孫細珍,杜佳煒，錢全全，吳平谷

(1.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435100；2.浙江省疾病預(yù)防控制中心， 浙江 杭州 310051)

PAHs的測定屬于痕量分析，監(jiān)測指標較多、理化性質(zhì)差異大、檢測難度較大。已有文獻報道的PAHs檢測方法多集中于土壤、水、空氣以及燒烤食品等方面[13-16]，對于中藥材等復(fù)雜基質(zhì)樣品中PAHs殘留量測定方面的研究報道較少。目前PAHs檢測中常用的樣品前處理方法主要有液液萃取技術(shù)、皂化法、凝膠滲透色譜法、固相萃取法、柱凈化-萃取聯(lián)用技術(shù)[17-21]等凈化方法，GB 5009.265-2016《食品安全國家標準 食品中多環(huán)芳烴的測定》中提供的檢測方法不能有效分離苯并[j]熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽，且油脂凈化效果較差[22]。益智藥材因含有大量的揮發(fā)油而導(dǎo)致基質(zhì)復(fù)雜，凈化效果不佳時會嚴重影響目標物的測定重復(fù)性和準確度，因此需要建立一種凈化效果良好、選擇性強、檢出限低的檢測方法監(jiān)測益智藥材中的PAHs。

本文采用液液萃取法提取樣品中的多環(huán)芳烴，通過聯(lián)合使用皂化法和固相萃取法對提取液進行凈化處理，進一步采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和稀釋同位素內(nèi)標法同時測定益智藥材中的16種多環(huán)芳烴。該方法具有提取效率高、凈化效果好的特點，能有效降低益智藥材中復(fù)雜基質(zhì)對多環(huán)芳烴目標物的干擾，具有較高的選擇性、靈敏度、準確性，已成功應(yīng)用于市售益智藥材中16種多環(huán)芳烴的監(jiān)控篩查。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

8批益智藥材購自全國各藥店，編號分別為YZ-1、YZ-2、YZ-3、YZ-4、YZ-5、YZ-6、YZ-7、YZ-8，所有樣品均在陰涼、避光處儲存。

固相萃取凈化柱：二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺柱(DVB+PSA，500 mg/6 mL)、弗羅里硅土柱(Florisil，2 000 mg/12 mL)均購自杭州福?？萍加邢薰荆环肿佑≯E柱(MIP，500 mg/6 mL)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。

PAHs標準溶液的配制：以丙酮-異辛烷(1∶1，體積比)為溶劑，將16種PAHs混標母液稀釋成0.2 mg/L的標準儲備液，7種PAHs同位素內(nèi)標混合溶液稀釋成4 mg/L的內(nèi)標使用液，于4 ℃保存?zhèn)溆茫徊捎帽?異辛烷(1∶1，體積比)稀釋PAHs標準儲備液，制備PAHs的系列標準曲線工作液(1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L)。

1.2 儀器與設(shè)備

8890-5977B 氣相色譜質(zhì)譜儀(配EI源with XTR，美國Agilent科技有限公司)；SPE-40自動固相萃取儀(天津伯納艾杰爾公司)；搖擺式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；3K15高速離心機(美國Sigma司)；PURELAB Ultra超純水機(英國埃爾格公司)；EFAA-DC24-RT氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)；SQP千分之一電子天平(德國Sartorius公司)；DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm，美國Agilent科技有限公司)。

1.3 樣品前處理

取2.0 g益智藥材樣品(過三號篩)于50 mL離心管中，加入10 μL內(nèi)標使用液，加入20 mL乙醇水溶液(1∶1，體積比)溶解后，再以10 mL正己烷超聲提取5 min，在8 000 r/min下離心5 min。提取液先過Florisil柱固相萃取，用5 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1∶4，體積比)洗脫，洗脫液于40 ℃水浴下氮吹至近干，用3 mL 0.3 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液溶解，加入4 mL水和5 mL正己烷，在8 000 r/min下離心5 min。取有機相過MIP柱進行固相萃取，用5 mL二氯甲烷-乙酸乙酯溶液(1∶1，體積比)進行洗脫，收集洗脫液，在40 ℃水浴中用氮氣緩慢吹干后，準確加入0.2 mL丙酮-異辛烷溶液(1∶1，體積比)，供GC-MS測定。樣品前處理過程見圖1。

圖1 供試樣品前處理流程Fig.1 Preprocessing flow for the test samples

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm，0.14 μm)；進樣口溫度為280 ℃，載氣為高純氦氣(純度為99.999%)，流速為0.8 mL/min；升溫程序為初溫80 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至315 ℃，保持5 min，最后以20 ℃/min 升至320 ℃，保持5 min；進樣體積為2 μL，不分流進樣。

