戴 瑩，施 凱，竇志華,，周榮榮，周云中，王兆龍，倪麗麗

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023

2.南京中醫(yī)藥大學(xué)南通中西醫(yī)結(jié)合臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226006

3.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇 南通 226006

4.精華制藥集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南通 226005

中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑同時(shí)是配方顆粒和經(jīng)典名方制劑的物質(zhì)基準(zhǔn)[1]，其核心作用是作為兩者工藝研究和質(zhì)量評價(jià)量值傳遞的橋接。國家藥品監(jiān)督管理局2021年1月發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》明確提出：為使中藥配方顆粒能夠承載中藥飲片安全性、有效性，需要以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為橋接，該標(biāo)準(zhǔn)湯劑為衡量單味中藥配方顆粒是否與其相對應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)；中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝研究應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為對照，以出膏率、主要成分含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜或特征圖譜的一致性為考察指標(biāo)，對原料、中間體及成品制備過程中的量質(zhì)傳遞和物料平衡進(jìn)行全面研究[2]。該局2018年5月《關(guān)于發(fā)布古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑簡化注冊審批管理規(guī)定的公告》規(guī)定：經(jīng)典名方制劑的研制分“經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)”研制與制劑研制2個(gè)階段；對湯劑而言，該物質(zhì)基準(zhǔn)又可稱為“標(biāo)準(zhǔn)湯劑”或“標(biāo)準(zhǔn)煎液”[3]。經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)研究應(yīng)關(guān)注制備過程中受熱等因素對質(zhì)量的影響、關(guān)鍵質(zhì)量屬性的量值傳遞等[4]。因此，闡明從飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律可以為配方顆粒和經(jīng)典名方制劑工藝研究和質(zhì)量評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

大黃是一味常用中藥，被收載于19個(gè)國家的藥典[5]，大黃所含成分包括蒽醌、蒽酮、鞣質(zhì)、二苯乙烯、苯丁酮類等[6]。趙曼佳等[7]收集了10批大黃飲片，采用加熱回流法制備了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定了5個(gè)游離蒽醌的含量并計(jì)算了轉(zhuǎn)移率，建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC指紋圖譜，標(biāo)定共有峰9個(gè)，采用四級(jí)桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS/MS）技術(shù)對共有峰進(jìn)行了鑒定。但該研究未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)湯劑“不少于15批”及“不得使用連續(xù)回流提取設(shè)備”的要求[2]，標(biāo)定的指紋圖譜共有峰及測定的成分也偏少。

鑒于此，本實(shí)驗(yàn)在前期建立35批大黃飲片HPLC指紋圖譜，采用Q-TOF-MS/MS技術(shù)鑒定指紋圖譜共有峰，并測定蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（AE8G）、大黃酸-8-O-葡萄糖苷（R8G）、大黃素-1-O-葡萄糖苷（E1G）、大黃酚-1-O-葡萄糖苷（C1G）、大黃酚-8-O-葡萄糖苷（C8G）、蘆薈大黃素-3-羥甲基-O-葡萄糖苷（AE3G）、大黃素-8-O-葡萄糖苷（E8G）、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷（P8G）8個(gè)結(jié)合型蒽醌和蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚5個(gè)游離型蒽醌含量的基礎(chǔ)上[6]，選擇其中23批大黃飲片制備了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了共有峰，采用Q-TOFMS/MS對共有峰進(jìn)行了鑒定，測定了標(biāo)準(zhǔn)湯劑中8個(gè)結(jié)合型蒽醌（AE8G、R8G、E1G、C1G、C8G、AE3G、E8G、P8G）、5個(gè)游離型蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）及飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中4個(gè)鞣質(zhì)類成分（沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯）、1個(gè)二苯乙烯類成分［白藜蘆醇4′-O-β-D-(6″-O-沒食子酰)-葡萄糖苷（RGG）］的含量，進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究。

1 儀器與材料

Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)，包括e2695分離單元、2998PAD檢測器和Empower 3色譜工作站，美國Waters公司；UFLC-DAD-Triple-Q-TOF/MS系統(tǒng)，包括日本島津公司Shimadzu Prominence UFLC液相色譜儀和美國AB SCIEX公司AB Sciex Triple TOF 4600質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀包括Q-TOF-MS/MS檢測器和PeakView1.6質(zhì)譜分析軟件；BT 25S型電子天平，德國Sartorius公司；PB-10型pH計(jì)，德國Sartorius公司；SK5200H超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

