黃 瞇，辛偉年，雷小林,，張志能，葉雄英，孫 穎★

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江西 南昌330045；2.江西省林業(yè)科學(xué)院·木本油料與香精香料工程中心，江西南昌330013；3.定南縣林業(yè)局，江西 贛州341900；4.江西交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330013）

微生物群落是凋落物殘體分解、土壤團(tuán)聚體形成和土壤有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定的主要原因[1-3]，影響著許多大量元素和微量營養(yǎng)素的有效性和吸收、植物疾病的類型，對植物健康和生產(chǎn)力至關(guān)重要的作用[4-6]。

油茶是典型的“抱子懷胎”植物，花果同期，對養(yǎng)分的需求量大，如不能及時供給養(yǎng)分容易引起土壤肥力下降，最終導(dǎo)致油茶產(chǎn)量下降[7-9]。施肥是目前生產(chǎn)過程中最常見的提高油茶產(chǎn)量的方法，不同的施肥處理會給土壤環(huán)境造成不同的影響，從而導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[10-11]。費(fèi)裕翀[12]以及王迪等[10]人的研究表明共同表明有機(jī)無機(jī)混合肥對土壤細(xì)菌和真菌的效果最佳。王華[13]的研究指出油茶專用有機(jī)肥顯著增加了氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌的數(shù)量。目前關(guān)于施肥對油茶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究的文章較少，且大部分采用的是平板計數(shù)的實驗方法，不能準(zhǔn)確的反應(yīng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。本文旨在運(yùn)用高通量測序的手段，研究氮磷鉀不同比例的有機(jī)無機(jī)混合肥、有機(jī)肥對油茶幼林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，揭示施肥后各處理中的細(xì)菌群落組成及變化情況，為探究適合油茶幼林的氮磷鉀比例肥料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地位于江西省贛州市定南縣歷市鎮(zhèn)蕉坑村（24°32′ N，114°46′ E）進(jìn)行，該地屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)，四季分明，溫暖濕潤，光照充足，年平均氣溫為19 ℃，日照率為43%，全年無霜期近300 d。試驗地油茶品種為長林系列，2015年種植，植株健康狀況良好，無病蟲害。試驗前土壤pH 5.08，全磷2.30 g·kg-1、全氮15.87 g·kg-1、全鉀1.85 g·kg-1、鋅11.66 mg·kg-1、鎂1.52 g·kg-1、鈣2.71 g·kg-1、硼0.13 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019年4月進(jìn)行，試驗設(shè)置5 個處理，根據(jù)生產(chǎn)中的經(jīng)驗，在有機(jī)肥中添加不同質(zhì)量的尿素、磷酸二銨、硫酸鉀，構(gòu)成的氮磷鉀不同比例肥料配方，詳見表1。有機(jī)肥由銳源生物科技有限公司提供，處理中所使用的尿素、磷酸二銨、硫酸鉀均購自當(dāng)?shù)胤柿系辍Ｃ總€配方施30 棵，施肥采用穴施法，距離主干30 cm 處挖取深30 cm 左右的深的溝，統(tǒng)一施在油茶樹的北側(cè)，并及時覆土。

表1 試驗處理及肥料施用量Tab. 1 Test treatment and fertilizer application amount

1.3 土壤樣品采集及測定

2019年7月進(jìn)行樣品采集，每個處理20 棵，用取樣器采集10～30 cm 左右的油茶根際土壤，剔除石礫和和雜草后將每個處理的土壤等量混合按四分法分為2份，一份放入液氮罐中保存，另一份裝入無菌袋中帶回實驗室用于測量土壤化學(xué)性質(zhì)，土壤化學(xué)性質(zhì)的測定方法參照《中華人民共和國林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T－1999》[14]，16S rDNA、PCR 產(chǎn)物高通量測序由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用基迪奧的OmicShare 云平臺進(jìn)行α、β 多樣性分析。用SPSS 20.0、Excel2010 統(tǒng)計基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，R studio 1.2.1335 版完成熱圖、維恩圖、物種組成圖、網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

從表2 中可以看出，施肥處理后，土壤全氮、速效鉀、全鉀含量都極顯著提高（P＜0.01）。其中全鉀（TK）含量是不施肥的3.11～4.46 倍、速效鉀（AK）含量是不施肥處理的3.17～4.01 倍，Y2、Y4處理的土壤有機(jī)質(zhì)（OM）含量高于對照，Y1處理的pH 與對照具有極顯著差異，總磷含量中只有Y2處理比對照低1.88 g·kg-1，其余處理均極顯著高于對照。堿解氮（AN）含量分別提高了58.67%、77.77%、164.14%、111.73%，除Y1處理的有效磷（AP）含量比對照低0.10 mg·kg-1，Y2、Y3、Y4有效磷（AP）含量分別高出對照0.37 mg·kg-1、0.13 mg·kg-1、0.08 mg·kg-1。