質(zhì)譜條件：電離源為EI with XTR源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，溶劑延遲為16.5 min，離子掃描范圍為35～500 u。掃描方式：先采用全掃描模式(SCAN)確定16種PAHs與對應(yīng)內(nèi)標物(ISTD1、ISTD1……、ISTD7)的保留時間及特征離子，然后對目標化合物進行分組，采用選擇離子模式(SIM)掃描，16種PAHs和7種內(nèi)標物的保留時間、特征離子及SIM模式分組信息見表1。

表1 16種多環(huán)芳烴的色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC-MS parameters for 16 PAHs

1.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 22.0對不同樣本之間的最小顯著差異進行單因素分析，α≤0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異；使用Origin 8.6對數(shù)據(jù)進行說明。

圖2 16種PAHs混合標準溶液(200 μg/L) 的色譜圖(SIM)Fig.2 Chromatogram of 16 PAHs mixture standard in SIM mode 1.BcFL；2.D12-BaA；3.BaA；4.D12-CHR；5.CHR； 6.CPP；7.MCH；8.D12-BbFA；9.BbFA；10.BkFA； 11.BjFA；12.D12-BaP；13.BaP；14.D12-IP； 15.D14-DBahA；16.IP；17.DBahA； 18.D12-BghiP；19.BghiP；20.DBalP； 21.DBaeP；22.DBaiP；23.DBahP

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

16種PAHs存在同分異構(gòu)體現(xiàn)象，為獲得良好的分離度和靈敏度，本研究對升溫程序、柱流速、進樣體積等儀器條件進行了優(yōu)化(見“1.4”)。在優(yōu)化條件下，16種PAHs與7種PAHs同位素內(nèi)標物的SIM模式掃描圖如圖2所示。

2.2 萃取溶劑的選擇

益智藥材含有大量的揮發(fā)油且化學(xué)成分多樣，而待測的16種PAHs極性范圍寬、結(jié)構(gòu)差異大，通常采用正己烷、二氯甲烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯或其混合物作為提取溶劑[23]，為了降低基質(zhì)干擾，本實驗參照文獻[24]考察了正己烷、環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，體積比)和乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)共3種溶劑體系的提取效果，實驗結(jié)果如圖3所示。從圖中可知，以乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)為提取溶劑時，16種PAHs的提取回收率為85.4%～108%，優(yōu)于另外兩種溶劑體系。因此本實驗選擇乙醇-水-正己烷(1∶1∶1，體積比)作為提取溶劑。

2.3 凈化條件的選擇

由于益智藥材基質(zhì)復(fù)雜，檢測過程中會產(chǎn)生較大的干擾峰，影響檢測結(jié)果的靈敏度與準確度，因此凈化是PAHs檢測過程中的關(guān)鍵步驟。本實驗分別對比DVB+PSA柱和MIP柱對加標量為10 μg/kg的16種PAHs的凈化效果，結(jié)果如圖4所示。從圖可知，16種PAHs經(jīng)DVB+PSA柱凈化后的回收率為43.5%～123%，在MIP柱的回收率為78.1%～105%。結(jié)果表明DVB+PSA柱對部分PAHs具有基質(zhì)增加效應(yīng)，導(dǎo)致回收率過高。因此，本實驗選擇MIP柱作為凈化柱。

圖3 不同提取溶劑對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different solvents on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

圖4 不同萃取小柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.4 Effects of different SPE columns on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

實驗過程中發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)皂化后再采用MIP柱進行凈化處理，樣液顏色較深，不僅對儀器系統(tǒng)產(chǎn)生較大的污染，而且存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果的準確度，因此擬在皂化前增加Florisil凈化步驟。本實驗以益智藥材為研究對象，通過對16種PAHs的加標回收實驗(加標量為10 μg/kg)，對在皂化步驟前是否增加Florisil凈化進行考察，實驗結(jié)果如圖5所示。從圖可知，不進行Florisil柱凈化時，16種PAHs的回收率為66.4%～139%。進行Florisil柱凈化時，16種PAHs的回收率為85.4%～108%，且譜圖的雜質(zhì)峰數(shù)量明顯減少，雜質(zhì)響應(yīng)顯著降低。結(jié)果表明增加Florisil固相萃取可以提高凈化效果，獲得更佳的實驗結(jié)果。因此，本研究確定在皂化前先進行Florisil柱固相萃取。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的組分對檢測過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準確性。本研究采用Matuszewski等[25]建立的方法評價基質(zhì)效應(yīng)，即將同濃度的陰性基質(zhì)標準溶液目標物響應(yīng)值與純?nèi)軇藴嗜芤耗繕宋镯憫?yīng)值進行比較，比值等于1時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)；比值大于1時，表明存在基質(zhì)增強作用；比值小于1時，表明存在基質(zhì)抑制作用；比值介于0.8～1.2時，通常認為基質(zhì)效應(yīng)較弱，可以忽略[26]。實驗選取陰性益智藥材試樣，按“1.3”處理后的基質(zhì)樣液分別配制質(zhì)量濃度為50 μg/L和200 μg/L的基質(zhì)混合標準溶液，與同濃度的純?nèi)軇┗旌蠘藴嗜芤哼M行檢測比較。結(jié)果表明，經(jīng)Florisil-皂化-MIP聯(lián)合凈化后的兩種樣品基質(zhì)中，16種PAHs目標物的比值為0.8～1.2，說明本方法的基質(zhì)干擾較小，基質(zhì)效應(yīng)可忽略。

