王 敏，谷 元，周 宇，武麗南，開躍義，耿雅杰，姚景春，王現(xiàn)珍*，司端運(yùn)*

1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070

2.天津藥物研究院 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193

3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276000

4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，天津 300193

隨著社會的發(fā)展和國家對中藥的高度重視，天然產(chǎn)物逐漸成為藥物研究的熱點(diǎn)，從天然產(chǎn)物中尋找活性成分或通過改善其結(jié)構(gòu)，來獲取新的化學(xué)藥品已然成為新藥開發(fā)的一種重要途徑[1]。淫羊藿作為我國傳統(tǒng)中藥，約有上千年的應(yīng)用歷史，具有治療骨質(zhì)疏松[2-5]、抗癌[6]、抗腫瘤、提高免疫力[7]、治療老年癡呆[8]等作用，因其廣泛的藥理活性受到關(guān)注。

淫羊藿苷元是淫羊藿中主要藥效單體成分，屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物的基本母核為苯并吡喃酮（C6-C3-C6）的一類多酚化合物，以游離或與糖結(jié)合成苷的形式廣泛存在于多種植物中，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、清除自由基、抗炎、心血管保護(hù)等多種藥理活性[9]。盡管黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，但是由于其結(jié)構(gòu)中的多酚羥基，使該類化合物在體循環(huán)血漿中主要以與葡萄糖醛酸或硫酸酯結(jié)合物的形式暴露，發(fā)揮藥效作用的游離黃酮苷元的暴露量很低，普遍被認(rèn)為具有較低的生物利用度，限制了該類化合物的成藥性開發(fā)[10-12]。但是化合物在體內(nèi)的真實(shí)濃度并不只是血藥濃度所表現(xiàn)的，其在體內(nèi)的生物利用度和暴露水平與血藥濃度及組織濃度都有關(guān)系，而且組織中的存在形式更是直接影響藥效的發(fā)揮。淫羊藿苷或淫羊藿苷元在動(dòng)物血漿和組織中濃度測定的相關(guān)研究已有報(bào)道[13-19]，但是尚沒有研究報(bào)道淫羊藿苷元及其II相代謝產(chǎn)物在血液循環(huán)系統(tǒng)和組織臟器中的暴露形式及相應(yīng)暴露程度。

本研究通過LC-MS/MS建立大鼠血漿及組織中游離淫羊藿苷元及生物樣品經(jīng)葡萄糖醛酸和硫酸復(fù)合酶水解后得到的總淫羊藿苷元的檢測方法，考察大鼠ig淫羊藿苷元后的絕對生物利用度、血漿動(dòng)力學(xué)和組織分布特征，揭示淫羊藿苷元在血液循環(huán)系統(tǒng)和組織臟器中的暴露程度、暴露形式及暴露比例，為具有低血漿藥物暴露卻呈現(xiàn)良好體內(nèi)藥理活性的黃酮類藥物開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

淫羊藿苷元（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.33%，批號170601）、淫羊藿苷元納米晶（規(guī)格為27.4 mg/mL，批號181122）、淫羊藿苷元納米晶溶媒（羥丙甲纖維素E5LV和十二烷基硫酸鈉的混合物，批號分別為D011FBLL01和101420180501），均為山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；漢黃芩素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，批號111515-201706），中國食品藥品檢定研究院；β-葡萄糖醛酸酶（β-葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶復(fù)合酶，批號SLBV4801），Sigma公司；磷酸二氫銨（色譜純，天津市立元化工有限公司，批號20150814）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司，批號分別為185366、186355）；正己烷（色譜純，天津市康科德科技有限公司，批號190522）；甲基叔丁基醚（色譜純，美國Fisher公司，批號18100787）；甲酸銨（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號20150313）；甲酸（色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號20181006）；甲酸（質(zhì)譜級，Sigma-Aldrich公司，批號BCBP4740V）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（含LC-30AD二元梯度泵、SIL-30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-30A柱溫箱、DGU-20A5脫氣機(jī)，日本島津公司）；5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（含Turbo ESI源、Analyst 1.5.2工作站，美國AB Sciex公司）；17R臺式高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo Scientific公司；恒溫混勻儀，杭州奧盛儀器有限公司；Turbo Vap LV型樣品濃縮儀，美國Caliper公司。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱ZORBAX Eclipse Plus C8（100 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%甲酸-5%乙腈水溶液（B）（80︰20），等度洗脫，洗針?biāo)疄橐译?水（90︰10），體積流量為0.6 mL/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣溫度6 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，負(fù)離子檢測；噴霧電壓為?4500 V；源溫度500 ℃；加熱氣和噴霧氣均為60 Pa；卷簾氣為20 Pa；出口電壓?17 V，入口電壓?10 V；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測，淫羊藿苷元和內(nèi)標(biāo)漢黃芩素用于定量監(jiān)測的離子對分別為 [M?H]?m/z367.1→309、283.1→162.9；碰撞能分別為?37、?39 eV；去簇電壓分別為?110、?140 V。