表2 土壤化學(xué)性質(zhì)Tab. 2 Chemical properties of soil

2.2 細(xì)菌群落分析

從圖1 可以看出，5 個處理擁有相同的OTU 數(shù)量為1 051 個，其中Y1處理的特有微生物數(shù)量最多742 個，CK、Y4、Y3、Y2處理的特有OTU 分別為649個、638 個、589 個、565 個。從OTU 總量上來看Y（13 268 個）＞Y（43 241 個）＞Y（23 197 個）＞Y（33 109 個）＞CK（3 020 個），表明施肥處理提高了土壤細(xì)菌的OTU數(shù)量，且每個處理的細(xì)菌OTU 組成都具有一定的差異性，Y1處理下的細(xì)菌群落豐度和多樣性優(yōu)于其他處理。

圖1 油茶根際土壤細(xì)菌OTU 數(shù)量Fig. 1 The number of OTUs in the rhizospheresoil of C.oleifera

2.3 優(yōu)勢細(xì)菌分析

利用QIIME 軟件分析各個處理的菌群組成結(jié)構(gòu)，繪制成圖2。從圖中可以本次試驗中油茶林地的主要菌落為以下7 個：放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、浮霉菌門（Planctomycetes）以及未知菌門。其中放線菌門、綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門這四個菌群相對豐度之和均大于80%，是油茶林地中的主要菌門。各個處理優(yōu)勢細(xì)菌有所不同，CK、Y1、Y2的優(yōu)勢菌種為綠彎菌門，而Y3、Y4的優(yōu)勢菌種為放線菌門。Y1、Y2、Y3、Y4處理的放線菌門所占比例分別比對照高出15.29%、13.03%、32.96%、30.82%，Y2、Y3、Y4處理的綠彎菌門比對照分別下降了7.42%、24.5%、23.75%，未知菌門比例也顯著下降。在進(jìn)行聚類熱圖分析時（圖3），可以看出CK 和Y2首先聚為一類，再與Y1聚成第二類，與Y3、Y4處理關(guān)系較遠(yuǎn)。因此可以看出施肥對油茶林地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有影響，不同的施肥處理影響的菌門也不同，其中Y3處理的放線菌門、Y1處理的綠彎菌門變化最為顯著。

圖2 油茶根際土壤細(xì)菌門水平的群落結(jié)構(gòu)Fig. 2 Community structure of Bacteroides in the rhizosphere soil of C. oleifera

圖3 油茶根際土壤細(xì)菌門水平聚類熱圖Fig. 3 Horizontal clustering heat map of bacterial phylum in the rhizosphere soil of C. oleifera

表3 油茶根際土壤細(xì)菌α 多樣性指數(shù)Tab. 3 Diversity index of bacteria α in the rhizosphere soil of C. oleifera

2.4 不同處理對土壤微生物α 多樣性的影響

從表3 中可以看出，測序后的數(shù)據(jù)經(jīng)過篩查得到各處理的序列數(shù)總和為440 749，其中Y1的序列數(shù)97 090 為所有處理最高，Y4的序列數(shù)比對照低7 052。Sobs 指數(shù)是對觀察到的OTU 的直觀數(shù)量統(tǒng)計，Chao1指數(shù)和ACE 指數(shù)反應(yīng)土壤微生物物種豐富度。Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)與土壤微生物物種的豐富度以及均勻度正相關(guān)。從表中可以看出施肥處理提高了Chao1 和ACE，其中Y1處理的Chao1 指數(shù)、Y4的ace 指數(shù)分別比對照提高了19.2%、20.3%；除Y2處理外，其余處理的shannon 指數(shù)較對照有所下降?？梢缘贸霾煌牡租洷壤幚頃τ筒栌琢滞寥兰?xì)菌落豐度和多樣性產(chǎn)生影響，其中Y1處理的豐度及多樣性優(yōu)于其他處理。

2.5 β 多樣性指數(shù)分析

基于OTU 水平對不同處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA），由圖4 可知，PC1、PC2 的解釋度分別為84.12%和14.73%，總解釋度達(dá)到98.85%。除Y2與CK 處理在同一個象限外，其余處理均聚類于不同象限，說明不同施肥顯著改變了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