圖5 Florisil凈化柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.5 Effects of Florisil SPE column on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq

2.5 線性關(guān)系與檢出限

在優(yōu)化條件下，測定系列混合標準工作液，以各PAHs定量離子與對應(yīng)內(nèi)標物定量離子的峰面積比作縱坐標(y)，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度比作橫坐標(x,μg/L)繪制標準曲線，得到各PAHs的線性方程。以3倍信噪比(S/N=3)計算儀器檢出限(LOD)，結(jié)合前處理條件的稀釋倍數(shù)，確定方法的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)。實驗結(jié)果見表2，16種PAHs在1.0～200.0 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。4種二苯并芘的LOD為1.0 μg/kg，LOQ為3.0 μg/kg，其它12種PAHs的LOD為0.3 μg/kg，LOQ為1.0 μg/kg。

表2 16種PAHs的線性方程、r2、方法檢出限和定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients(r2)，LODs and LOQs of 16 PAHs

2.6 回收率與相對標準偏差

在優(yōu)化條件下，選取益智藥材樣品YZ-4分別進行3個水平(LOQ，2×LOQ，10×LOQ)的加標回收和精密度實驗，以中間添加水平連續(xù)實驗3 d，考察方法的日間精密度。由表3可知，在加標濃度范圍內(nèi)，除苯并[c]芴(BcFL)的加標回收率為65.4%～72.8%，日內(nèi)相對標準偏差(RSD，n=6)為6.0%～7.4%，日間RSD(n=6)為8.5%外，其他15種PAHs的加標回收率為89.3%～116%，日內(nèi)RSD(n=6)為0.10%～6.1%，日間RSD(n=6)為1.2%～7.5%。結(jié)果表明，該方法準確可靠，可用于益智藥材中16種PAHs的檢測分析。

表3 16種PAHs的回收率與相對標準偏差Table 3 Determination results of recoveries and RSDs of 16 PAHs

2.7 實際樣品的檢測

將采集的8個益智藥材樣品(YZ-1～YZ-8)，采用本實驗建立的方法測定16種PAHs的含量，結(jié)果如表4所示。從表中可知，8批益智藥材樣品中YZ-7和YZ-8中存在較高的PAHs，YZ-7樣品中BaP含量為9.05 μg/kg，PAH4(BaA、CHR、BbFA、BaP的總含量)為128.66 μg/kg；YZ-8樣品中BaP含量為9.90 μg/kg，PAH4含量為139.61 μg/kg。表明益智藥材中存在較為嚴重的多環(huán)芳烴污染，鑒于所采益智藥材樣品中普遍檢出PAHs化合物，需對益智藥材開展PAHs化合物污染調(diào)查，如干燥方式的風(fēng)險評估等。

表4 8批益智藥材中的PAHs殘留量結(jié)果(μg/kg)Table 4 Detection results of PAHs residues in 8 batches of Alpinia oxyphylla Miq samples(μg/kg)

*means the result below the LOD;PAH4 is the sum of contents of 4 kinds PAHs including BaA,CHR,BbFA and BaP

3 結(jié) 論

本文采用Florisil-皂化-MIP固相萃取柱聯(lián)合凈化技術(shù)，建立了氣相色譜-質(zhì)譜-稀釋同位素內(nèi)標法同時測定益智藥材中16種PAHs的新方法。通過對儀器條件、萃取溶劑、固相萃取小柱及凈化流程的優(yōu)化，極大地降低了基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。在優(yōu)化實驗條件下，該檢測方法在1.0～200.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2均大于0.99。所建立的方法凈化效果良好，能有效降低復(fù)雜樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，方法的靈敏度與準確度高，適用于益智藥材中PAHs的檢測，可參考用于其它植物性中藥材中16種PAHs的測定。