魏姍姍 閆 璐 邱賢文 賴 寬 米向斌 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科廣州510280

紅斑狼瘡(lupus erythematosus,LE)是一種自身免疫性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚不清楚,主要分為盤狀紅斑狼瘡(discoid lupus erythematosus,DLE)、亞急性皮膚型LE和系統(tǒng)性LE,其中DLE是較常見的類型,占皮膚型LE的50%～85%。DLE病因不明,可能與免疫學(xué)改變、遺傳、紫外線照射等多種因素相關(guān),主要表現(xiàn)為頭面、頸部等出現(xiàn)邊界清楚的盤狀紅斑或斑塊,伴輕度瘙癢,部分患者可出現(xiàn)輕度關(guān)節(jié)疼痛及光過敏等癥狀[1]。目前臨床上多采用糖皮質(zhì)激素、抗瘧藥等對(duì)癥治療,雖然取得了一定療效,但仍存在皮膚黏膜萎縮、感染和復(fù)發(fā)等風(fēng)險(xiǎn),影響患者免疫功能、外觀和生活質(zhì)量,極少數(shù)患者演變?yōu)槠渌つw惡性腫瘤[2]。隨著高通量研究方法的應(yīng)用,高通量數(shù)據(jù)分析及信息篩選成為重要研究手段[3]。本文通過挖掘NCBI的基因表達(dá)匯編(gene expression omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫中DLE的基因芯片數(shù)據(jù)(GSE81071),將微陣列技術(shù)與生物信息學(xué)分析相結(jié)合,篩選差異表達(dá)基因(differential expressed genes,DEGs),采用DAVID、STRING、CIBERSORT等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行DLE相關(guān)DEGs的功能富集分析、信號(hào)通路分析及核心基因識(shí)別[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)DLE發(fā)病與局部免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān),傳統(tǒng)的DEGs研究方法側(cè)重于單個(gè)基因,本文首次采用CIBERSORT對(duì)其進(jìn)行22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,旨在更深入地了解DLE的發(fā)病機(jī)制,為尋找其治療靶點(diǎn)和預(yù)防新方案提供方向。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) 從GEO數(shù)據(jù)庫GSE81071獲取數(shù)據(jù)集,基于GPL19983平臺(tái)([HuGene-2_1-st]Affymetrix Human Gene 2.1 ST Array),由Berthier CC等提交,包括60個(gè)樣本,其中DLE皮膚組織47例和正常皮膚組織13例。

1.2 DEGs篩選 采用R語言對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、匯總和探針質(zhì)量控制,下載注釋包進(jìn)行ID轉(zhuǎn)換,提取表達(dá)矩陣,加載limma包,以P＜0.05、|logFC|＞1.5為標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs,繪制熱圖和火山圖。

1.3 功能富集分析 采用DAVID在線工具對(duì)DEGs進(jìn)行功能富集分析,上傳DEGs至列表后,得到生物學(xué)過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)及KEGG通路的富集分析結(jié)果。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建DEGs相應(yīng)PPI,綜合得分＞0.7的蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用生物信息學(xué)繪圖軟件Cytoscape(3.7.2)中的CytoHubba插件計(jì)算各蛋白節(jié)點(diǎn)的連接程度并進(jìn)行多種算法評(píng)分,采用5種算法篩選核心基因[5-6]。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)矩陣分析 采用R軟件和CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)及其提供的22種免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征矩陣得到DLE表達(dá)譜矩陣[7]。對(duì)其進(jìn)行1 000次模擬計(jì)算,獲得22種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分布。篩選P＜0.05的樣本進(jìn)行后續(xù)分析。

2 結(jié)果

2.1 DEGs篩選 共篩選出214個(gè)DEGs,其中上調(diào)基因178個(gè),下調(diào)基因36個(gè)。采用R語言繪制熱圖,見圖1。

2.2 GO功能富集和KEGG通路分析 GO分析顯示,DEGs主要富集的BP:免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)、對(duì)其他生物的防御反應(yīng)和對(duì)外界生物刺激的反應(yīng)；主要富集的CC:細(xì)胞膜外側(cè)面、膜側(cè)、細(xì)胞表面、循環(huán)系統(tǒng)免疫球蛋白復(fù)合物和血液微粒；主要富集的MF:dsRNA結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性、趨化因子活性和CXCR3趨化因子受體結(jié)合,見表1。

KEGG分析顯示,DEGs主要富集于麻疹、甲型流感病毒、單純皰疹感染、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、丙型肝炎和Toll樣受體信號(hào)通路,見表1。

