梅 剛, 易平貴, 李 慶, 張志于, 彭文宇, 李玉茹, 徐合意

(湖南科技大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 理論有機(jī)化學(xué)與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 精細(xì)聚合物可控制備及功能應(yīng)用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 分子構(gòu)效關(guān)系湖南省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 湘潭 411201)

F?RSTER于1948年首先發(fā)現(xiàn)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET), 因此又可稱(chēng)之為 F?RSTER能量轉(zhuǎn)移, 作為一種無(wú)輻射的能量轉(zhuǎn)換方式, 能量供體(Donor)將其激發(fā)態(tài)的能量, 采用分子之間的電偶極相互作用的方式, 傳遞給對(duì)應(yīng)的能量受體(Acceptor)[1]。 當(dāng)供體在能量發(fā)生轉(zhuǎn)換后, 其本身的熒光強(qiáng)度會(huì)出現(xiàn)一定程度的消退, 對(duì)應(yīng)的是受體熒光被激發(fā)。 兩個(gè)分子之間要發(fā)生共振能量遷移, 其首要條件是要求二者之間達(dá)到能級(jí)匹配, 即兩個(gè)分子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)的能級(jí)差需要基本相等[2]。 直觀地看, 這種分子間能量匹配, 就是一分子的發(fā)射光譜必須和另一分子的吸收光譜在給定條件下能夠發(fā)生一定程度的重疊[3]。 近年來(lái), 隨著FRET在各領(lǐng)域研究的深入, 選擇合適高效的FRET體系,擴(kuò)大FRET的進(jìn)一步應(yīng)用, 有關(guān)其轉(zhuǎn)移機(jī)制與規(guī)律的研究被普遍關(guān)注, FRET在化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[4]。

作為近年來(lái)被廣泛應(yīng)用和不斷推新的重要熒光發(fā)生物質(zhì)之一, 卟啉及衍生物具有較大的STOKES位移、 較高的熒光量子產(chǎn)率、 較大的摩爾消光系數(shù)等一系列優(yōu)異的性能[5], 同時(shí)通過(guò)對(duì)它們的熒光團(tuán)中心骨架進(jìn)行相應(yīng)的修飾可獲得熒光性能不同的新穎衍生物, 這些優(yōu)點(diǎn)大大擴(kuò)展了它們的應(yīng)用[6]。 此外, 卟啉及其衍生物的制備途徑多樣, 能夠有效的篩選出合適的受體, 為研究的有效開(kāi)展提供了先決條件。

化合物2-(2-氨基苯基)苯并噻唑(APBT)是一類(lèi)斯托克斯位移大、熒光量子產(chǎn)率高[7]的熒光分子, 具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射能力[8], 廣泛應(yīng)用于熒光生物成像、熒光分子探針和發(fā)光材料[9]等領(lǐng)域, 這類(lèi)化合物分子還具有較好的可極化性, 對(duì)外部環(huán)境響應(yīng)敏感、光譜所能夠感應(yīng)的區(qū)間能夠較大程度地偏向長(zhǎng)波區(qū)域[10], 是探究有機(jī)發(fā)光材料的重要模型物質(zhì)。

選擇適當(dāng)?shù)姆肿訕蜴湆⒉煌阅軣晒鈭F(tuán), 如卟啉、氟吡咯硼、苯并咪唑等連接在一起以形成發(fā)光波長(zhǎng)寬、強(qiáng)度可調(diào)的二元或多元等發(fā)光分子, 是目前發(fā)光功能分子與材料的重要研究?jī)?nèi)容, 其作用機(jī)制通常涉及到FRET。 本文將以5,10,15,20-四苯基卟啉(TPP)及其鋅離子配合物ZnTPP為熒光團(tuán), 研究它們與APBT熒光團(tuán)之間的相互作用及其可能的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制與規(guī)律, 以期為構(gòu)建它們的二元熒光化合物提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruka AVII 500MHz核磁共振波譜儀(BRUKA, 德國(guó)), UV-2501PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SHIMADZU, 日本), 6120LC/MS型質(zhì)譜儀(AGILENT, 美國(guó)), FLS920穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜儀(EDINBURGH, 英國(guó))。

TPP、ZnTPP、APBT根據(jù)文獻(xiàn)[11-13]合成并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程用到的試劑純度均達(dá)到分析純。

圖1 化合物TPP、ZnTPP和APBT分子的結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structures of compound TPP, ZnTPP and APBT

