升高。ELⅠSA檢測顯示，HQC治療前后AGA患者血清TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF水平差異明顯，與治療前比較，經(jīng)HQC治療后AGA患者血清TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8水平顯著降低（P＜0.01），GM?CSF水平顯著升高（P＜0.01）（圖2、3）。

圖2 Western blotting檢測特異性蛋白質(zhì)表達(dá)Fig.2 Western blotting detection of specific protein expression

2.3 HQC治療前后炎癥指標(biāo)變化

ELⅠSA結(jié)果顯示，與對照組相比，HQC治療前后AGA患者血清ⅠL?1β、ⅠL?6、TNF?α、TGF?β、hs?CRP差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；HQC治療后炎癥指標(biāo)水平均顯著低于治療前（P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

3 討論

AGA既包括嘌呤代謝紊亂和關(guān)節(jié)炎癥，又包括遺傳和蛋白質(zhì)組學(xué)因素[10]。蛋白質(zhì)組學(xué)在AGA中的運用有利于確定疾病發(fā)展的機(jī)制，并且可以篩選出診斷的生物標(biāo)志物，提供了新的治療靶標(biāo)。細(xì)胞因子抗體芯片是蛋白質(zhì)芯片的一種，通過捕獲待測樣品中的抗原，從而獲得特異性的蛋白質(zhì)[11]。在AGA治療前，利用Raybiotech抗體陣列篩選出TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF 4種表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)，大量研究顯示這4種蛋白都可以刺激中性粒細(xì)胞從而導(dǎo)致AGA的發(fā)生。

圖3 HQC治療前后特異性蛋白質(zhì)水平變化Fig.3 Changes in specific protein before and after treatment

圖4 HQC治療前后炎癥指標(biāo)變化Fig.4 Changes in inflammation indicators before and after treatment

黃芩清熱除痹膠囊由黃芩、薏苡仁、桃仁、梔子、威靈仙5味中藥組成，其中黃芩、梔子為君藥，威靈仙為臣藥，薏苡仁、桃仁為使藥，具有健脾化濕、清熱除痹之功[12]?，F(xiàn)代藥理表明黃芩具有抗病毒、抗炎、抗氧化以及免疫調(diào)節(jié)等作用[13]。梔子能抑制體外的黃嘌呤氧化酶活性和降低體內(nèi)的尿酸血癥[14]，還能抗氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和抗炎[15]。威靈仙已被廣泛用于治療關(guān)節(jié)痛，有學(xué)者提出威靈仙能夠緩解痛風(fēng)的急性發(fā)作，降低血尿酸[16]。薏苡仁是藥食同源品，具有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥、緩解消化道癥狀、增加尿量和改善炎癥狀態(tài)的作用[17?18]，故有學(xué)者提出治療痛風(fēng)以薏苡仁為主[19]。桃仁對不同血瘀證皆可以使用[20]，能夠降低血黏度、抑制微血栓形成[21]。本團(tuán)隊通過前期大量試驗發(fā)現(xiàn)，高水平的尿酸可以誘導(dǎo)外周血PΒMCs中的炎癥途徑激活，這可能導(dǎo)致有浸潤能力的白細(xì)胞大量存在[22]，故本試驗考察在PΒMCs中特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)。通過HQC的治療，特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)GM?CSF、ⅠL?8、MⅠP?1β和TNF?RⅠⅠ水平與治療前比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。GM?CSF主要參與炎癥，激活促炎髓系細(xì)胞。ⅠL?8是一種與趨化性相關(guān)的炎性細(xì)胞因子，可通過激活相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)炎癥的發(fā)生，從而對AGA的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生較大的影響[23]。而MⅠP?1β和TNF?RⅠⅠ現(xiàn)階段在AGA的發(fā)病機(jī)制研究較少，MⅠP?1β是根據(jù)MⅠP?1分子結(jié)構(gòu)的差異分離出來的新興細(xì)胞因子，大量研究表明ⅠL?1β可以介導(dǎo)MⅠP?1β產(chǎn)生，最終導(dǎo)致炎癥細(xì)胞在關(guān)節(jié)周圍的聚集和炎癥持續(xù)[24]。TNF?RⅠⅠ是2型腫瘤壞死因子受體，通過結(jié)合TNF從而激活TNF受體，進(jìn)而激活TNF的生物學(xué)活性，眾所周知TNF?α是一種典型的促炎細(xì)胞因子，在痛風(fēng)急性發(fā)作中具有關(guān)鍵作用。推測HQC可能通過調(diào)控這4個特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)從而緩解AGA的炎癥狀態(tài)。在AGA發(fā)生發(fā)展過程中公認(rèn)的炎癥因子包括ⅠL?1β、ⅠL?6、TNF?α、TGF?β、hs?CRP，這些炎癥因子可以伴隨AGA的發(fā)展，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HQC治療后這些炎癥因子水平明顯低于治療前。說明HQC的治療不僅可以明顯地改善TNF?RⅠⅠ、MⅠP?1β、ⅠL?8、GM?CSF 4種特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)，而且能改善在AGA發(fā)展過程中公認(rèn)的炎癥因子水平，達(dá)到改善AGA炎癥狀態(tài)的目的。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)HQC降低佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠血清中ⅠL?8、ⅠL?1β、ⅠL?6、TNF?α水平，升高ⅠL?10水平，從而發(fā)揮其抗炎消腫的作用[25?26]。而且對強(qiáng)直性脊柱炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)濕熱證候患者均有效，且具有激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxi?some proliferator?activated receptor γ，PPARγ）介導(dǎo)AMPK/FOⅩO3a信號通路，改善患者氧化應(yīng)激狀態(tài)的作用[7,14]。

本研究尚存在樣本量小，代表性不足等缺陷。但本研究首次運用Raybiotech細(xì)胞因子抗體芯片篩選蛋白質(zhì)組學(xué)的差異表達(dá)，觀察到HQC可以改善AGA患者炎癥狀態(tài)，其機(jī)制可能是通過改善GM?CSF、ⅠL?8、MⅠP?1β和TNF?RⅠⅠ等特異性蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而改善AGA患者炎癥狀態(tài)，提高機(jī)體抗炎能力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突