圖1 DEGs熱圖Fig.1 Heatmap of DEGs

2.3 PPI分析 共篩選115個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白,499條邊,綜合得分＞0.7,P＜1.0E-16,采用5種算法對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行計(jì)算與篩選,選取各算法前10位基因,見表2。采用韋恩圖取5種算法結(jié)果交集,最終篩選出STAT1和OAS1 2個(gè)核心基因,STAT1網(wǎng)絡(luò)結(jié)節(jié)點(diǎn)數(shù)為32,OAS1網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為31,均＞30,說明2個(gè)基因在PPI網(wǎng)絡(luò)中與其他基因的聯(lián)系更強(qiáng),因此較其他基因可能發(fā)揮更關(guān)鍵的作用。

2.4 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分布 通過CIBERSORT反卷積法計(jì)算并最終得到48個(gè)可信樣本,見圖2A,左邊5個(gè)為正常組,其余43個(gè)為DLE組。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),M0型巨噬細(xì)胞在各組織中均不表達(dá)。圖2B(左邊5個(gè)為正常組,其余43個(gè)為DLE組)進(jìn)一步展示了22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例(對(duì)應(yīng)顏色模塊大小表示占總免疫細(xì)胞比例),其中活化的NK細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞在兩組中占總免疫細(xì)胞的比例均較高。

2.5 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)差異分析顯示,活化的CD4+記憶T細(xì)胞(P=0.014)、M1型巨噬細(xì)胞(P=0.005)在DLE中表達(dá)顯著上升,而活化的DCs表達(dá)顯著降低,見圖3。

表1 DEGs GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果Tab.1 GO enrichment and KEGG pathway analysis results of DEGs

表2 5種算法獲得的排名前10的核心基因Tab.2 Top 10 hub genes from five centrality methods

圖2 DLE及正常組皮膚組織中免疫相關(guān)細(xì)胞的浸潤(rùn)組成Fig.2 Infiltration composition of immune-associated cells in DLE and normal skin tissues

圖3 DLE組與正常組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析Fig.3 Infiltration analysis of immune cells in DLE group and normal group

3 討論

隨著高通量芯片技術(shù)的應(yīng)用,生物信息學(xué)方法可以更加快速、高效地篩選出與疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制相關(guān)的核心基因,為疾病的診斷、治療及新藥物設(shè)計(jì)提供了依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于細(xì)胞膜外側(cè)面、膜側(cè)和細(xì)胞表面中,通過調(diào)節(jié)dsRNA結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合與活性等參與免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)等BP,與DLE的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn),DLE皮損區(qū)炎癥細(xì)胞因子(如IL-1、IFN-γ、IL-6)及細(xì)胞內(nèi)黏附分子、趨化因子高表達(dá),促進(jìn)免疫細(xì)胞募集至皮膚[9]。KEGG信號(hào)通路分析顯示,DEGs主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等信號(hào)通路。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路中表皮巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和其他細(xì)胞相互作用產(chǎn)生IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-17等多種細(xì)胞因子和趨化因子,通過多種途徑放大炎癥因子效應(yīng),導(dǎo)致固有免疫和適應(yīng)性免疫相互干擾,參與DLE發(fā)生發(fā)展[9-10]。Toll樣受體信號(hào)通路中,Toll樣受體通過巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞對(duì)先天性和后天性免疫應(yīng)答起重要作用,研究表明DLE可通過Toll樣受體通路促進(jìn)功能性CD11c+NK等新興淋巴細(xì)胞生成引發(fā)強(qiáng)大的先天免疫應(yīng)答[11]。

目前關(guān)于麻疹和LE的研究較少,部分報(bào)道稱麻疹患者LE發(fā)病率較健康對(duì)照組提高,但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究[12]。研究顯示,與對(duì)照組相比,狼瘡小鼠在甲型流感病毒急性感染過程中產(chǎn)生更多的特異性T細(xì)胞,雖然感染期間不會(huì)加快疾病進(jìn)展,但病毒清除后持續(xù)的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致病情加重[13]。

本研究采用5種算法計(jì)算取交集得到2個(gè)核心基因,其中OAS1又稱寡腺苷酸合成酶1,可被dsRNA激活作用于寡聚化ATP酶調(diào)節(jié)2′-5′-寡腺苷酸合成酶活性。OAS1是IFN的調(diào)控基因,可通過調(diào)控IFN活性而在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體、病毒感染等通路中發(fā)揮重要作用。STAT1是一種可與DNA結(jié)合的蛋白家族,可通過調(diào)控及反調(diào)控多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子起免疫調(diào)節(jié)作用。既往研究表明,IFN-α、dsRNA可激活JAK1-STAT1通路調(diào)控LE患者T、B細(xì)胞活化、抗體分泌、自噬等。靶向JAK/STAT蛋白可同時(shí)抑制多種細(xì)胞因子(如IFN-α、IFN-γ)治療LE[14]。此外,CHONG等[15]在DLE患者皮膚組織中發(fā)現(xiàn)STAT1表達(dá)升高,且與巨噬細(xì)胞功能和活性相關(guān)。