2.3 動(dòng)物

7～9周齡SD大鼠36只，SPF級，190.5～298.5 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0006、SCXK（京）2016-0011，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（25±2）℃，濕度為（50±10）%，12 h光照，晝夜交替，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)天津天誠新藥評價(jià)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審核通過（批準(zhǔn)號2019022501），實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求。大鼠給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后3 h統(tǒng)一給食。

2.4 給藥溶液配制

劑量的選擇參考藥效學(xué)的量效關(guān)系，大鼠血漿動(dòng)力學(xué)和組織分布以10 mg/kg ig給藥，iv以5 mg/kg給藥。大鼠ig給藥制劑為淫羊藿苷元納米晶供試品，加入空白溶媒（淫羊藿苷元納米晶溶媒）制成；大鼠iv給藥制劑為淫羊藿苷元原料藥，加入N,N-二甲基甲酰胺溶解后，再加入5%葡萄糖注射液（N,N-二甲基甲酰胺-5%葡萄糖注射液4∶1）稀釋，配制成溶液型制劑。

2.5 給藥、分組及樣品采集

2.5.1 血漿動(dòng)力學(xué) 參考前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，依據(jù)總淫羊藿苷元及游離淫羊藿苷元大鼠ig給藥后的達(dá)峰時(shí)間、消除特點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將12只SD大鼠，隨機(jī)分為2組，每組6只，分別ig（10 mg/kg）和iv（5 mg/kg）淫羊藿苷元，并于給藥后0.083 3、0.25、0.5、1、2、3、4、6、9、12、15、18、24 h自頸靜脈采血，肝素鈉抗凝，并離心分離血漿，?20 ℃冰箱凍存至LC-MS/MS定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物統(tǒng)一麻醉后脫頸椎處死。

2.5.2 組織分布 根據(jù)血漿動(dòng)力學(xué)的特征，游離淫羊藿苷元和總淫羊藿苷元在0.292 h左右達(dá)到峰值，半衰期分別為0.812、2.73 h。設(shè)計(jì)組織樣本采集時(shí)間點(diǎn)分別0.25、2、9、18 h，包含藥物的吸收、分布、消除過程。將24只SD大鼠，隨機(jī)分為4組，分別為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，ig淫羊藿苷元（10 mg/kg），并于各時(shí)間點(diǎn)腹主動(dòng)脈取血并立即脫頸椎處死動(dòng)物，分別取血漿、腦、肌肉、脂肪、卵巢、子宮、睪丸、心、肝、脾、肺、腎、胃、腸（十二指腸段）、骨髓。組織稱質(zhì)量，剪刀剪碎，以1︰5（g/mL）的比例用純甲醇在冰浴條件下制備組織勻漿，–20 ℃冷凍保存待測。

