馮 莉 劉 妍 荊 麗 韓 晶 張 雪 劉義冰（河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腫瘤內科，石家莊 050011）

近年我國結直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢，位居惡性腫瘤第3，經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)發(fā)病率更高［1-2］。隨治療手段改善，系統(tǒng)的規(guī)范化診療使結直腸癌患者死亡率明顯下降，但仍有約50%患者在結直腸癌根治術后不久發(fā)生延期肝轉移。目前關于結直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉移的分子生物學機制尚未明確，一般認為其惡性生物學行為是涉及多基因、多步驟的調控過程［3-4］。細胞凋亡通路障礙是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中最重要的分子事件，誘導腫瘤細胞凋亡成為腫瘤治療的思路之一。Bcl-2家族是細胞凋亡的關鍵調節(jié)因子，Bcl-2相互作用殺傷蛋白（Bcl-2 inter?acting killer，BIK）是其中一種重要的促凋亡蛋白，作為BH3家族促凋亡蛋白的創(chuàng)始成員，通過線粒體途徑誘導細胞凋亡［5］。BIK可結合的Bcl-2家族凋亡抑制蛋白最多，且與Bcl-2及Mcl-1的結合力最強［6］。隨死亡信號刺激，BIK磷酸化后可與凋亡抑制蛋白相互作用，自主表達時強效殺傷細胞，提示BIK可能是細胞和病毒抗凋亡蛋白的重要靶點。miRNA是一類由19～25個核苷酸組成的內源性非編碼RNA，可與mRNA互補片段結合導致mRNA降解或抑制其翻譯調節(jié)基因表達，發(fā)揮細胞增殖分化及凋亡調節(jié)、影響細胞自我更新、誘導上皮細胞間質轉化等作用［7］。miR-486-3p是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，目前在結直腸癌中的研究較少，miR-486-3p對結直腸癌細胞的調控作用是否與BIK相關鮮有報道。本文研究miR-486-3p表達對結直腸癌細胞的調控作用并探討其作用機制，從分子機制水平為結直腸癌治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 結直腸癌細胞株SW620和正常結腸細胞系NCM-460購自美國模式菌種收集中心。

1.1.2 主要試劑DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰酶、Lipofectamine2000轉染試劑、Trizol試劑購自美國Invitrogen Gibco公司；miR-486-3p模擬物（miR-486-3p mimics）、miR-486-3p抑制劑（miR-486-3p inhibitor）和陰性對照（NC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；定點突變試劑盒購自美國Agilent公司；雙熒光素酶試驗系統(tǒng)購自美國Pro?mega公司；BIK siRNA、辣根過氧化物酶標記的二抗由美國Santa Cruz公司合成和化學修飾；MTT試劑、細胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）一抗、半胱天冬酶-9（Caspase-9）一抗、半胱天冬酶-3（Caspase-3）一抗、GAPDH一抗、RIPA裂解液和BCA蛋白分析試劑盒購自上海碧云天公司；Transwell小室購自美國Costar公司；結晶紫購自美國Sigma公司；Annexin VFITC/PI試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；PrimeScriptTM逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa公司；BIK一抗、APAF1一抗、p-Erk1/2一抗、Erk1/2一抗購自美國Abam公司；Su?per SignalTM化學發(fā)光底物購自美國Thermo Scientific公司。

1.1.3 主要儀器-80℃冰箱購自日本SANYO公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Precision公司；Syner?gyTM2酶標儀購自美國Bio-Tek公司；5430R型低溫離心機購自德國Eppendorf公司；FACSAria flow流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司；凝膠掃描分析系統(tǒng)購自英國Syngene公司；Step One PlusTMrealtime PCR System購自美國Applied Biosystems公司；Western blot電泳和轉膜系統(tǒng)、ChemiDoc成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR和Western blot檢測SW620細胞和NCM-460細胞miR-486-3p和BIK表達 從液氮中取出凍存細胞株，迅速復蘇后轉入培養(yǎng)瓶，采用DMEM培養(yǎng)（含10%胎牛血清）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液，當細胞生長至對數(shù)生長期時用0.25%胰酶進行消化、傳代，取第3～4代對數(shù)期細胞用于后續(xù)實驗。采用RT-PCR測定SW620細胞和NCM-460細 胞miR-486-3p和BIK mRNA表達，Western blot法測定SW620細胞和NCM-460細胞BIK蛋白表達。

