孫細珍,杜佳煒,錢全全,吳平谷
(1.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435100;2.浙江省疾病預(yù)防控制中心, 浙江 杭州 310051)
PAHs的測定屬于痕量分析,監(jiān)測指標較多、理化性質(zhì)差異大、檢測難度較大。已有文獻報道的PAHs檢測方法多集中于土壤、水、空氣以及燒烤食品等方面[13-16],對于中藥材等復(fù)雜基質(zhì)樣品中PAHs殘留量測定方面的研究報道較少。目前PAHs檢測中常用的樣品前處理方法主要有液液萃取技術(shù)、皂化法、凝膠滲透色譜法、固相萃取法、柱凈化-萃取聯(lián)用技術(shù)[17-21]等凈化方法,GB 5009.265-2016《食品安全國家標準 食品中多環(huán)芳烴的測定》中提供的檢測方法不能有效分離苯并[j]熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽,且油脂凈化效果較差[22]。益智藥材因含有大量的揮發(fā)油而導(dǎo)致基質(zhì)復(fù)雜,凈化效果不佳時會嚴重影響目標物的測定重復(fù)性和準確度,因此需要建立一種凈化效果良好、選擇性強、檢出限低的檢測方法監(jiān)測益智藥材中的PAHs。
本文采用液液萃取法提取樣品中的多環(huán)芳烴,通過聯(lián)合使用皂化法和固相萃取法對提取液進行凈化處理,進一步采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)和稀釋同位素內(nèi)標法同時測定益智藥材中的16種多環(huán)芳烴。該方法具有提取效率高、凈化效果好的特點,能有效降低益智藥材中復(fù)雜基質(zhì)對多環(huán)芳烴目標物的干擾,具有較高的選擇性、靈敏度、準確性,已成功應(yīng)用于市售益智藥材中16種多環(huán)芳烴的監(jiān)控篩查。
8批益智藥材購自全國各藥店,編號分別為YZ-1、YZ-2、YZ-3、YZ-4、YZ-5、YZ-6、YZ-7、YZ-8,所有樣品均在陰涼、避光處儲存。
固相萃取凈化柱:二乙烯基苯聚合物+N-丙基乙二胺柱(DVB+PSA,500 mg/6 mL)、弗羅里硅土柱(Florisil,2 000 mg/12 mL)均購自杭州福??萍加邢薰荆环肿佑≯E柱(MIP,500 mg/6 mL)購自上海安譜實驗科技股份有限公司。
PAHs標準溶液的配制:以丙酮-異辛烷(1∶1,體積比)為溶劑,將16種PAHs混標母液稀釋成0.2 mg/L的標準儲備液,7種PAHs同位素內(nèi)標混合溶液稀釋成4 mg/L的內(nèi)標使用液,于4 ℃保存?zhèn)溆茫徊捎帽?異辛烷(1∶1,體積比)稀釋PAHs標準儲備液,制備PAHs的系列標準曲線工作液(1、2、4、10、20、50、100、200 μg/L)。
8890-5977B 氣相色譜質(zhì)譜儀(配EI源with XTR,美國Agilent科技有限公司);SPE-40自動固相萃取儀(天津伯納艾杰爾公司);搖擺式高速粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司);3K15高速離心機(美國Sigma司);PURELAB Ultra超純水機(英國埃爾格公司);EFAA-DC24-RT氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司);SQP千分之一電子天平(德國Sartorius公司);DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm,0.14 μm,美國Agilent科技有限公司)。
取2.0 g益智藥材樣品(過三號篩)于50 mL離心管中,加入10 μL內(nèi)標使用液,加入20 mL乙醇水溶液(1∶1,體積比)溶解后,再以10 mL正己烷超聲提取5 min,在8 000 r/min下離心5 min。提取液先過Florisil柱固相萃取,用5 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1∶4,體積比)洗脫,洗脫液于40 ℃水浴下氮吹至近干,用3 mL 0.3 mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液溶解,加入4 mL水和5 mL正己烷,在8 000 r/min下離心5 min。取有機相過MIP柱進行固相萃取,用5 mL二氯甲烷-乙酸乙酯溶液(1∶1,體積比)進行洗脫,收集洗脫液,在40 ℃水浴中用氮氣緩慢吹干后,準確加入0.2 mL丙酮-異辛烷溶液(1∶1,體積比),供GC-MS測定。樣品前處理過程見圖1。
圖1 供試樣品前處理流程Fig.1 Preprocessing flow for the test samples
色譜條件:DB-EUPAH毛細管色譜柱(20 m×0.18 mm,0.14 μm);進樣口溫度為280 ℃,載氣為高純氦氣(純度為99.999%),流速為0.8 mL/min;升溫程序為初溫80 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升至250 ℃,保持2 min,再以8 ℃/min升至315 ℃,保持5 min,最后以20 ℃/min 升至320 ℃,保持5 min;進樣體積為2 μL,不分流進樣。