對照品大黃素（批號(hào)110751-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.7%）、蘆薈大黃素（批號(hào)110795-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%）、大黃素甲醚（批號(hào)110758-201616，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、大黃酸（批號(hào)110757-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%）、大黃酚（批號(hào)110796-201621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%）購自中國食品藥品檢定研究院；AE8G（批號(hào)190115）、R8G（批號(hào)180726）、E1G（批號(hào)180726）、C1G（批號(hào)1180725）、C8G（批號(hào)180726）、AE3G（批號(hào)190114）、E8G（批號(hào)180727）、P8G（批號(hào)180730）、沒食子酸（批號(hào)180114）、兒茶素（批號(hào)141224）、表兒茶素沒食子酸酯（批號(hào)140923）、番瀉苷A（批號(hào)170508）、番瀉苷B（批號(hào)CHB170509），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，購自成都克洛瑪生物科技有限公司；白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷（批號(hào)38963-95-0）、RGG（批號(hào)928340-97-0），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%，購自上海一林生物科技有限公司。

大黃飲片YP1～YP23同文獻(xiàn)中S1～S23[6]，其中YP1和YP23直接購自中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)，其余均購自國內(nèi)大中型中醫(yī)院，YP10～YP17為小包裝，其余均為普通包裝，飲片來源具有一定代表性，具體信息見表1，經(jīng)質(zhì)量檢驗(yàn)，均符合《中國藥典》2020年版一部大黃項(xiàng)下要求。

表1 大黃飲片信息Table 1 Information of decoction pieces of RRR

2 方法與結(jié)果

2.1 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑及供試品、對照品溶液制備

2.1.1 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 稱取大黃飲片100 g，置燒杯中，加7倍量純化水浸泡30 min，煮沸，保持微沸30 min，傾出藥液，4層紗布濾過；藥渣加6倍量純化水煮沸，保持微沸20 min，傾出藥液，4層紗布濾過；2次煎液合并，50 ℃下真空減壓濃縮至500 mL，與表1中飲片編號(hào)對應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑編號(hào)TJ1～TJ23。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL置于50 mL量瓶中，加50%甲醇48 mL，超聲處理30 min（功率200 W，頻率53 kHz），放冷后加50%甲醇至量瓶刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 飲片供試品溶液制備 取大黃飲片粉末（過四號(hào)篩）約0.15 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇24 mL，其余操作同“2.1.2”項(xiàng)。

2.1.4 成分鑒定用混合對照品溶液制備 取所有20個(gè)對照品適量，精密稱定，加入50%甲醇溶解，混勻，配制成質(zhì)量濃度為0.73～17.60 μg/mL混合對照品溶液。

2.1.5 含量測定用8種結(jié)合型蒽醌混合對照品溶液制備 精密稱取8個(gè)結(jié)合型蒽醌類成分對照品適量，加70%甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為12.12～96.40 μg/mL的含量測定用8種結(jié)合型蒽醌混合對照品溶液，取該混合對照品溶液分別稀釋100、20、10、2倍，配制成系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液。

2.1.6 含量測定用5種游離型蒽醌類成分混合對照品溶液制備 精密稱取5個(gè)游離型蒽醌類成分對照品適量，加甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為23.2～104.0 μg/mL的含量測定用5個(gè)游離型蒽醌類成分混合對照品溶液，其余操作同“2.1.5”項(xiàng)。

2.1.7 含量測定用5種非蒽醌類成分混合對照品溶液制備 精密稱取對照品沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、RGG適量，分別加甲醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度分別為1.232、1.870、0.509、0.832、2.300 mg/mL的5種非蒽醌類成分對照品儲(chǔ)備液；分別精密量取一定體積的5種非蒽醌類成分對照品儲(chǔ)備液，混勻，加甲醇定容，配制成以上5種對照品質(zhì)量濃度分別為61.60、374.00、76.35、83.20、115.00 μg/mL的含量測定用5種非蒽醌類成分混合對照品溶液，其余操作同“2.1.5”項(xiàng)。