1.2.2 熒光素酶報告試驗 從人cDNA中擴增BIK 3'-UTR序列，將BIK的野生型和突變3'-UTR區(qū)域克隆至pGL3 XbaⅠ位點，采用定點突變試劑盒對BIK 3'-UTR中的miR-486-3p靶位點進行位點定向突變。在轉染前將細胞接種于24孔板培養(yǎng)14～16 h，3'-UTR質粒在SW620細胞中采用Lipofectamine2000轉染試劑共轉染，轉染后24 h采用雙熒光素酶試驗系統(tǒng)進行報告試驗，將相對Renilla熒光素酶活性歸一化為螢火蟲熒光素酶活性作為轉染效率的內參。

1.2.3 細胞分組和轉染 將SW620細胞分為陰性對照組（NC）、miR-486-3p mimics組、miR-486-3p in?hibitor組和BIK siRNA組，各組SW620細胞采用Li?pofectamine2000分別轉染生理鹽水、miR-486-3p mimics、miR-486-3p inhibitor和BIK siRNA，用于后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 各組細胞轉染24 h，1.0×105個/孔接種于6孔板，采用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，20μl/孔加入MTT溶液（5 mg/ml）培養(yǎng)4 h，棄上清，150μl/孔加入DMSO，振蕩15 min，全自動酶標儀測定450 nm處吸光度（A）。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 各組細胞轉染24 h，1.0×105個/孔接種于6孔板，DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)至細胞鋪滿單層，20μl移液槍頭沿培養(yǎng)板底部垂直劃線，PBS沖洗3次去除細胞碎片，更換DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)12 h，拍照，測量劃痕間距。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲 各組細胞轉染24 h，1.0×105個/ml加入Transwell小室上室，放入含DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的細胞培養(yǎng)板孔（下室），37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，采用棉簽將上室內非遷移細胞刮除，小室底部遷移細胞用4%多聚甲醛固定，0.2%結晶紫染色，雙蒸水沖洗上室，相差顯微鏡下隨機選擇5個視野拍照、計數(shù)。

1.2.7 流失細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞轉染24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%CO2培養(yǎng)至48 h，PBS洗滌2次，3 000 r/min離心2 min，去上清，預冷結合緩沖液重懸細胞，加入An?nexin V-FITC/PI混勻，4℃避光培養(yǎng)15 min，加入10μl PI（4μg/ml，含RNA酶），避光室溫孵育15 min，F(xiàn)ACSAria流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析。

1.2.8 q-PCR檢測mRNA表達 各組細胞轉染24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5% CO2培養(yǎng)至48 h，Trizol試劑提取總RNA，異丙醇法濃縮RNA，全自動酶標儀測定總RNA純度，控制A260/A280為1.9～2.1，RNA電泳檢測完整性。檢測濃度及純度后取2μg總RNA采用逆轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。逆轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s。逆轉錄所得cDNA純化后采用Step One PlusTMreal-time PCR System進行PCR擴增，反應總體積為20μl：1.5μl cDNA模板，1μl引物，10μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，7.5μl H2O。PCR反應條件為：95℃預變性30 s，擴增循環(huán)95℃5 s，60℃34 s，共40個 循 環(huán)。以GAPDH為 內 參，2-ΔΔCt法 計 算mRNA相對表達量。

1.2.9 Western blot檢測蛋白表達 各組細胞轉染24 h，更換為含10μmol/ml Flu的RPMI1640培養(yǎng)液37℃、5%CO2培養(yǎng)至48 h，收獲各組細胞，RIPA裂解液裂解各組細胞，離心，BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后按20μg/孔進行10%SDS-PAGE凝膠電泳（90 V 30 min，120 V 1 h），濕轉至PVDF膜（400 mA 2 h），5%BSA封閉1 h，TBST緩沖液洗膜，分別加入BIK、APAF1、p-Erk1/2、Erk1/2、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3和GAPDH一抗后4℃過夜，TBST緩沖液充分洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜30 min，SuperSignalTM化學發(fā)光試劑盒顯色，顯影，測定各組細胞目標蛋白表達，與β-actin為內參。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prer軟件進行統(tǒng)計學分析，結果以±s表示，組間比較采用t檢驗或單向ANOVA分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌細胞和正常結直腸細胞miR-486-3p和BIK表達 結直腸癌細胞miR-486-3p表達水平較正常結直腸細胞（NCM-460）顯著增加（圖1A），BIK mRNA和蛋白水平均較正常結直腸細胞顯著降低（圖1B～D），提示miR-486-3p表達上調可能與結直腸癌細胞BIK表達下調有關。