2.6 樣品處理

2.6.1 血漿中的淫羊藿苷元

（1）游離淫羊藿苷元測定：吸取50 μL血漿樣品，加入150 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，渦旋1 min后，吸取150 μL，加入50 μL內(nèi)標(biāo)漢黃芩素甲醇溶液，1.2 mL提取劑甲基叔丁基醚-正己烷（2∶1），渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上層有機(jī)相960 μL于玻璃試管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑尤?00 μL復(fù)溶液（70%甲醇水溶液）渦旋復(fù)溶，取復(fù)溶后樣品于內(nèi)插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，進(jìn)行LC-MS/MS定量分析。

（2）總淫羊藿苷元測定：吸取50 μL血漿樣品，加入150 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，渦旋1 min，取30 μL加入125 μL 200 U β-葡萄糖醛酸酶混勻后，37 ℃孵育40 min后加入50 μL內(nèi)標(biāo)漢黃芩素，之后提取等步驟與游離淫羊藿苷元測定步驟相同。

2.6.2 組織中的淫羊藿苷元

（1）游離淫羊藿苷元測定：吸取50 μL組織勻漿樣品，加入50 μL甲醇，250 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，25 μL內(nèi)標(biāo)漢黃芩素甲醇溶液，1.2 mL提取劑正己烷-二氯甲烷-異丙醇（20∶10∶1），渦旋2 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。取上層有機(jī)相960 μL于玻璃試管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈珊螅尤?00 μL復(fù)溶液渦旋復(fù)溶，取復(fù)溶后樣品于內(nèi)插管中，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

（2）總淫羊藿苷元測定：吸取50 μL組織勻漿樣品，加入50 μL甲醇，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑尤?50 μL 0.05 mol/L磷酸二氫銨水溶液，50 μL β-葡萄糖醛酸酶混勻后，37 ℃孵育40 min，加入25 μL內(nèi)標(biāo)漢黃芩素甲醇溶液，之后提取等步驟與游離淫羊藿苷元測定步驟相同。

2.7 數(shù)據(jù)處理

血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用WinNonlin 7.0軟件非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中血藥濃度-時(shí)間曲線下面積（AUC）采用梯形法計(jì)算，消除半衰期（t1/2）采用Best Fit法計(jì)算，峰濃度（Cmax）及達(dá)峰時(shí)間（Tmax）采用實(shí)測值。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

血漿中淫羊藿苷元的LC-MS/MS定量分析方法經(jīng)過了完整的方法學(xué)驗(yàn)證，在該分析方法下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定，總淫羊藿苷元和游離淫羊藿苷元的線性范圍分別為0.01～5 μg/mL和0.5～100 ng/mL，曲線斜率的變異系數(shù)均小于5.13%，相關(guān)系數(shù)大于0.99，表明在該范圍濃度內(nèi)線性良好。定量下限分別為0.01 μg/mL和0.5 ng/mL，準(zhǔn)確度在96.3%～108%，精密度小于9.52%。低、高2個(gè)質(zhì)量濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)在87.7%～105%，變異系數(shù)小于11.6%。

組織中淫羊藿苷元的LC-MS/MS定量分析方法分別選取3個(gè)代表性組織腦、心、肝進(jìn)行了1個(gè)分析批的部分方法學(xué)驗(yàn)證。組織中的內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定，總淫羊藿苷元和游離淫羊藿苷元的線性范圍均為2.5～1000 ng/g，相關(guān)系數(shù)大于0.99，表明在該范圍濃度下線性關(guān)系良好。定量下限為2.5 ng/g，準(zhǔn)確度在103%～111%，精密度小于9.52%。低、高2個(gè)質(zhì)量濃度水平的基質(zhì)效應(yīng)在61.9%～89.4%，變異系數(shù)小于9.16%。

血漿和組織中的方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果均符合指導(dǎo)原則要求。

3.2 淫羊藿苷元的大鼠血漿動(dòng)力學(xué)

大鼠ig給藥后血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。大鼠ig及iv給藥后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1、2。

圖1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后游離淫羊藿苷元 (A) 與總淫羊藿苷元 (B) 的血藥濃度-時(shí)間曲線 (±s ,n=6)Fig.1 Plasma concentration-time curve of free (A) and total (B) icaritin after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s ,n=6)Table 1 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表1 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s ,n=6)Table 1 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