2.2 指紋圖譜建立及量值傳遞分析

2.2.1 色譜條件[6,8]Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫：0～10 min，5%～30%甲醇；10～40 min，30%～60%甲醇；40～60 min，60%甲醇；60～70 min，60%～100%甲醇；70～80 min，100%甲醇；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm。

2.2.2 質(zhì)譜條件[6,8]流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度條件同“2.2.1”項(xiàng)。DuoSpray離子源，ESI電離方式，負(fù)離子模式檢測。離子源噴射電壓?4500 V，離子源溫度600 ℃，氣簾氣（CUR）241.317 kPa（35 psi），霧化氣（Gas 1）413.685 kPa（60 psi），加熱氣（Gas 2）413.685 kPa（60 psi）。采用TOFMSIDA-10MS/MS信息采集方式獲取質(zhì)譜信息，參數(shù)設(shè)置如下：一級(jí)質(zhì)譜解簇電壓（DP）?80 V，碰撞能量（CE）?10 eV，TOF-MS累計(jì)時(shí)間250 ms，母離子掃描范圍m/z115～1500；二級(jí)質(zhì)譜子離子質(zhì)譜掃描范圍m/z50～1500，碰撞能量（CE）?35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）15 eV。

2.2.3 指紋圖譜測定及對照指紋圖譜建立 取YP1～YP23、TJ1～TJ23供試品溶液測定，進(jìn)樣量均為30 μL，采用AIA格式將指紋圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》，以YP1和TJ1指紋圖譜分別作為參照譜，在使用中位數(shù)自動(dòng)匹配的基礎(chǔ)上進(jìn)行多點(diǎn)校正，生成大黃飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑對照指紋圖譜，飲片指紋圖譜標(biāo)定共有峰45個(gè)，其中除29、32、37、38和41號(hào)峰外的40個(gè)傳遞到了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，共有峰個(gè)數(shù)傳遞率為88.89%。大黃飲片和大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜及對照指紋圖譜見圖1、2。

圖1 大黃飲片 (YP1～YP23) 指紋圖譜及對照指紋圖譜 (YPR)Fig.1 Fingerprints of decoction pieces of RRR (YP1—YP23) and reference fingerprint (YPR)

2.2.4 指紋圖譜相似度評價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件（2012版）》分別對大黃飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果顯示，23批飲片指紋圖譜中YP10、YP3、YP16相似度較低，分別為0.458、0.675、0.784，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜TJ10、TJ3、TJ16相似度也較低，分別為0.584、0.762、0.835，其余批次飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度均較高。提示標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝穩(wěn)定、可行，飲片質(zhì)量較好地傳遞到了標(biāo)準(zhǔn)湯劑。見表2。

圖2 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑 (TJ1～TJ23) 指紋圖譜及對照指紋圖譜 (TJR)Fig.2 Fingerprints of standard decoction of RRR (TJ1—TJ23) and reference fingerprint (TJR)

2.2.5 共有峰鑒定 取TJ1供試品溶液采用“2.2.2”項(xiàng)下質(zhì)譜條件測定，進(jìn)樣量為20 μL，PeakView1.6質(zhì)譜分析軟件提取標(biāo)準(zhǔn)湯劑總離子流圖（圖3），根據(jù)準(zhǔn)分子離子 [M－H]?信息判斷并得到的一級(jí)質(zhì)譜精確相對分子質(zhì)量，并根據(jù)產(chǎn)生的二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息，通過與前期對照品及飲片測定數(shù)據(jù)[6]比對，對標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰進(jìn)行成分鑒定，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜色譜峰質(zhì)譜測定數(shù)據(jù)與前期測定飲片及對照品相應(yīng)保留時(shí)間色譜峰數(shù)據(jù)基本一致[6]，表明飲片指紋圖譜傳遞到標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的共有峰為同一成分，其中8個(gè)結(jié)合蒽醌（共有峰17、21、27、33～36、39）、5個(gè)游離型蒽醌（共有峰40、42～45）、2個(gè)蒽酮類成分（共有峰20、23）、5個(gè)鞣質(zhì)類成分（共有峰3、4、7、10、12）及2個(gè)二苯乙烯類成分（共有峰11、19）共計(jì)22個(gè)成分采用對照品比對確認(rèn)，其余28個(gè)共有峰的鑒定依據(jù)見本課題組前期發(fā)表的論文[6,9]。