綜上可知,DEGs與免疫應(yīng)答、固有免疫應(yīng)答、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子等密切相關(guān),研究證實(shí)表皮中的T細(xì)胞、活化的DCs、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和其他細(xì)胞相互作用產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子與DLE進(jìn)展密切相關(guān)[9-10]。本研究采用CIBERSORT對(duì)DLE皮膚組織中的22種免疫細(xì)胞進(jìn)行浸潤(rùn)分析。CIBERSORT被稱為計(jì)算機(jī)流式細(xì)胞術(shù),是一種新興的基因表達(dá)譜分析方法,反卷積算法輸入模式化的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)矩陣可重建組織測(cè)序中各種原始細(xì)胞類型和數(shù)量,已成功應(yīng)用于癌癥和癌旁組織免疫細(xì)胞浸潤(rùn)狀態(tài)分析,揭示腫瘤異質(zhì)性對(duì)癌癥的影響[7,16]。本研究首次將CIBERSORT應(yīng)用于DLE皮膚組織的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析,相比于正常組織,DLE組織活化的CD4+記憶T細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增加,而活化的DCs明顯減少。LE患者血液系統(tǒng)和DLE皮膚組織中,CD4+、CD8+記憶及效應(yīng)T細(xì)胞比例均較正常組升高,DLE患者局部皮膚微環(huán)境TGF-β、IL-2、IL-17等炎癥因子可提高CD4+記憶T細(xì)胞比例和增殖活化,但由于活化性CD4+記憶T細(xì)胞獲取困難,在DLE中的報(bào)道較少[8]。M1型巨噬細(xì)胞是可高效呈遞抗原的iNOS表型特征分子,可分泌IL-1β、IL-10、TNFα等多種細(xì)胞因子,在LE發(fā)病過程中具有重要作用[17]。M1和M2型巨噬細(xì)胞可由局部免疫刺激和病原體作用而極化,如Toll樣受體和IFN-γ可誘導(dǎo)M1極化,而IL-4/IL-13、免疫復(fù)合物(M2b)、IL-10可誘導(dǎo)M2極化[18]。M1/M2的極化狀態(tài)和相互作用與機(jī)體通路、細(xì)胞因子相關(guān),DLE DEGs主要通過病毒防御和Toll樣受體信號(hào)通路影響DLE發(fā)展,同時(shí)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M2型向M1型極化。DCs是目前功能最為強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞,在LE患者中的增殖活化存在爭(zhēng)議,最近一項(xiàng)單細(xì)胞組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),LE患者血液系統(tǒng)中DCs數(shù)顯著多于對(duì)照組,且與疾病活動(dòng)度相關(guān)；但也有報(bào)道稱LE患者血液系統(tǒng)中DCs比例顯著降低,且漿細(xì)胞樣DCs與LE疾病活動(dòng)及狼瘡腎損傷相關(guān)[19-20]。MéNDEZREGUERA等[21]研究發(fā)現(xiàn),DLE患者皮膚組織中傳統(tǒng)DCs增加,且低表達(dá)PD-L1和高表達(dá)CCR6。本研究通過免疫細(xì)胞浸潤(rùn)研究發(fā)現(xiàn)DLE患者皮膚組織中活化的DCs較正常組減少,其具體機(jī)制尚不清楚,可能由于表皮中活化的CD4+記憶T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)DCs凋亡,或分泌的細(xì)胞因子抑制DCs產(chǎn)生、成熟和聚集。

綜上所述,本研究采用多種生物信息學(xué)方法探討了DLE可能的發(fā)病機(jī)制,DEGs主要通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、病毒防御等調(diào)控局部炎癥反應(yīng),進(jìn)而作用于M1巨噬細(xì)胞和活化的CD4+記憶T細(xì)胞和DCs參與DLE發(fā)生發(fā)展。本研究篩選出的2個(gè)核心基因STAT1、OAS1和3個(gè)免疫細(xì)胞,后續(xù)將采用前瞻性大樣本研究進(jìn)一步篩查DLE的高靈敏性、特異性的診斷標(biāo)記物以減少創(chuàng)傷性檢查,為DLE的早期診斷和靶向藥物研究提供參考。