圖1 結直腸癌細胞和正常結直腸細胞miR-486-3p和BIK表達Fig.1 miR-486-3p and BIK expressions in colorectal can-cer cells and normal colorectal cells

2.2 雙熒光素酶報告試驗 采用Targetscan和miR?Walk進行生物信息學分析結果顯示，BIK的3'-UTR存在與miR-486-3p種子序列匹配的區(qū)域（圖2A）。雙熒光素酶報告試驗顯示，miR-486-3p顯著降低結直腸癌細胞BIK 3'-UTR熒光素酶活性（P＜0.05），但不降低BIK 3'-UTR的突變序列（圖2B），表明BIK 3'-UTR是miR-486-3p的直接靶標。轉染miR-486-3p抑制劑導致BIK mRNA和蛋白表達顯著升高，而轉染miR-486-3p模擬導致BIK mRNA和蛋白表達顯著下調（圖2C、D），與轉染BIK siRNA結果一致。

圖2 雙熒光素酶報告試驗結果Fig.2 Dual luciferase reporter test

2.3 miR-486-3p對結腸癌細胞增殖的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組24 h、48 h和72 h結腸癌細胞光密度顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組顯著增加（P＜0.05或P＜0.01，圖3），提示miR-486-3p在結腸癌細胞增殖中發(fā)揮致癌基因作用。

圖3 miR-486-3p對結直腸癌細胞增殖的影響Fig.3 Effect of miR-486-3p on proliferation of colorectal cancer cells

2.4 miR-486-3p對結腸癌細胞遷移的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組細胞劃痕寬度顯著增加（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組細胞劃痕寬度顯著降低（P＜0.05，圖4），提示miR-486-3p可促進結腸癌細胞遷移。

圖4 miR-486-3p對結直腸癌細胞遷移的影響Fig.4 Effect of miR-486-3p on migration of colorectal cancer cells

2.5 miR-486-3p對結腸癌細胞侵襲的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組穿膜細胞數(shù)顯著減少（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組穿膜細胞數(shù)顯著增加（P＜0.05，圖5），提示miR-486-3p可促進結腸癌細胞遷移。

圖5 miR-486-3p對結直腸癌細胞侵襲的影響Fig.5 Effect of miR-486-3p on invasion of colorectal can-cer cells

2.6 miR-486-3p對結腸癌細胞凋亡的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組凋亡細胞數(shù)顯著增加（P＜0.01），而miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組凋亡細胞數(shù)顯著減少（P＜0.01，圖6），提示miR-486-3p可抑制結腸癌細胞凋亡。

圖6 miR-486-3p對結直腸癌細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of miR-486-3p on apoptosis of colorectal can-cer cells

2.7 miR-486-3p對結直腸癌細胞線粒體凋亡通路蛋白表達的影響 與NC組相比，miR-486-3p抑制劑組Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達顯著增加，p-Erk1/2蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；miR-486-3p模擬組和BIK siRNA組Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達顯著降低，p-ERK1/2蛋白表達顯著增加（P＜0.01）；4組細胞Erk1/2表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖7），提示miR-486-3p可能通過調節(jié)線粒體凋亡通路在結直腸癌發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮致癌基因作用。

圖7 miR-486-3p對結直腸癌細胞線粒體凋亡通路蛋白表達的影響Fig.7 Effect of miR-486-3p on expressions of mitochon-drial apoptosis pathway proteins in colorectal can-cer cells