表2 大黃飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度Table 2 Similarity of fingerprints of decoction pieces of RRR and its standard decoction

圖3 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑總離子流圖 (負(fù)離子模式)Fig.3 TIC of standard decoction of RRR (negative ion mode)

2.3 蒽醌類成分含量測定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算

2.3.1 色譜條件 測定波長430 nm，其余同“2.2.1”項(xiàng)。

2.3.2 樣品含量測定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算 提取“2.2.3”項(xiàng)下所得TJ1～TJ23的430 nm色譜圖，記錄8個(gè)結(jié)合蒽醌和5個(gè)游離蒽醌的峰面積，代入前期建立的回歸方程[6]計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分的含量。根據(jù)前期飲片含量測定結(jié)果計(jì)算13個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率。

轉(zhuǎn)移率＝wv/(WvM)[1]

w表示標(biāo)準(zhǔn)湯劑中成分的質(zhì)量濃度，v表示標(biāo)準(zhǔn)湯劑體積，W表示標(biāo)準(zhǔn)湯劑生藥質(zhì)量濃度，M表示飲片中成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

標(biāo)準(zhǔn)湯劑中13個(gè)蒽醌類成分含量測定結(jié)果見表4，轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果見表5。

2.4 非蒽醌類成分含量測定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算

2.4.1 色譜條件 同“2.2.1”項(xiàng)。

2.4.2 專屬性考察 取YP1和TJ1供試品溶液及混合對照品溶液進(jìn)樣測定，提取色譜圖。結(jié)果顯示，樣品色譜圖中5個(gè)待測成分基本能達(dá)到基線分離，見圖4。

2.4.3 線性關(guān)系考察 取5種非蒽醌系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液各10 μL，混合對照品溶液10、20、30、40 μL，進(jìn)樣測定，記錄6個(gè)成分的峰面積，以峰面積（Y）對進(jìn)樣量（X）進(jìn)行回歸處理，得5個(gè)成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)：沒食子酸回歸方程Y＝2 410 982X－36 296，r＝0.999 9，線性范圍6.16～2464 ng；兒茶素回歸方程Y＝732 349X－68 689，r＝0.999 9，線性范圍37.4～14 960 ng；表兒茶素回歸方程Y＝734 494X－4435，r＝0.999 7，線性范圍7.635～3054 ng；表兒茶素沒食子酸酯回歸方程Y＝1 596 107X－24 613，r＝0.999 9，線性范圍8.32～3328 ng；RGG回歸方程Y＝3 137 732X－85 754，r＝0.999 9，線性范圍11.5～4600 ng。

2.4.4 準(zhǔn)確度（加樣回收率）考察 精密稱定S1粉末6份，每份約0.075 g，分別精密添加“2.1.7”項(xiàng)下配制的5個(gè)對照品儲(chǔ)備液適量（各成分的添加量約等于樣品中根據(jù)回歸方程的計(jì)算量），加甲醇24 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)樣品含量測定方法測定，計(jì)算5個(gè)成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果為沒食子酸平均回收率95.05%，RSD為1.89%；兒茶素平均回收率102.99%，RSD為3.64%；表兒茶素平均回收率97.60%，RSD為4.89%；表兒茶素沒食子酸酯平均回收率97.65%，RSD為3.74%；RGG平均回收率96.51%，RSD為1.14%，符合《中國藥典》分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[10]相關(guān)要求。

2.4.5 重復(fù)性考察 精密稱定S1粉末6份，每份約0.15 g，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備成6份供試品溶液，根據(jù)樣品含量測定方法測定，計(jì)算6份供試品溶液各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD。結(jié)果沒食子酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.803 mg/g，RSD為1.147%；兒茶素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.717 mg/g，RSD為2.24%；表兒茶素平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.188 mg/g，RSD為1.88%；表兒茶素沒食子酸酯平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.191 mg/g，RSD為2.87%；RGG平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.648 mg/g，RSD為2.43%，符合《中國藥典》分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則[10]相關(guān)要求。