MRT為平均駐留時(shí)間MRT is the average resident time

參數(shù) 單位 游離淫羊藿苷元 總淫羊藿苷元Cmax ng·mL?1 12.90±5.77 3800±1110 Tmax h 0.292±0.102 0.292±0.102 AUC0-t h·ng·mL?1 12.00±8.01 5760±2200 AUC0-∞ h·ng·mL?1 16.80±6.89 5840±2180 MRT0-t h 0.743±0.266 2.580±0.510 MRT0-∞ h 1.130±0.257 2.910±0.558 t1/2 h 0.812±0.263 2.73±1.28 F % 1.42 96.0

大鼠ig給藥淫羊藿苷元后，吸收迅速，消除較快，在血漿中總淫羊藿苷元的暴露量明顯高于游離淫羊藿苷元，總淫羊藿苷元的Cmax和AUC0-∞分別是游離淫羊藿苷元的295倍和347倍，提示淫羊藿苷元在血液循環(huán)系統(tǒng)中只有少部分以原型的形式存在，大部分被代謝成為葡糖醛酸結(jié)合物和硫酸酯結(jié)合物。與大鼠iv淫羊藿苷元（5 mg/kg）相比，經(jīng)劑量校正后，游離淫羊藿苷元的絕對生物利用度（F）為1.42%，總淫羊藿苷元的F為96.0%。

3.3 淫羊藿苷元的大鼠組織分布

大鼠ig給藥后各組織分布見圖2和表3。

3.3.1 游離淫羊藿苷元 大鼠ig給藥10 mg/kg，除腎、脂肪、肺在給藥后2 h達(dá)分布峰值外，其余組織中游離淫羊藿苷元均在0.25 h達(dá)分布峰值。隨后逐漸消除，給藥18 h后組織中的淫羊藿苷元已降至分布峰值的1/10或1/20以下，各組織的分布與血藥濃度的時(shí)間變化趨勢一致，未發(fā)現(xiàn)明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，淫羊藿苷元在組織中分布藥濃度的時(shí)間變化趨勢一致，未發(fā)現(xiàn)明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，淫羊藿苷元在組織中分布廣泛，所有被研究的組織中除睪丸外均可檢測到游離淫羊藿苷元。基于AUC0-t評價(jià)游離淫羊藿苷元在組織中的分布程度排序?yàn)槲?、腸、肺（110～220倍血漿）＞肝、子宮（20～65倍血漿）＞心、卵巢、脾（4～15倍血漿）＞骨髓、腎、肌肉（1～2倍血漿）＞血漿＞腦、脂肪（20%～50%血漿）＞睪丸（未檢測到）。總體趨勢上組織中游離淫羊藿苷元的暴露量高于血漿。

表2 大鼠iv 5 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s ,n=6)Table 2 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intravenous administration of icaritin (5 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

表2 大鼠iv 5 mg·kg?1淫羊藿苷元后血漿中淫羊藿苷元的藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (±s ,n=6)Table 2 Pharmacokinetic parameters of icaritin in plasma after intravenous administration of icaritin (5 mg·kg?1) in rats (±s ,n=6)

Vd為表觀分布容積，CL為清除率Vd is the apparent volume of distribution,CL is the clearance rate

參數(shù) 單位 游離淫羊藿苷元 總淫羊藿苷元Cmax ng·mL?1 978±107 2390±295 AUC0-t h·ng·mL?1422±38 3000±932 AUC0-∞ h·ng·mL?1425±38 3080±884 MRT0-t h 0.531±0.049 3.740±0.702 MRT0-∞ h 0.599±0.093 4.500±0.649 Vd L·kg?1 28.5±14.9 10.4±7.4 CL L·h?1·kg?111.80±1.05 1.73±0.48

圖2 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后游離和總淫羊藿苷元的組織分布Fig.2 Tissue distribution profile of free and total icaritin in rats after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats

