王楠楠 王 婧 劉嗣同 武 昕（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科，沈陽 110000）

外陰硬化性苔蘚（vulvar sclerosing lichen，VLS）是婦科常見的一種慢性難治性疾病，表現(xiàn)為女性外陰瘙癢、皮膚色素脫失、萎縮，嚴重者出現(xiàn)尿道口和陰道口狹窄，惡變率為2%～4%［1］。目前病因和發(fā)病機制尚不清楚，可能與自身免疫、感染、性激素和遺傳有關，也沒有較好的治療方法。因此，探討VLS發(fā)病機制是臨床上亟待解決的問題。因其真皮內可見大量的淋巴細胞和漿細胞浸潤，故多數學者認為它是一種與自身免疫有關的疾病［1］。前期研究發(fā)現(xiàn)VLS中促炎因子干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α和白介素-1，2等明顯增多，而抗炎因子研究較少（IL-10）在VLS中表達情況尚未見報道［2-3］。Toll樣受體（TLR）是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁，TLR廣泛分布于多種細胞表面，其中TLR-2表達范圍最廣，TLR-2主要存在淋巴細胞、漿細胞和樹突狀細胞表面，TLR-2通過影響T輔助細胞1（T helper cell1，Th1）和T輔助細胞2（T helper cell 2，Th2）的平衡，引起IFN-γ分泌降低，IL-10分泌相對升高，來抑制免疫反應［4-5］。前期本課題組檢測到淋巴細胞CD4、CD8在VLS中真皮層明顯增多，而樹突狀細胞在VLS形成和發(fā)展作用如何？TLR2和IL-10是否表達異常，與病變關系如何？目前尚不清楚，因此，本研究探討TLR2、IL-10 mRNA和樹突狀細胞在VLS病變形成中作用。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2016至2018年在中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦科手術或活檢的VLS標本50例（早期和進展期各25例），外陰正常皮膚（源于外陰整形手術切除的正常組織）15例。部分福爾馬林溶液固定用于免疫組化實驗；部分新鮮標本-80℃保存，用于PCR實驗。所有標本診斷均經2位病理醫(yī)生證實。本研究已通過中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人CD1α單克隆抗體、通用S-P超敏試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；miRNeasy Mini Kit試劑盒（德國Qiagen公司）；β-actin、IL-10、TLR2引物（美國Invitrogen公司）；A5001反轉錄試劑盒及A6001 Real Time PCR試劑盒（美國Pro?mega公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測4μm石蠟切片，脫蠟至水，枸櫞酸緩沖液熱抗原修復，采用免疫組織化學S-P法對CD1α細胞進行染色。滴加過氧化物酶阻斷溶液（試劑A）室溫下孵育10 min，正常非免疫動物血清（試劑B）室溫下孵育20 min，再加一抗（CD1α單抗1∶100），37℃孵育1 h，生物素標記的二抗（試劑C）室溫下孵育30 min，鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（試劑D）室溫下孵育30 min，DAB呈色后蘇木素復染。以PBS代替一抗作陰性對照。切片脫水后封片保存。

1.2.2 PCR檢測

1.2.2.1 總RNA的提取 使用miRneasy Mini Kit試劑盒抽提全部30例標本組織RNA，操作按說明書進行，RNA樣品保存于-80℃冰箱。

1.2.2.2 RNA的逆轉錄 ①取一定量模板RNA加入引物。②模板RNA與引物的混合物，70℃、5 min預變性，完成后取出置于冰上。③配置RT-Mix，向每個樣品管加入10μl RT-Mix，見表1。④設置反轉錄程序，包括退火（25℃，5 min）、延伸（42℃，60 min）、逆轉錄酶失活（70℃，15 min）三步。程序完成后得到cDNA，并存于-20℃冰箱，（按照promega A5001試劑說明書操作）。

表1 RT-Mix具體配置方法Tab.1 Specific configuration method of RT-Mix

1.2.2.3 RT-PCR（按照promega A6001試劑說明書操作）①按表2配置PCR反應混合液，并分至各反應管，然后加入2μl模板。②反應體系加入96孔板，加蓋光學封口膜，離心后放入ABI 7900HT熒光定量PCR儀，PCR反應條件為：95℃2 min，95℃15 s，60℃60 s，40個循環(huán)，實驗重復3次。③完成RTPCR后對其溶解曲線進行分析，并結合瓊脂糖分析PCR產物是否特異。分析PCR反應曲線，所得出的數據按2-ΔΔCT法計算出基因表達的相對量。本實驗涉及的引物，β-actin由Invitrogen公司設計，具體引物如下，見表3。

表2 PCR反應混合液具體配置方法Tab.2 Specific configuration method of PCR reaction mixture

表3 引物列表Tab.3 List of primers

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0版軟件進行統(tǒng)計數據的分析，實驗數據用±s表示，統(tǒng)計學方法采用t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD1α陽性細胞在VLS中的表達CD1α陽性細胞光鏡下：在正常皮膚中平均（14.0±5.8）個，在早期VLS中平均（18.4±7.7）個，兩者無統(tǒng)計學上差異（P＞0.05）。在進展期VLS中平均（28.6±3.2）個，與正常相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、圖1。

表4 CD1α陽性細胞在VLS中的表達（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

表4 CD1α陽性細胞在VLS中的表達（±s）Tab.4 Expression of CD1αpositive cells in VLS（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

Number 14.0±5.8 18.4±7.7 28.6±3.21）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS n 15 25 25