表3 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰Q-TOF/MS鑒定結(jié)果Table 3 Identification of common peaks in standard decoction of RRR fingerprint by Q-TOF/MS

表4 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中13個(gè)蒽醌類成分定量測定結(jié)果Table 4 Determination of 13 anthraquinones in standard decoction of RRR

表5 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑13個(gè)蒽醌類成分轉(zhuǎn)移率Table 5 Components transfer rate of 13 anthraquinones of standard decoction of RRR

續(xù)表5

圖4 大黃飲片 (A)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑 (B) 及混合對照品 (C) 的HPLC圖Fig.4 HPLC of decoction pieces of RRR (A),standard decoction of RRR (B) and mixed reference substances (C)

2.4.6 耐用性（穩(wěn)定性）考察 取YP1供試品溶液，分別于制備后0、6、12、18、24、36 h根據(jù)樣品含量測定方法測定，計(jì)算6次測定的各成分峰面積的RSD。以上5種成分的RSD分別為2.75%、2.08%、1.00%、1.41%、3.03%。

2.4.7 樣品含量測定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算 提取“2.2.3”項(xiàng)下所得YP1～YP23和TJ1～TJ23的色譜圖，記錄5個(gè)成分的峰面積，代入回歸方程計(jì)算飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分的含量。同“2.3.2”項(xiàng)下方法計(jì)算5個(gè)成分的轉(zhuǎn)移率。大黃飲片中5個(gè)非蒽醌類成分含量測定結(jié)果見表6，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中5個(gè)非蒽醌類成分含量測定結(jié)果見表7，轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果見表8。

表6 大黃飲片中5個(gè)非蒽醌類成分定量測定結(jié)果Table 6 Determination of five non-anthraquinone components in decoction pieces of RRR

表7 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中5個(gè)非蒽醌類成分定量測定結(jié)果Table 7 Determination of five non-anthraquinone components in standard decoction of RRR

2.5 標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH、出膏率測定及分析

按說明書校準(zhǔn)pH計(jì)，測定TJ1～TJ23的pH值，每份樣品重復(fù)3次，取平均值。量取23批大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑各50 mL，置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴鍋上蒸干，烘箱內(nèi)105 ℃干燥至質(zhì)量恒定，取出，干燥器內(nèi)冷卻后稱定質(zhì)量，計(jì)算出膏率（干浸膏質(zhì)量/制備50 mL標(biāo)準(zhǔn)湯劑的飲片質(zhì)量）。每批標(biāo)準(zhǔn)湯劑重復(fù)3次試驗(yàn)。結(jié)果顯示，23批標(biāo)準(zhǔn)湯劑pH在4.84～5.43，均值為5.21，高于趙曼佳等[7]報(bào)道的4.15。大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率在14.31%～28.63%，均值為23.26%，較文獻(xiàn)報(bào)道的28.2%[8]略低。出膏率允許的范圍為均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差或均值的70%～130%[2]，計(jì)算發(fā)現(xiàn)，23批大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率均在均值±3標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)，但有2批超出了均值的70%～130%。結(jié)果見表8。

表8 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑5個(gè)非蒽醌類成分轉(zhuǎn)移率及出膏率Table 8 Components transfer rate and extraction ratio of five non-anthraquinone components of standard decoction of RRR

3 討論

3.1 關(guān)于方法學(xué)考察

指紋圖方法學(xué)考察主要包括精密度試驗(yàn)（同一供試品連續(xù)進(jìn)樣5次以上，考察色譜峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值的一致性，采用HPLC法峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不得大于3%）和重現(xiàn)性試驗(yàn)（同一批號(hào)供試品5份以上，考察內(nèi)容同精密度試驗(yàn)，采用HPLC法峰面積比值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD不得大于3%）[11]。本研究指紋圖譜方法學(xué)考察及結(jié)果見前期發(fā)表論文[6]，精密度試驗(yàn)峰面積比值的RSD為2.92%，重現(xiàn)性試驗(yàn)峰面積比值的RSD為2.98%，均符合技術(shù)要求。