3 討論

全球每年結腸癌平均新發(fā)病例超過120萬例，病死率約50%［8］。外科手術技術的發(fā)展及化療藥物的應用使結直腸癌療效顯著提高，但其發(fā)病率仍位居惡性腫瘤第3，僅次于肺癌和乳腺癌，是腫瘤相關死亡的第4大病因。我國近年結直腸癌發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢，2015年我國結直腸癌預測發(fā)病率、死亡率分別為376.3/10萬、191.0/10萬，嚴重威脅人們生命健康［2］。手術治療在結直腸癌治療中占據(jù)主要地位，但多數(shù)患者仍會出現(xiàn)局部或全身轉移，并對傳統(tǒng)化療方案耐藥［9］。最新研究表明，術前放化療根治性手術是治療局部進展性結直腸癌的有效方法，但仍有約40%患者療效較差［10］。

miRNA是一類廣泛存在于真核細胞中的內源性非編碼小RNA，參與機體多種生理過程調控，如生長發(fā)育、造血功能、細胞增殖與凋亡、器官形成、脂肪代謝等，目前人類有10%～30%基因受miRNA調節(jié)，miRNA可發(fā)揮原癌基因作用，也可發(fā)揮抑癌基因作用［11］。miRNAs可有效沉默靶基因并參與一系列基因調節(jié)過程，有利于癌癥作為一種異質性疾病治療［12］。miR-519b是一類包括miR-519a、miR-519b和miR-519c 3個miRNA的家族，目前關于miR-519b的研究鮮有報道。乳頭狀甲狀腺癌組織中miR-486-3p表達顯著升高［13］；而在喉癌組織中miR-519b-3p表達明顯低于癌旁組織，且miR-519b-3p類似物可顯著抑制喉部生長鱗狀Hep-2細胞增殖［14］。YE等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p可直接靶向ECM1而抑制宮頸癌細胞增殖和轉移。研究顯示，miR-519b-3p表達與局部進展性結直腸癌患者對術前放化療根治性手術的反應性相關，miR-519b-3p在對術前放化療根治性手術樣品相應的標本中呈高表達，miR-519b-3p以ARID4B依賴的方式直接參與直腸癌患者對術前放化療根治性手術的反應［16］。本研究顯示，結直腸癌細胞SW620 miR-486-3p表達較正常結直腸細胞NCM-460顯著增加（P＜0.05），miR-486-3p抑制劑組細胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲均較正常對照組顯著降低，而miR-486-3p模擬劑組細胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲均較正常對照組顯著增加，提示miR-486-3p是結直腸癌的致癌基因。

細胞凋亡是由基因控制的自主性有序性死亡，維護內環(huán)境穩(wěn)定、調節(jié)生長發(fā)育，凋亡失衡可能導致腫瘤及神經(jīng)退行性疾病。線粒體是細胞凋亡的主要發(fā)起者和執(zhí)行者，主要由Bcl-2家族成員調節(jié)。Bcl-2家族成員在細胞凋亡調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用，由促凋亡和抗凋亡成員組成，其共同特點是均含有BH3結構域。BIK是一種僅含有BH3結構域的促凋亡蛋白，其活性受Thr33和Thr35磷酸化程度調節(jié)。伴隨死亡信號刺激，BIK磷酸化后可與抗凋亡蛋白結合，促使其他促凋亡蛋白直接激活Bax，Bax移位至線粒體并形成同源二聚體通道，促進Cyt C釋放，導致Caspase蛋白激活和細胞凋亡［6］。3'-UTR克隆可用于miRNA靶標驗證、預測靶標功能驗證和miR?NA對靶標調控作用的研究。miRNA通過靶向mRNA 3'-UTR導致mRNA降解或抑制其翻譯調節(jié)基因表達［17］。BIK 3′-UTR包含與miR-486-3p種子序列匹配的區(qū)域，雙熒光素酶報告試驗顯示miR-486-3p顯著降低結直腸癌細胞中BIK 3′-UTR熒光素酶活性，但不降低BIK 3′-UTR突變序列，表明BIK 3′-UTR是miR-486-3p的直接靶標。miR-486-3p模擬劑組和BIK siRNA組細胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲較正常對照組顯著增加，進一步說明miR-486-3p通過BIK直接發(fā)揮對結直腸癌細胞增殖、增殖、凋亡、遷移和侵襲的調節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中存在細胞凋亡調節(jié)失調和細胞死亡基因調控異常，線粒體凋亡通路是細胞凋亡最重要和研究最為深入的途徑之一，細胞受凋亡刺激后Cyt C從線粒體內釋出是線粒體步入凋亡途徑的標志。Cyt C釋放至胞漿導致APAF1活化，誘導凋亡的半胱天冬酶活化［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p表達上調可顯著抑制Cyt C、APAF1、Caspase-9和Caspase-3表達，增加p-ERK1/2表達，揭示miR-486-3p調節(jié)結直腸癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的分子機制。