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儲(chǔ)備液的制備

分別配制了濃度為1.0×10-3mol/L的APBT、TPP和ZnTPP四氫呋喃儲(chǔ)備液。

1.2.2 光譜測(cè)試

用移液槍分別量取APBT和TPP的儲(chǔ)備液, 用四氫呋喃將其稀釋成1.0×10-5mol/L的待測(cè)液, 室溫下分別測(cè)定紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。對(duì)APBT與ZnTPP所構(gòu)成的體系進(jìn)行相同的操作。

2 結(jié)果與討論

2.1 FRET體系的構(gòu)建

2.1.1 TPP和ZnTPP的電子光譜

圖2(a)和(b)分別給出了在四氫呋喃溶液中, TPP和ZnTPP室溫下的吸收光譜和發(fā)射光譜。 可以看出, 在吸收光譜中, TPP存在有1個(gè)Soret帶和4個(gè)Q帶, 當(dāng)形成ZnTPP后, Soret帶從417 nm紅移至423 nm, 而Q帶的QⅠ、QⅣ帶消失。Q帶的部分消失歸因于配合物的形成使分子對(duì)稱(chēng)性由TPP的D2h增至ZnTPP的D4h而引起的能級(jí)簡(jiǎn)并, 同時(shí)也增加了卟啉環(huán)π電子的離域性[14-15]和分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性, 降低了π→π*躍遷的能級(jí)差。圖2(b)的結(jié)果表明, 波長(zhǎng)為400 nm的激發(fā)光均可使TPP與ZnTPP產(chǎn)生形狀結(jié)構(gòu)形狀相似的二重峰熒光發(fā)射光譜, 但強(qiáng)度與峰位有別, 它們分別對(duì)應(yīng)于分子激發(fā)態(tài)S2和S1向基態(tài)的π電子躍遷。 TPP的強(qiáng)發(fā)射峰為647 nm, 弱發(fā)射峰位于714 nm; 鋅離子的配位作用, 使配體TPP的兩個(gè)發(fā)射峰分別藍(lán)移至597 nm和650 nm, 且前者的強(qiáng)度減弱, 后者的強(qiáng)度增加。 ZnTPP熒光發(fā)射峰藍(lán)移且主峰的強(qiáng)度低于TPP, 可能是Zn2+的3d軌道改變了配合物中卟啉環(huán)電子云密度而降低了電子躍遷幾率, 同時(shí)也因過(guò)渡金屬重原子效應(yīng)引起電子自旋-軌道偶合作用, 增大了各激發(fā)態(tài)的系間竄越, 單重激發(fā)態(tài)分子通過(guò)能量?jī)?nèi)轉(zhuǎn)換而部分失活, 降低了單重激發(fā)態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定性，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。

圖2 TPP與ZnTPP的光譜圖 (a) 吸收光譜;(b) 發(fā)射光譜Fig.2 Spectra of TPP and ZnTPP (a)Adsorption spectra;(a)Emission spectra

2.1.2 FRET體系的構(gòu)建

形成FRET體系的前提就是能量供體分子的發(fā)射光譜與能量受體分子的吸收光譜在給定條件下能夠發(fā)生一定程度的重疊。 圖3(a)和(b)分別同時(shí)繪出了APBT的歸一化熒光發(fā)射光譜與TPP和ZnTPP吸收光譜圖。 顯然, 兩圖中的發(fā)射光譜與吸收光譜有較大程度的重疊, 因而APBT可作為能量供體分子分別與作為能量供體的TPP及ZnTPP, 構(gòu)建相應(yīng)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系。

圖3 APBT發(fā)射光譜與TPP及ZnTPP吸收光譜重疊圖(a) TPP;(b) ZnTPPFig.3 Overlap between emission of APBT and absorption spectrum of TPP or ZnTPP (a) TPP;(b) ZnTPP

