王曉希，趙曉萌 ，余向前，趙文國，李志強(qiáng)

隨著現(xiàn)代骨科學(xué)的迅速發(fā)展，膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)的方法、技術(shù)、設(shè)備不斷完善。藻酸鈣(CaAlg)三維立體支架是目前常見的軟骨缺損填充物之一，對缺處的磨損有較好的修復(fù)作用[1-2]。CaAlg三維立體支架內(nèi)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，對軟骨細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。本研究旨在以聚乙烯醇(PVA)與CaAlg為材料，結(jié)合支架內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[1]制作多孔的、可滲透的復(fù)合支架，探討PVA聯(lián)合CaAlg(PVA/CaAlg)與兔軟骨細(xì)胞(ATDC-5)共培養(yǎng)對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的影響，以及對胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的mRNA表達(dá)及Ⅱ型膠原分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級4周齡新西蘭白兔3只，體重0.9～1.1(1.0±0.1)kg，清潔級成年新西蘭白兔20只，體重2.9～3.1(3.0±0.1)kg，雌雄不限。實驗動物由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供(批準(zhǔn)號:GB/T35823-2018)。動物在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食和攝水，每天光照12 h，環(huán)境溫度21～23(22±1) ℃。

1.2 材料與試劑PVA(聚合度為97%，百靈威科技有限公司)、胎牛血清(Gibco公司)，Ⅱ型膠原酶I抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，通用型Ⅱ抗、PBS緩沖液、DAB顯色劑(北京中杉金喬生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基(大連美倫生物技術(shù)有限公司)，青霉素-鏈霉素雙抗、海藻酸鈉、氯化鈣[艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司]，RT-PCR引物(愛康生物科技有限公司)，Trizol(Invitroge公司)，水合氯醛(洛陽市洛龍區(qū)豫科環(huán)試化工商店)，HE染色試劑盒[博苑生物科技(上海)有限公司]。

1.3 實驗儀器與器械二氧化碳培養(yǎng)箱(三洋公司)，雙人單面超凈工作臺SW-CJ-1BU(博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)，光學(xué)顯微鏡CX41-12C02、掃描電鏡SU8010(奧林巴斯公司)，可見分光光度計722N(上海光學(xué)儀器廠)，電子天平JA2005(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)，高速離心機(jī)(北京醫(yī)學(xué)離心機(jī)廠)，RT-PCR熱循環(huán)儀CFX96(Bio-Rad公司)，病理切片機(jī)YD1508B(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)，蓋玻片、載玻片、一次性吸管、無菌離心管[諾爾曼生物技術(shù)(南京)有限公司]，無菌培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶[博苑生物技術(shù)(上海)有限公司]，外科手術(shù)器械(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)。

1.4 樣品制備

1.4.1ATDC-5細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 處死3只4周齡新西蘭白兔，碘伏反復(fù)消毒皮膚3次以上，外側(cè)髕骨旁做切口，剝開兔皮，游離雙下肢肌肉組織，暴露膝關(guān)節(jié)(切勿損傷關(guān)節(jié)囊)，截取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，取膝關(guān)節(jié)軟骨，碘伏消毒后放入無菌培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，用PBS緩沖液充分沖洗直至表面無碘伏。再用刀片小心取下表面的軟骨組織，將其放入燒杯中，再次用PBS緩沖液沖洗至無色。剪碎軟骨組織放入50 ml立式離心管中，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37 ℃下消化60 min。消化結(jié)束后，用吸管吸出多余的消化液，150目尼龍篩網(wǎng)過濾，過濾后放入離心管中加入DMEM終止消化，于1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，反復(fù)吹打成混懸液，于含5%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，光鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)與密度。大約每隔2 d更換1次培養(yǎng)液，若光鏡下觀察到軟骨細(xì)胞完全貼壁80%左右，即可傳代。將兔ATDC-5細(xì)胞傳至第2代，HE染色觀察兔ATDC-5細(xì)胞的形態(tài)變化，免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原的分泌情況。

圖1 PVA/CaAlg材料

1.4.2PVA/CaAlg材料的制備與兔ATDC-5細(xì)胞三維培養(yǎng)冷凍-解凍循環(huán)法制備復(fù)合物 采用超濾法去除海藻酸鈉溶液及氯化鈣溶液中的熱原及微生物后，將氯化鈣濃度調(diào)至3 mol/L、海藻酸鈉濃度調(diào)至4%后混合攪拌均勻，此時其溶脹率達(dá)到最大，獲得CaAlg凝珠后，溶解一定量的PVA，在90 ℃下油浴，加熱不斷攪拌4 h，再加入CaAlg攪拌4 h，最后靜置脫泡。將混合液倒入模具中，于-20 ℃冰箱中冷凍成型，12 h后取出，在室溫下解凍6 h。重復(fù)上述冷凍解凍過程5次。將PVA與CaAlg的濃度比例調(diào)節(jié)為3 ∶7，置于-50 ℃下進(jìn)行冷凍干燥，最終形成多孔的PVA/CaAlg材料 (見圖1)，并采用高溫蒸汽滅菌法測定PVA/CaAlg材料的無菌性。 滴入兔ATDC-5 懸液淹沒PVA/CaAlg材料，2周后HE染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色，檢查PVA/CaAlg材料內(nèi)兔ATDC-5細(xì)胞的活性。