質(zhì)譜條件:電離源為EI with XTR源,電子能量為70 eV,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度為150 ℃,傳輸線溫度為280 ℃,溶劑延遲為16.5 min,離子掃描范圍為35~500 u。掃描方式:先采用全掃描模式(SCAN)確定16種PAHs與對應(yīng)內(nèi)標物(ISTD1、ISTD1……、ISTD7)的保留時間及特征離子,然后對目標化合物進行分組,采用選擇離子模式(SIM)掃描,16種PAHs和7種內(nèi)標物的保留時間、特征離子及SIM模式分組信息見表1。
表1 16種多環(huán)芳烴的色譜-質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC-MS parameters for 16 PAHs
應(yīng)用SPSS 22.0對不同樣本之間的最小顯著差異進行單因素分析,α≤0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)差異;使用Origin 8.6對數(shù)據(jù)進行說明。
圖2 16種PAHs混合標準溶液(200 μg/L) 的色譜圖(SIM)Fig.2 Chromatogram of 16 PAHs mixture standard in SIM mode 1.BcFL;2.D12-BaA;3.BaA;4.D12-CHR;5.CHR; 6.CPP;7.MCH;8.D12-BbFA;9.BbFA;10.BkFA; 11.BjFA;12.D12-BaP;13.BaP;14.D12-IP; 15.D14-DBahA;16.IP;17.DBahA; 18.D12-BghiP;19.BghiP;20.DBalP; 21.DBaeP;22.DBaiP;23.DBahP
16種PAHs存在同分異構(gòu)體現(xiàn)象,為獲得良好的分離度和靈敏度,本研究對升溫程序、柱流速、進樣體積等儀器條件進行了優(yōu)化(見“1.4”)。在優(yōu)化條件下,16種PAHs與7種PAHs同位素內(nèi)標物的SIM模式掃描圖如圖2所示。
益智藥材含有大量的揮發(fā)油且化學(xué)成分多樣,而待測的16種PAHs極性范圍寬、結(jié)構(gòu)差異大,通常采用正己烷、二氯甲烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯或其混合物作為提取溶劑[23],為了降低基質(zhì)干擾,本實驗參照文獻[24]考察了正己烷、環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1,體積比)和乙醇-水-正己烷(1∶1∶1,體積比)共3種溶劑體系的提取效果,實驗結(jié)果如圖3所示。從圖中可知,以乙醇-水-正己烷(1∶1∶1,體積比)為提取溶劑時,16種PAHs的提取回收率為85.4%~108%,優(yōu)于另外兩種溶劑體系。因此本實驗選擇乙醇-水-正己烷(1∶1∶1,體積比)作為提取溶劑。
由于益智藥材基質(zhì)復(fù)雜,檢測過程中會產(chǎn)生較大的干擾峰,影響檢測結(jié)果的靈敏度與準確度,因此凈化是PAHs檢測過程中的關(guān)鍵步驟。本實驗分別對比DVB+PSA柱和MIP柱對加標量為10 μg/kg的16種PAHs的凈化效果,結(jié)果如圖4所示。從圖可知,16種PAHs經(jīng)DVB+PSA柱凈化后的回收率為43.5%~123%,在MIP柱的回收率為78.1%~105%。結(jié)果表明DVB+PSA柱對部分PAHs具有基質(zhì)增加效應(yīng),導(dǎo)致回收率過高。因此,本實驗選擇MIP柱作為凈化柱。
圖3 不同提取溶劑對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.3 Effects of different solvents on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq
圖4 不同萃取小柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.4 Effects of different SPE columns on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq
實驗過程中發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)皂化后再采用MIP柱進行凈化處理,樣液顏色較深,不僅對儀器系統(tǒng)產(chǎn)生較大的污染,而且存在一定的基質(zhì)效應(yīng),影響檢測結(jié)果的準確度,因此擬在皂化前增加Florisil凈化步驟。本實驗以益智藥材為研究對象,通過對16種PAHs的加標回收實驗(加標量為10 μg/kg),對在皂化步驟前是否增加Florisil凈化進行考察,實驗結(jié)果如圖5所示。從圖可知,不進行Florisil柱凈化時,16種PAHs的回收率為66.4%~139%。進行Florisil柱凈化時,16種PAHs的回收率為85.4%~108%,且譜圖的雜質(zhì)峰數(shù)量明顯減少,雜質(zhì)響應(yīng)顯著降低。結(jié)果表明增加Florisil固相萃取可以提高凈化效果,獲得更佳的實驗結(jié)果。因此,本研究確定在皂化前先進行Florisil柱固相萃取。