2.2 供體與受體濃度對(duì)FRET體系的影響

2.2.1 APBT與TPP的濃度對(duì)其FRET體系的影響

在FRET系統(tǒng)中, 供體與受體的濃度變化對(duì)其有較大的影響。 為研究供體濃度變化對(duì)FRET體系的作用, 固定受體TPP的濃度為1.0×10-5mol/L, 以供體APBT對(duì)其進(jìn)行熒光滴定, 供體濃度分別達(dá)到0、0.1×10-5、0.2×10-5、0.3×10-5、0.4×10-5和0.5×10-5mol/L, 相應(yīng)結(jié)果示于圖4(a)。 從圖可以看出, APBT僅有450 nm處的熒光發(fā)射峰, TPP的二重?zé)晒獍l(fā)射峰分別位于647和714 nm, 滴定過(guò)程中供體自身的熒光峰不會(huì)干擾的受體的熒光。 隨著APBT濃度的增加, 其自身熒光強(qiáng)度增加的同時(shí), TPP的熒光強(qiáng)度也不斷增加, 并最終達(dá)到飽和狀態(tài)。同樣, 將固定供體APBT濃度為1.0×10-5mol/L, 測(cè)定TPP濃度分別為0、0.1×10-5、0.2×10-5、0.3×10-5、0.4×10-5和0.5×10-5mol/L時(shí)APBT熒光的變化以考察受體濃度對(duì)FRET體系的影響, 結(jié)果見(jiàn)圖4(b)。 可以看出, 增加TPP濃度, 其自身熒光強(qiáng)度增加, 但APBT的熒光強(qiáng)度降低, 即出現(xiàn)了一定程度的熒光猝滅, 最終也到達(dá)飽和狀態(tài)。

綜上所述, 供體APBT與受體TPP之間的FRET結(jié)果, 是供體能量轉(zhuǎn)移加強(qiáng)了受體的發(fā)射熒光能力, 同時(shí)供體自身的熒光發(fā)射能力被部分地削減。

2.2.2 APBT與ZnTPP濃度對(duì)其FRET體系的影響

按2.2.1相同的方式, 考察了APBT與ZnTPP濃度對(duì)其FRET體系的影響, 結(jié)果如圖5(a)和(b)所示。

比較可知, 圖4(a)與5(a)所反映的變化規(guī)律以及4(b)與5(b)所呈現(xiàn)的熒光猝滅現(xiàn)象基本相似, 只是兩個(gè)FRET體系中受體TPP和ZnTPP雙發(fā)射熒光峰的位置與強(qiáng)度有差別。 因此, 兩體系的FRET過(guò)程的結(jié)果和規(guī)律也是相似的。

圖4 (a) APBT濃度對(duì)FRET的影響(λex=400 nm);(b) TPP濃度對(duì)FRET的影響(λex=400 nm)Fig.4 (a) Effect of concentration of APBT on the FRET(λex=400 nm);(b) Effect of concentration of TPP on the FRET(λex=400 nm)

圖5 (a) APBT濃度對(duì)FRET的影響(λex=410 nm);(b) ZnTPP濃度對(duì)FRET的影響(λex=410 nm)Fig.5 (a) Effect of concentration of APBT on the FRET(λex=410 nm);(b) Effect of concentration of ZnTPP on the FRET(λex=410 nm)

2.3 體系的FRET參數(shù)

2.3.1 受體與供體作用的結(jié)合比

從上述濃度對(duì)FRET系統(tǒng)的影響規(guī)律可以看出, 供受體濃度增大到一定量時(shí)受體熒光峰強(qiáng)度會(huì)達(dá)到一個(gè)臨界飽和狀態(tài), 此時(shí)熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定值。 據(jù)此, 可以確定穩(wěn)定的FRET系統(tǒng)中, 受體與供體之間分子作用的數(shù)目比[16]。

考慮下列的供體D與受體A的結(jié)合反應(yīng)式:

nD+A=DnA

(1)

其中n為受體與供體結(jié)合的分子數(shù)目比。 以D和A的熒光強(qiáng)度對(duì)其濃度比cA/cD作圖可得兩條曲線, 將其相應(yīng)的兩切線外延可得交點(diǎn), 由交點(diǎn)的濃度比值可得結(jié)合比n。 圖6繪出了兩種FRET體系的這種熒光強(qiáng)度與供體對(duì)受體濃度比的關(guān)系。

圖6 (a) APBT與TPP結(jié)合比;(b) APBT與ZnTPP結(jié)合比Fig.6 (a) Number ratio of APBT to TPP; (b) Number ratio of APBT to ZnTPP

在圖6(a)中, 受體TPP和供體APBT熒光強(qiáng)度曲線之切線延長(zhǎng)線交點(diǎn)分別C和B, 其橫坐標(biāo)分別為0.454和0.510, 近似為0.500,n即為2, 表明在APBT-TPP的FRET體系中, 供體與受體的最大分子結(jié)合比為2∶1。 而在圖6(b)中, 延長(zhǎng)線交點(diǎn)E和F的橫坐標(biāo)分別為0.303和0.337,n值近似為3, 即在APBT與ZnTPP所構(gòu)建的FRET體系中, 1個(gè)受體分子最多可與3個(gè)供體發(fā)生FRET作用。

2.3.2 能量轉(zhuǎn)移效率和供體-受體結(jié)合距離

由F?RSTER方程可知, FRET的效率E有如下關(guān)系[17]:

(2)