1.4.3兔膝關(guān)節(jié)缺損模型制備及分組 按隨機(jī)數(shù)字表法將20只成年新西蘭白兔分為對照組、實驗組，每組10只。兩組按劑量3 ml/kg腹腔注射15%水合氯醛麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺，使雙下肢處于伸直狀態(tài)。常規(guī)碘伏消毒3次，以右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做橫向切口1 cm，逐層分離，暴露內(nèi)側(cè)副韌帶。定位關(guān)節(jié)腔位置，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，可見內(nèi)側(cè)半月板和關(guān)節(jié)腔，再用小剪刀進(jìn)入關(guān)節(jié)腔剪斷前后交叉韌帶，充分暴露關(guān)節(jié)面，在下端右膝關(guān)節(jié)軟骨造缺損模型。對照組：缺損區(qū)不做處理，每5 d向右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水2 ml；實驗組：植入共培養(yǎng)后的PVA/CaAlg復(fù)合物，術(shù)后5 d內(nèi)局部注射慶大霉素預(yù)防感染，12周后對缺損區(qū)組織進(jìn)行HE染色、免疫組化染色、RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達(dá)。

1.5 軟骨組織HE染色12周后，兩組動物全部處死，將右膝關(guān)節(jié)上下折斷，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，剔除多余的肌肉組織，打開關(guān)節(jié)腔，充分暴露缺損處，用PBS緩沖液洗凈后固定于4%多聚甲醛中，避光下固定24 h后，再用流水不斷沖洗24 h，予以常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察軟骨組織病理學(xué)變化。

1.6 Ⅱ型膠原免疫組化染色光鏡下觀察細(xì)胞爬片情況，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；滴加Trypsin-EDTA進(jìn)行修復(fù)20 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；再滴加3% H2O2封閉液10 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；接著將通用型Ⅱ抗滴加到切片上，在37 ℃下孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3遍，每次2 min；再滴加DAB顯色劑，室溫下顯色5 min，光鏡下觀察終止顯色；最后進(jìn)行HE染色，二甲苯透明及中性樹膠封片，觀察修復(fù)處軟骨細(xì)胞的膠原分泌情況。

1.7 RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達(dá)采取氯仿法提取瘢痕組織RNA，紫外吸收法測定其純度和濃度。用Trizol法提取總RNA，擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性下5 min ；變性94 ℃下40 s，退火55 ℃ 下50 s，延伸72 ℃下50 s，共35個循環(huán)。引物由浙江愛康生物科技有限公司合成，GAPDH基因mRNA內(nèi)參，上游引物5′-CCA-CAT-CGC-TCA-GAC-CAT-3′，下游引物5′-ACG-GTG-CCA-TGG-AAT-TTG-CCI-3′。具體步驟如下：精密稱取200 mg軟骨組織，加入Trizol溶液1 ml，剪碎，震蕩30 s，加入0.2 ml氯仿，室溫下劇烈震蕩30 s，于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，加入相同體積量的異丙醇溶液，-20 ℃下放置30 min后，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，離心后可見底部有少量的RNA。再棄去上清液，加入1 ml 75%乙醇，震蕩搖勻，連續(xù)洗滌2次，于4 ℃ 7 500 r/min離心10 min，棄去上清液，再用濾紙吸走殘余液體，室溫下干燥10 min。利用光譜分析A260/A280的比值(范圍為1.8～2.1)檢測RNA提取后的純度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩０凑障铝许樞蛞来渭尤朐噭篟T-PCR緩沖液25 μl、MgCl2(25 mmol/L)1.5 μl、2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl、上游引物和下游引物各2.0 μl、0.2 μl Tap DNA聚合酶以及1 mg/L DNA模板2.0 μl。最后按照上述擴(kuò)增條件在RT-PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 兔ATDC-5細(xì)胞形態(tài)及組織學(xué)檢查光鏡下觀察，第2代兔ATDC-5細(xì)胞貼壁良好，少部分細(xì)胞正在分裂增殖，此時細(xì)胞呈橢圓形、多角形，見圖2。原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，HE染色顯示軟骨細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)多呈卵圓形、多角形；細(xì)胞核為圓形或橢圓形，胞液豐富，著色明顯，部分細(xì)胞伸出偽足，見圖3A；在光鏡下觀察，Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞生長地方棕色較深，見圖3B。

2.2 PVA/CaAlg復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞形態(tài)及組織學(xué)檢查2周后對PVA/CaAlg復(fù)合物進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示兔ATDC-5細(xì)胞表型正常，部分細(xì)胞分裂，細(xì)胞核著色呈藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)液豐富，呈淡紅色，支架結(jié)構(gòu)完整，見圖4A；Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果顯示，細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞內(nèi)外均可見到棕色顆粒狀，見圖4B。