2.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

對土壤細(xì)菌與土壤化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析得到表 4， 從 表 4 中發(fā)現(xiàn) AN 與放線菌 門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）呈顯著正相關(guān)關(guān)系，AK、TK 均與浮霉菌門（Planctomycetes）呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，其余環(huán)境因子對土壤細(xì)菌優(yōu)勢門有影響，但未達(dá)到顯著相關(guān)。綠彎菌門（Chloroflexi）僅與土壤pH 為正相關(guān)關(guān)系，與其他土壤化學(xué)性質(zhì)均為負(fù)相關(guān)；變形菌門（Proteobacteria）與OM 和AP 呈正相關(guān)；酸桿菌門（Acidobacteria）與OM、pH 為負(fù)相關(guān)；疣微菌門（Verrucomicrobia）除與pH、TP 為負(fù)相關(guān)外，與土壤其他化學(xué)性質(zhì)均為正相關(guān)；浮霉菌門（Planctomycetes） 與TN、OM、pH、TP、AN、AP 均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖4 油茶根際土壤細(xì)菌群落PCoA 聚類圖Fig. 4 PCoA cluster of bacterial communities in the rhizosphere soil of C. oleifera

表4 油茶根際土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)相關(guān)性分析Tab. 4 Correlation analysis of community structure of bacteroidea and soil chemical properties in the rhizosphere soil of C.oleifera

3 討論

3.1 施肥對土壤細(xì)菌數(shù)量的影響

土壤生態(tài)平衡離不開細(xì)菌的多樣性[15]，不同的施肥處理改變了土壤細(xì)菌的多樣性，試驗的OTU 結(jié)果顯示Y1 處理的OTU 總量以及特有OTU 數(shù)量均為所以處理中最高，不施肥（CK）處理的OTU 總量最低，這個結(jié)果可能是因為施用有機(jī)無機(jī)復(fù)合肥之后土壤有機(jī)質(zhì)含量上升，為微生物的生長提供了良好的生長環(huán)境，其次有機(jī)肥中本身攜帶有大量的微生物，某些特有微生物可能是有機(jī)肥中的微生物，例如纖維桿菌門門，纖維桿菌門只有一個纖維桿菌屬，該屬菌種生活在反芻動物的瘤胃中[16]；軟壁菌門屬于革蘭氏陽性菌，常在新鮮豬糞中被檢測到[17-18]。微生物的α 多樣性中的Simpson 揭示了物種的均勻度，CK 的Simpson的系數(shù)最高，表示施肥處理會降低土壤微生物的均勻度，這個結(jié)果與李想[19]的研究結(jié)果相似。

3.2 施肥對土壤細(xì)菌群落組成的影響

本研究應(yīng)用Illumina 高通量測序技術(shù)，分析了不同施肥處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化特征。結(jié)果表明，各處理中的放線菌門、綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門相對豐度之和大于80%，是油茶林地中的主要菌門，這與吳澤龍、費(fèi)裕翀[12,20]的研究結(jié)果一致。Y1、Y2、Y3、Y4處理顯著增加了放線菌門的比例，其中Y3、Y4這兩個處理中放線菌門成為優(yōu)勢菌門。放線菌門大多為腐生富營養(yǎng)菌，生態(tài)位較寬且大部分是有益菌, 對某些病原菌會產(chǎn)生拮抗作用，廣泛分布于各類土壤之中[21-23]，王伏偉[24]研究認(rèn)為土壤全氮含量是提高放線菌門相對豐度的重要原因，這與本試驗的研究結(jié)果相同，本試驗還發(fā)現(xiàn)放線菌門的提高不僅與全氮有關(guān)，還與堿解氮呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。綠彎菌門的增加有助于有機(jī)物的分解，促進(jìn)營養(yǎng)元素的循環(huán)[25-26]，本研究中綠彎菌門發(fā)現(xiàn)與土壤pH 呈正相關(guān)，這一結(jié)論與姚蘭等人[27]的研究結(jié)果相同。酸桿菌門與堿解氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系。Yin 的試驗結(jié)果表明根際土壤中酸桿菌門增加可能與土壤抑病相關(guān)[28]。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù)研究了氮磷鉀不同比例有機(jī)無機(jī)復(fù)合肥、有機(jī)肥、不施肥處理下的油茶根際土壤細(xì)菌多樣性，結(jié)果表明有機(jī)復(fù)合肥、有機(jī)肥處理顯著增加了土壤微生物細(xì)菌的多樣性。在微生物群落的組成上，放線菌門、綠彎菌門、變形菌門、酸桿菌門這4 個菌群相對豐度之和均大于80%，是本試驗中油茶根際土壤中的主要菌門。本研究中AN、AK、TK 是對土壤細(xì)菌產(chǎn)生顯著影響的3 個環(huán)境因子。在油茶幼林中，有機(jī)肥和化肥按照合理的比例適量的施用，在改善土壤化學(xué)性質(zhì)的同時，還提高了土壤細(xì)菌的數(shù)量，本研究中，Y1處理下土壤細(xì)菌的豐度為所有處理中最高。