圖1 CD1α陽性細胞在VLS中的表達Fig.1 Expression of CD1α-positive cells in VLS

2.2 TLR2、IL-10 mRNA在VLS中的表達TLR2的mRNA表達量在早期VLS為1.34±1.27，與正常皮膚（1.65±0.84）相比無統(tǒng)計學上差異（P＞0.05）。但在進展期為3.97±0.79，與正常相比有統(tǒng)計學意義上的差異（P＜0.05）。IL-10的mRNA表達量在早期VLS中為1.09±0.89，與正常皮膚（1.08±0.36）相比無統(tǒng)計學上差異（P＞0.05）。在進展期VLS為2.93±1.04，與正常相比有統(tǒng)計學意義上的差異（P＜0.05，見表5）。

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對表達量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

表5 TLR2和IL-10 mRNA的相對表達量（±s）Tab.5 Relative expressions levels of TLR2 and IL-10 mRNA（±s）

Note：Compared with healthy vulvar skin，1）P＜0.05.

IL-10 1.08±0.36 1.09±0.89 2.93±1.041）Groups Healthy vulvar skin Early VLS Advanced VLS TLR2 1.65±0.84 1.34±1.27 3.97±0.79

3 討論

目前病理學上將VLS分為兩種類型：早期和進展期。早期可見棘層輕度不規(guī)則的增厚，真皮淺層水腫，大量的淋巴細胞浸潤，無明顯的均質帶；進展期可見表皮角質層增厚，棘層細胞減少，基底細胞液化，真皮淺層膠原纖維變性形成均質帶，其下伴有大量的淋巴細胞和漿細胞浸潤［6］。兩種病理改變是否存在一個演變的過程，形成機制是否相同，尚不清楚。TLR屬于廣泛模式識別受體，是連接固有免疫與適應性免疫的橋梁。TLR廣泛分布于多種細胞表面，但主要表達于和宿主防御功能有關的細胞，如單核巨噬細胞、粒細胞、樹突狀細胞、淋巴細胞等。TLR識別內外源性配體后可激活多種信號轉導途徑，促進細胞因子產生，調節(jié)機體免疫應答［7］。TLR中TLR2表達范圍最廣，其胞外段可識別病原危險相關分子模式（PAMPS/DAMPS）分子。通過跨膜結構將信號轉入細胞內，經由髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴信號傳導途徑和MyD88非依賴信號轉導途徑產生復雜的級聯(lián)信號反應導致核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等轉錄因子活化，介導細胞因子的分泌，參與免疫調節(jié)和誘導后天免疫功能的啟動。TLR2通過影響Th1和Th2的平衡，引起INFγ分泌的降低，IL-10分泌的相對升高，來抑制免疫反應［4］。激活TLR-2可以促進T細胞產生TLR-2依賴的IL-10，并促進Treg細胞生成［8］。文獻報道TLR2/TLR1異質二聚體是CD4+T細胞上的一種協(xié)同調控受體，在本課題組前期實驗中已檢測出CD45RO+T細胞（記憶性CD4+T細胞）在VLS中表達增加，且進展期增加更明顯［7］。提示增多的CD4+T細胞表面的TLR2可能也增加，導致IL-10分泌增多。本研究的結果顯示VLS早期TLR2和IL-10 mRNA表達略增加，與正常外陰皮膚相比無統(tǒng)計學上的差異；而進展期TLR2和IL-10 mRNA表達明顯高于正常，有統(tǒng)計學上差異。提示進展期TLR2和IL-10 mRNA增加與CD4+T細胞增加有一定相關性。樹突狀細胞是皮膚中一種抗原提呈細胞，是啟動、調控和維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)，可通過TLR-2通路被激活，從而釋放一些細胞因子如IL-10和TGF-β等。活化的樹突狀細胞極化Th0細胞至Treg細胞，顯示樹突狀細胞中TLR-2依賴的免疫調節(jié)功能［9］。本研究發(fā)現(xiàn)CD1α標記的樹突狀細胞在VLS中表達增加，早期沒有統(tǒng)計學上差異，進展期增加明顯，有統(tǒng)計學意義。與TLR2和IL-10 mRNA在VLS中表達增加呈正相關，進一步證實進展期TLR2和IL-10 mRNA增加與樹突狀細胞增多有一定的相關性。還有文獻報道：TLR2與巨噬細胞的結合被發(fā)現(xiàn)可以介導IL-10的產生［9］。本課題組前期實驗中還檢測到VLS中CD68+細胞（巨噬細胞）增多，進展期增加更明顯，與早期相比有統(tǒng)計學上的差異［8］。本研究中TLR2和IL-10 mRNA在進展期也增高，進一步提示TLR2和IL-10 mRNA增加與巨噬細胞增多有一定相關性。綜上所述，在VLS進展期CD4淋巴細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞的增加，可能促使其表面活化的TLR2增多，因此，以上細胞產生的IL-10增加。IL-10是體內重要的炎癥反應抑制因子，通過下調TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ等細胞因子及單核巨噬細胞上MHCⅡ類分子的表達，控制炎癥反應的強度及抑制免疫反應［10-11］。IL-10是CD4+CD25+Treg細胞的重要免疫調節(jié)因子，誘導CD4+CD25+Treg細胞增多，抑制免疫反應，在VLS的早期IL-10無明顯增加，而進展期IL-10明顯增多，與TLR2及其相關細胞增多有相關性［12］。進一步提示在VLS進展期存在免疫抑制現(xiàn)象。