根據(jù)《中國藥典》四部中的通則9101（分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則）[10]，含量測定方法學(xué)考察項(xiàng)目包括專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、線性、耐用性。專屬性方面，采用色譜法要求附代表性圖譜；準(zhǔn)確度一般用回收率表示，樣品中待測成分含量范圍對應(yīng)有回收率限度要求；精密度主要以重復(fù)性體現(xiàn)，樣品中待測成分含量范圍對應(yīng)有重復(fù)性RSD要求；線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測物濃度直接呈比例關(guān)系的能力；耐用性系指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影響的承受程度，典型的變動(dòng)因素有被測溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等，液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。

盡管考察項(xiàng)目表述不符合藥典要求，13個(gè)蒽醌類成分含量測定的方法學(xué)考察參見前期發(fā)表論文[6]，且結(jié)果基本符合藥典要求，本實(shí)驗(yàn)色譜圖體現(xiàn)專屬性，回收率試驗(yàn)體現(xiàn)準(zhǔn)確度，重復(fù)性試驗(yàn)體現(xiàn)精密度，線性關(guān)系考察體現(xiàn)線性，穩(wěn)定性試驗(yàn)部分體現(xiàn)耐用性。本研究基本按藥典要求對5個(gè)非蒽醌類成分含量測定進(jìn)行了方法學(xué)考察，其中耐用性中被測溶液穩(wěn)定性考察方法及結(jié)果見“2.4.6”項(xiàng)，流動(dòng)相的組成、柱溫、體積流量等耐用性試驗(yàn)及結(jié)果見本課題組前期建立的大黃藥材中非蒽醌類成分含量測定方法[12]。

3.2 關(guān)于提取溶劑

前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃結(jié)合型蒽醌并不像大部分文獻(xiàn)報(bào)道的可溶于甲醇等有機(jī)溶劑中，70%甲醇為其合適的溶劑[13]，故8個(gè)結(jié)合型蒽醌對照品溶液的制備采用70%甲醇。趙曼佳等[7]采用離心取上清液的方法制備大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，可能會(huì)導(dǎo)致本來混懸于標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的成分流失，測出的成分含量與臨床用藥實(shí)際不符。預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了50%、70%、100%甲醇制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的效果，發(fā)現(xiàn)加入70%和100%甲醇會(huì)產(chǎn)生沉淀造成成分損失，加入50%甲醇則溶液基本澄清。

3.3 關(guān)于納入量值規(guī)律研究的成分

大黃中所含的各類化學(xué)成分具有不同的藥理活性[12,14-15]，單一組分無法對大黃及其制劑進(jìn)行全面質(zhì)量評價(jià)[16]。本研究采用Q-TOF-MS/MS對大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖40個(gè)共有峰進(jìn)行了鑒定，其中8個(gè)結(jié)合蒽醌、5個(gè)游離型蒽醌、2個(gè)蒽酮類成分、5個(gè)鞣質(zhì)類成分及2個(gè)二苯乙烯類成分共計(jì)22個(gè)成分采用對照品比對確認(rèn)，但是由圖1和圖2可見，蒽酮類成分番瀉苷B和番瀉苷A、鞣質(zhì)類成分兒茶素、二苯乙烯類成分白藜蘆醇4′-O-葡萄糖苷共計(jì)4個(gè)成分色譜峰分離度較差，不符合含量測定專屬性要求，其余18個(gè)成分均建立了含量測定方法，納入量值規(guī)律研究，特別是在同類研究納入游離型蒽醌基礎(chǔ)上，增加了結(jié)合型蒽醌。大黃中蒽醌類成分分結(jié)合型和游離型2種，其中大部分為結(jié)合型蒽醌，但由于其不穩(wěn)定導(dǎo)致提取純化比較困難，目前研究較少[9]，但近年來大黃結(jié)合型蒽醌的作用越來越受到人們的關(guān)注[9,17]，僅測定游離蒽醌不能全面反映大黃及其制劑的質(zhì)量[18]。

3.4 關(guān)于檢測波長

查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，多以280、430 nm作為大黃的檢測波長，以280 nm檢出的色譜峰較多[19]，結(jié)合蒽醌和游離蒽醌在254、430 nm附近都有吸收峰，但430 nm除蒽醌類成分外的其他成分無吸收[20]。研究過程中提取254、280、430 nm色譜圖進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)280 nm波長下檢出的色譜峰最為全面，因此選擇其作為指紋圖譜的檢測波長。