2.3 缺損區(qū)修復(fù)狀況的對比檢查與實驗組相比，對照組膝關(guān)節(jié)缺損區(qū)明顯瘢痕組織增生，關(guān)節(jié)面不平整，伴有大量的關(guān)節(jié)液增加現(xiàn)象，見圖5。HE染色結(jié)果顯示對照組缺損區(qū)細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，軟骨細(xì)胞較少，纖維組織顯著增多，無新生血管長入，實驗組缺損區(qū)細(xì)胞及組織結(jié)構(gòu)排列較整齊，軟骨細(xì)胞多，細(xì)胞核微小、聚集，纖維組織較少，見圖6。表明PVA/CaAlg與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時纖維組織在逐漸減少。通過免疫組化染色在光鏡下可明顯觀察到：能分泌Ⅱ型膠原的軟骨細(xì)胞著黃褐色，對照組Ⅱ型膠原分泌較少，排列不規(guī)律，實驗組Ⅱ型膠原分泌較多，排列整齊規(guī)律，見圖7。說明PVA/CaAlg與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原。

2.4 RT-PCR定量分析IGF-1的mRNA表達(dá)提取mRNA的純度經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測以及擴(kuò)增和溶解曲線分析表明，無明顯雜質(zhì)，符合實驗要求。結(jié)果顯示， IGF-1的mRNA表達(dá)量對照組低于實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖8。

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨損傷后很難進(jìn)行自我修復(fù)，雖然損傷后局部軟骨細(xì)胞能進(jìn)行一定程度的有絲分裂，形成瘢痕和增厚的軟骨組織，并產(chǎn)生膠原，但新生的膠原不足以修復(fù)軟骨缺損區(qū)，增厚軟骨表層也僅僅是以成纖維細(xì)胞為主的增生，其生物力學(xué)性能不如軟骨組織，也無法承受過重負(fù)荷。這種修復(fù)僅是形態(tài)上的修復(fù)并不是完全修復(fù)，造成這種結(jié)果的原因有很多，根據(jù)我們多年經(jīng)驗認(rèn)為其原因如下：① 軟骨細(xì)胞增殖能力較差，蛋白多糖分子的合成、聚合與硫酸化易受內(nèi)外環(huán)境因素的變化，損傷情況下炎癥因子的刺激導(dǎo)致其分解速率增加。② 軟骨組織基質(zhì)主要有膠原及可聚蛋白聚糖，賦予了組織外形和強(qiáng)度，但也因其致密的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致缺損區(qū)缺少遷移增殖并參與修復(fù)的未分化細(xì)胞。③ 成年后，軟骨鈣化層中羥基磷灰石大量沉積導(dǎo)致潮線的出現(xiàn)，進(jìn)一步減少了其營養(yǎng)來源[3-4]。這些原因損傷后軟骨細(xì)胞成簇狀或克隆狀增生，而沒有能力修復(fù)損傷組織及阻止損失進(jìn)一步加重，只能讓損失部位及其周圍發(fā)生進(jìn)一步的撕裂及啟動炎癥反應(yīng)。④ 損傷后缺損區(qū)的不平整，在緩慢的修復(fù)過程中由于磨損會延緩愈合或加重?fù)p傷。以上這4種因素均影響著軟骨的自身修復(fù)作用。

圖2 第2代兔ATDC-5細(xì)胞光鏡下形態(tài),細(xì)胞呈橢圓形、多角形 ×100 圖3 原代軟骨細(xì)胞72 h后HE染色及免疫組化染色 ×100 A.HE染色顯示細(xì)胞多為圓形或橢圓形，著色顯著，部分細(xì)胞伸出偽足;B.Ⅱ型膠原免疫組化顯示細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞生長地方棕色較深 圖4 PVA/CaAlg復(fù)合物HE染色及免疫組化染色 ×100 A.HE染色顯示部分細(xì)胞分裂，細(xì)胞核著色呈藍(lán)色,細(xì)胞內(nèi)液呈淡紅色，支架結(jié)構(gòu)完整;B.Ⅱ型膠原免疫組化顯示細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，細(xì)胞內(nèi)外均可見到棕色顆粒狀

IGF-1是一種多功能的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖及活性[5]。同時兔ATDC-5細(xì)胞中IGF-1的表達(dá)情況，是反映軟骨缺損修復(fù)情況的指標(biāo)之一。本實驗中，通過HE染色觀察兔ATDC-5細(xì)胞在材料上的生長情況，免疫組化檢測Ⅱ型膠原的分泌，RT-PCR檢測IGF-1的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)實驗組兔ATDC-5細(xì)胞的數(shù)量、膠原的分泌、排列規(guī)律性以及IGF-1的mRNA表達(dá)明顯優(yōu)于對照組，推測可能是通過PVA/CaAlg復(fù)合物與兔ATDC-5細(xì)胞共同培養(yǎng)，提高了IGF-1的表達(dá)，增加Ⅱ型膠原酶的分泌，從而促進(jìn)對兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用。

綜上所述，PVA/CaAlg復(fù)合物是一種良好的支架，這種復(fù)合支架材料具有良好的理化及生物學(xué)性能，與兔ATDC-5細(xì)胞共同培養(yǎng)后植入缺損區(qū)，為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了一種有效的方法。