式中,FDA是供體在受體影響下的熒光強(qiáng)度,FD是供體單獨(dú)作用下的熒光強(qiáng)度,n為受體供體數(shù)目比,r為供體-受體間的距離,R0為EFRET=50%時(shí)的臨界距離:

(3)

式(3)中,K為偶極空間取向因子,n0為介質(zhì)的折射系數(shù),ΦD為供體的熒光量子產(chǎn)率,J(λ)為發(fā)射光譜與吸收光譜的重疊積分:

(4)

式(4)中,F(λ)為供體在波長(zhǎng)λ處的熒光強(qiáng)度,ε(λ)為受體在波長(zhǎng)λ處的摩爾消光系數(shù)。

根據(jù)供體發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊面積, 經(jīng)計(jì)算, APBT-TPP和APBT-ZnTPP體系的J(λ)分別為7.68×10-14和1.91×10-13cm3·L·mol-1；兩體系的取向因子按供體-受體各項(xiàng)隨機(jī)分布的平均值去取值, 即K2=2/3, 溶劑的折射指數(shù)n0為1.41；APBT在400 nm和410 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下, 熒光量子產(chǎn)率ΦD為0.249 5和0.058 6。 進(jìn)而計(jì)算可得, 對(duì)于APBT-TPP體系,EFRET=0.180 3,R0= 3.76 nm,r=4.31 nm；對(duì)于APBT-ZnTPP體系,EFRET=0.137 5,R0= 3.44 nm,r=3.88 nm。

2.4 FRET體系供體-受體結(jié)合機(jī)制分析

F?RSTER共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)屬于長(zhǎng)程能量轉(zhuǎn)移, 是通過(guò)供體和受體分子偶極-偶極相互作用途徑而實(shí)現(xiàn)的非輻射共振能量, 其實(shí)現(xiàn)條件除了能量匹配, 即供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜由一定程度的重疊外, 還要求兩偶極子中心距離在1～10 nm范圍(即遠(yuǎn)大于碰撞半徑)及躍遷偶極有合適的相對(duì)取向以提高轉(zhuǎn)移效率。 在本文所考察的兩個(gè)FRET體系中, 供體APBT的作用均能增強(qiáng)受體TPP及ZnTPP的熒光發(fā)射強(qiáng)度, 而不是猝滅受體的熒光, 表明供體-受體在作用過(guò)程中可能形成了相對(duì)穩(wěn)定的締合物或聚集體, 提高了體系的發(fā)光效率。

從分子結(jié)構(gòu)看, 供體APBT分子中苯基上的氨基一個(gè)氫原子可與噻唑環(huán)上的氮原子形成分子內(nèi)氫鍵N-H子中, 另一個(gè)氫原子可與受體TPP卟啉環(huán)上的氮原子形成N-H啉環(huán)分子間氫鍵, 一個(gè)TPP分子在其環(huán)平面兩側(cè)分別形成一個(gè)N-H子在氫鍵, 使得APBT與TPP的分子結(jié)合比為2∶1。 而在APBT-ZnTPP體系中, 除了與TPP相同的分子間氫鍵作用外, 還可能借助APBT分子噻唑環(huán)的氮原子與ZnTPP中的Zn2+離子發(fā)生軸向配位作用, 因而兩者的結(jié)合比可達(dá)3∶1。 ZnTPP的這種軸向配位作用已被吡啶、吡咯及其衍生物等配體所證實(shí)[18]。

3 結(jié)論

構(gòu)建了APBT-TPP和APBT-ZnTPP兩個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系, 在其相應(yīng)的FRET過(guò)程中, 供體APBT的能量轉(zhuǎn)移均加強(qiáng)了受體TPP和ZnTPP的發(fā)射熒光能力, 同時(shí)供體自身的發(fā)射熒光被部分地猝滅。

ZnTPP中由于中心Zn2+離子的配合作用, 改變了配體分子TPP的π電子分布密度, 吸收光譜與熒光發(fā)射光譜發(fā)生了一定的變化。 兩體系的FRET轉(zhuǎn)移效率、臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0及相互作用的供體/受體結(jié)合比等也有一定的差異。 借助于分子間氫鍵, 兩種體系中的受體分子卟啉環(huán)兩側(cè)可分別結(jié)合一個(gè)供體APBT分子形成作用分子對(duì), 以實(shí)現(xiàn)體系的熒光共振能量轉(zhuǎn)移, ZnTPP還可通過(guò)軸向配位作用結(jié)合一個(gè)APBT分子, 使體系FRET轉(zhuǎn)移效率和臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有一定程度的降低。