8個(gè)結(jié)合型蒽醌中AE8G、R8G、C1G和C8G分別在254、410 nm附近有最大吸收，E1G、E8G、P8G分別在280、420 nm附近有最大吸收，AE3G在254、430 nm附近有最大吸收[9]；5個(gè)游離型蒽醌中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚分別在254、430 nm附近有最大吸收，大黃素、大黃素甲醚分別在280、440 nm附近有最大吸收[17]。提取410、430 nm色譜圖比較發(fā)現(xiàn)，兩者并無較大差異，為避免其他成分的干擾，故選擇430 nm作為蒽醌類成分含量測定波長。提取5個(gè)待測非蒽醌類成分色譜峰的紫外吸收光譜圖發(fā)現(xiàn)，5個(gè)成分均在280 nm附近有最大吸收，所以選擇280 nm為非蒽醌類成分含量測定波長。

3.5 關(guān)于成分轉(zhuǎn)移率

23批大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑5個(gè)游離型蒽醌合計(jì)的轉(zhuǎn)移率為5.44%～37.95%，均值為11.03%，趙曼佳等[7]報(bào)道的10批大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相應(yīng)數(shù)據(jù)分別為11.16%～28.14%和19.87%，兩者結(jié)果差異有待分析。但總體來講，游離型蒽醌的平均轉(zhuǎn)移率偏低，其主要原因可能是游離型蒽醌苷元為脂溶性成分，在水煎液中難以溶出，已有多篇文獻(xiàn)提到標(biāo)準(zhǔn)湯劑中脂溶性成分轉(zhuǎn)移率低的問題[21]。大黃素甲醚、大黃酚和大黃素的平均轉(zhuǎn)移率分別只有1.41%、1.90%和3.66%，蘆薈大黃素為13.70%，大黃酸則相對偏高，為37.31%，可能是由于5個(gè)成分在加熱煎煮過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致大黃酸的含量比例提高[7,22-25]，計(jì)算結(jié)果顯示，23批大黃飲片中大黃酸含量的平均值占5個(gè)游離型蒽醌合計(jì)平均值的比例為24.24%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中相應(yīng)數(shù)據(jù)為81.97%，與文獻(xiàn)報(bào)道的藥材中大黃酸占游離蒽醌的比例為17.39%，而提取物中該比例提高到37.71%[22]。8個(gè)結(jié)合型蒽醌轉(zhuǎn)移率相對較高，均值在35.96%～81.74%，8個(gè)成分合計(jì)平均轉(zhuǎn)移率為44.83%，盡管這些結(jié)合型蒽醌在加熱煎煮和濃縮過程也有部分轉(zhuǎn)化成了水不溶性的游離型蒽醌[13]，但測定這些水溶性成分來計(jì)算轉(zhuǎn)移率更為合理[26]。

大黃中鞣質(zhì)類成分含量高達(dá)10%～30%[27]，本次標(biāo)定的大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜40個(gè)共有峰中17個(gè)為鞣質(zhì)類成分，大黃鞣質(zhì)分水解型和縮合型2類，單體分別為沒食子酸和兒茶素[28]，酚酸和多元醇通過苷鍵或酯鍵形成可水解鞣質(zhì)[29]。本實(shí)驗(yàn)測定的大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的4個(gè)鞣質(zhì)類成分中表兒茶素和沒食子酸平均轉(zhuǎn)移率分別高達(dá)303.18%和233.00%，表兒茶素沒食子酸酯最低，為58.71%，其原因可能為含苷鍵和酯鍵的鞣質(zhì)類成分易催化水解[29]，如有研究表明，在加熱過程中表兒茶素沒食子酸酯易水解為表兒茶素和沒食子酸[30]，這樣就導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)湯劑中表兒茶素沒食子酸酯轉(zhuǎn)移率偏低，表兒茶素和沒食子酸相對含量提高。同樣，其他結(jié)構(gòu)中含沒食子和表兒茶素結(jié)構(gòu)的以酯鍵和苷鍵鏈接的縮合物也可能水解生成表兒茶素和沒食子酸。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突