基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物以外的組分對檢測過程有顯著的干擾,并影響分析結(jié)果的準確性。本研究采用Matuszewski等[25]建立的方法評價基質(zhì)效應(yīng),即將同濃度的陰性基質(zhì)標準溶液目標物響應(yīng)值與純?nèi)軇藴嗜芤耗繕宋镯憫?yīng)值進行比較,比值等于1時,表明不存在基質(zhì)效應(yīng);比值大于1時,表明存在基質(zhì)增強作用;比值小于1時,表明存在基質(zhì)抑制作用;比值介于0.8~1.2時,通常認為基質(zhì)效應(yīng)較弱,可以忽略[26]。實驗選取陰性益智藥材試樣,按“1.3”處理后的基質(zhì)樣液分別配制質(zhì)量濃度為50 μg/L和200 μg/L的基質(zhì)混合標準溶液,與同濃度的純?nèi)軇┗旌蠘藴嗜芤哼M行檢測比較。結(jié)果表明,經(jīng)Florisil-皂化-MIP聯(lián)合凈化后的兩種樣品基質(zhì)中,16種PAHs目標物的比值為0.8~1.2,說明本方法的基質(zhì)干擾較小,基質(zhì)效應(yīng)可忽略。
圖5 Florisil凈化柱對益智藥材中16種PAHs回收率的影響Fig.5 Effects of Florisil SPE column on recoveries of 16 PAHs in Alpinia oxyphylla Miq
在優(yōu)化條件下,測定系列混合標準工作液,以各PAHs定量離子與對應(yīng)內(nèi)標物定量離子的峰面積比作縱坐標(y),以相應(yīng)的質(zhì)量濃度比作橫坐標(x,μg/L)繪制標準曲線,得到各PAHs的線性方程。以3倍信噪比(S/N=3)計算儀器檢出限(LOD),結(jié)合前處理條件的稀釋倍數(shù),確定方法的檢出限(LOD,S/N=3)和定量下限(LOQ,S/N=10)。實驗結(jié)果見表2,16種PAHs在1.0~200.0 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.99。4種二苯并芘的LOD為1.0 μg/kg,LOQ為3.0 μg/kg,其它12種PAHs的LOD為0.3 μg/kg,LOQ為1.0 μg/kg。
表2 16種PAHs的線性方程、r2、方法檢出限和定量下限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 16 PAHs
在優(yōu)化條件下,選取益智藥材樣品YZ-4分別進行3個水平(LOQ,2×LOQ,10×LOQ)的加標回收和精密度實驗,以中間添加水平連續(xù)實驗3 d,考察方法的日間精密度。由表3可知,在加標濃度范圍內(nèi),除苯并[c]芴(BcFL)的加標回收率為65.4%~72.8%,日內(nèi)相對標準偏差(RSD,n=6)為6.0%~7.4%,日間RSD(n=6)為8.5%外,其他15種PAHs的加標回收率為89.3%~116%,日內(nèi)RSD(n=6)為0.10%~6.1%,日間RSD(n=6)為1.2%~7.5%。結(jié)果表明,該方法準確可靠,可用于益智藥材中16種PAHs的檢測分析。
表3 16種PAHs的回收率與相對標準偏差Table 3 Determination results of recoveries and RSDs of 16 PAHs
將采集的8個益智藥材樣品(YZ-1~YZ-8),采用本實驗建立的方法測定16種PAHs的含量,結(jié)果如表4所示。從表中可知,8批益智藥材樣品中YZ-7和YZ-8中存在較高的PAHs,YZ-7樣品中BaP含量為9.05 μg/kg,PAH4(BaA、CHR、BbFA、BaP的總含量)為128.66 μg/kg;YZ-8樣品中BaP含量為9.90 μg/kg,PAH4含量為139.61 μg/kg。表明益智藥材中存在較為嚴重的多環(huán)芳烴污染,鑒于所采益智藥材樣品中普遍檢出PAHs化合物,需對益智藥材開展PAHs化合物污染調(diào)查,如干燥方式的風(fēng)險評估等。
表4 8批益智藥材中的PAHs殘留量結(jié)果(μg/kg)Table 4 Detection results of PAHs residues in 8 batches of Alpinia oxyphylla Miq samples(μg/kg)
*means the result below the LOD;PAH4 is the sum of contents of 4 kinds PAHs including BaA,CHR,BbFA and BaP
本文采用Florisil-皂化-MIP固相萃取柱聯(lián)合凈化技術(shù),建立了氣相色譜-質(zhì)譜-稀釋同位素內(nèi)標法同時測定益智藥材中16種PAHs的新方法。通過對儀器條件、萃取溶劑、固相萃取小柱及凈化流程的優(yōu)化,極大地降低了基質(zhì)效應(yīng)對檢測結(jié)果的影響。在優(yōu)化實驗條件下,該檢測方法在1.0~200.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2均大于0.99。所建立的方法凈化效果良好,能有效降低復(fù)雜樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響,方法的靈敏度與準確度高,適用于益智藥材中PAHs的檢測,可參考用于其它植物性中藥材中16種PAHs的測定。