表3 大鼠ig 10 mg·kg?1淫羊藿苷元后各組織中游離和總淫羊藿苷元的暴露量比較 (n=6)Table 3 Comparison of free and total icaritin exposure in different tissues after intragastric administration of icaritin (10 mg·kg?1) in rats (n=6)

3.3.2 總淫羊藿苷元 大鼠ig給藥10 mg/kg，除睪丸、肺在ig給藥后2 h達(dá)分布峰值外，其余組織中總淫羊藿苷元均在0.25 h達(dá)分布峰值。隨后逐漸消除，給藥后18 h組織中的總淫羊藿苷元已降至分布峰值的1/10或1/20以下，各組織的分布與血藥濃度的時(shí)間變化趨勢一致，未發(fā)現(xiàn)明顯的組織蓄積趨勢。大鼠ig給藥后，總淫羊藿苷元在組織中分布廣泛，所有被研究的組織中均可檢測到結(jié)合型的淫羊藿苷元。基于AUC0-t評價(jià)總淫羊藿苷元在組織中的分布程度，從高到低排序?yàn)槟c、胃、肺（1～2倍血漿）＞血漿＞肝、腎、子宮、卵巢（20%～60%血漿）＞肌肉、心、脾、睪丸、骨髓、脂肪、腦（1%～7%血漿）?？傮w趨勢上，除胃、腸外的各組織中總淫羊藿苷元的暴露量低于血漿。

大鼠灌胃淫羊藿苷元后，多數(shù)組織中游離淫羊藿苷元的暴露量、暴露時(shí)間明顯高于血漿，而且游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元的比例明顯大于血漿。

4 討論

在測定大鼠血漿和組織中總淫羊藿苷元濃度時(shí)，進(jìn)行了水解條件的考察和優(yōu)化，分別對β-葡萄糖醛酸酶的濃度（0、50、100、150、200、300、500 U）以及孵育時(shí)間（0、10、20、30、40、60 min）進(jìn)行了考察，最終確定酶濃度為200 U、孵育時(shí)間為40 min可以達(dá)到對總淫羊藿苷元的充分水解。

大鼠ig給予淫羊藿苷元后，血漿中游離淫羊藿苷元的濃度較低，游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元暴露量比為0.208%，提示ig給藥后在大鼠的血液循環(huán)系統(tǒng)中淫羊藿苷元主要以II相結(jié)合型產(chǎn)物暴露為主。進(jìn)一步結(jié)合大鼠iv給藥（5 mg/kg）的數(shù)據(jù)，ig給藥后以游離淫羊藿苷元形式計(jì)算的絕對生物利用度為1.42%，以總淫羊藿苷元形式計(jì)算的絕對生物利用度為96.0%，提示雖然淫羊藿苷元的絕對生物利用度偏低，但是其吸收分?jǐn)?shù)并不低。除胃、腸外，多數(shù)組織中游離淫羊藿苷元的暴露量明顯高于血漿，總淫羊藿苷元的暴露量低于血漿。除睪丸外，其他組織中游離淫羊藿苷元與總淫羊藿苷元AUC0-18h比值（1%～95%）遠(yuǎn)高于血漿（0.208%），即與血漿相比，游離的淫羊藿苷元在組織器官中的暴露量和暴露比例更高、持續(xù)時(shí)間更長。

淫羊藿苷元游離/結(jié)合形式暴露比例在血漿和組織中呈現(xiàn)出的懸殊差異，在其他類型的天然藥物和化學(xué)藥物的藥動(dòng)學(xué)研究中鮮有報(bào)道。這一現(xiàn)象是淫羊藿苷元特有的，還是黃酮類化合物可能具有的共性，以及產(chǎn)生該現(xiàn)象的機(jī)制？是由于其II相結(jié)合物極性增大，膜通透性變差，不易于進(jìn)入組織細(xì)胞，還是血液和組織中的結(jié)合/水解代謝酶的差異引起的？或轉(zhuǎn)運(yùn)差異引起的？以上問題均需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，以便加快推動(dòng)黃酮類化合物的成藥性開發(fā)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突