杜欽芝，楊國敏,陳時洪*

(1.重慶市第八中學校，重慶 400030；2.西南大學 化學化工學院,重慶 400715)

多巴胺(DA)作為控制人體新陳代謝、中樞神經(jīng)、心血管、激素和腎系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度水平的變化與諸如阿爾茨海默癥、精神分裂癥、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病直接相關[1-2]?，F(xiàn)已采用多種分析技術來檢測DA，包括比色法[3]、熒光法[4]、表面等離子體共振法[5]、電化學法[6]、光化學分析法[7]等。然而，上述方法操作過程較為復雜，或儀器設備昂貴，或耗時較長。因此建立一種簡便快捷、成本低、靈敏度高、可控性好的分析方法測定DA尤為重要。

近年來，電致化學發(fā)光(ECL)已成為臨床、環(huán)境、藥物及食品等領域的一種常用分析技術。電化學和化學發(fā)光的巧妙結(jié)合，使得ECL具有簡單、快捷、高靈敏及高可控性等優(yōu)點[8-9]?；诖?，ECL可作為DA檢測的理想選擇。如Tian等[10]以釕(Ⅱ)配合物為發(fā)光物質(zhì)構(gòu)建ECL傳感器，借助DA對Ru(Ⅱ)的猝滅作用，實現(xiàn)了對DA的靈敏檢測。Zhao等[11]基于銅納米簇(Cu NCs)構(gòu)建ECL生物傳感器以檢測DA。Wang等[12]設計合成聚合物點(Pdots)，以其為ECL探針用于DA檢測。盡管各種ECL材料用于DA檢測已取得較好效果，但開發(fā)更多的ECL發(fā)光材料，并將其用于DA分析是必要的。

銥(Ⅲ)配合物作為一種新型的ECL發(fā)光材料，因具有化學和光穩(wěn)定性高，偏振光強度高，斯托克斯位移大及可通過調(diào)節(jié)環(huán)金屬配體和輔助配體實現(xiàn)發(fā)光顏色及波長的調(diào)控等優(yōu)點，而受到越來越多的關注[13-15]。但由于Ir(Ⅲ)配合物的水溶性差[16]，因此檢測一般需在乙腈及二甲基亞砜等有毒的有機溶液中進行。例如,Park等[17]以環(huán)金屬銥配合物為ECL發(fā)光體，在乙腈-二甲基亞砜溶液中實現(xiàn)了對硫化氫的檢測。Qian 等[18]制備了銥配合物為ECL探針，在二甲基亞砜-磷酸緩沖溶液中實現(xiàn)對酸性pH值的檢測。Han等[19]設計合成含二茂鐵的環(huán)金屬銥配合物信號探針,在乙醇-磷酸緩沖溶液中檢測次氯酸鹽(ClO-)。Ir(Ⅲ)配合物差的水溶性極大限制了其在生物分析領域中的應用。因此，改善Ir(Ⅲ)配合物的水溶性，以擴展其在ECL領域的應用具有重要價值。目前，以水溶性官能團如磺酸基團、羧基、糖基以及雙環(huán)金屬化水合物將輔助二亞胺配體功能化是提高Ir(Ⅲ)配合物水溶性的常見策略[20-21]。如Kiran等[22]以4,7-二苯基-1，10-菲咯啉二磺酸鹽為配體合成Ir(Ⅲ)配合物，以顯著增加Ir(Ⅲ)配合物在水中的溶解度。Xia等[21]將羧基引入β-乙酰丙酮中并作為輔助配體，合成了水溶性良好的環(huán)金屬化銥(Ⅲ)配合物。但上述方法操作繁瑣，因此有必要尋找一種簡便策略以改善Ir(Ⅲ)配合物的水溶性。

本文將三(2-苯基吡啶)銥(Ⅲ)(Ir(ppy)3)用聚(苯乙烯-馬來酸酐)(PSMA)羧基功能化以合成水溶性銥納米棒(Ir NDs)。在共反應試劑三丙胺(TPrA)存在下，Ir NDs 表現(xiàn)出優(yōu)良的ECL性能。以Ir NDs修飾電極制備傳感器，借助DA對Ir NDs-TPrA體系ECL發(fā)射的高效猝滅作用，實現(xiàn)了對DA的高靈敏檢測。該研究不僅擴展了Ir(Ⅲ)配合物在ECL傳感領域的應用，亦為DA的檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司)；CHI600D型電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；Lambda 17紫外可見光譜儀(美國 PerkinElmer公司)；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國FEI公司)；Talos 200S透射電子顯微鏡(美國FEI公司)；ECL 發(fā)射光譜儀(上海辰華的CHI 760E 與日本東京安道爾公司的Newton EMCCD 光譜檢測器組合)；Escalab 250XiX光電子能譜儀(美國熱電公司)。

三(2-苯基吡啶)銥(Ir(ppy)3)(ADS 染料源公司，加拿大魁北克)；聚(苯乙烯-馬來酸酐)(PSMA，平均分子量為1 700，苯乙烯含量68%)；鹽酸多巴胺(98%)、尿酸(99%，UA)(上海阿拉丁公司)；精氨酸(L-Arg)、甘氨酸(Gly)、葡萄糖(一水)(Glu)、抗壞血酸(AA)(成都市科龍化工有限公司)；去甲腎上腺素(NA，上海麥克林生化科技有限公司)；三丙胺(TPrA，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；四氫呋喃(THF,上海泰坦科技有限公司)；磷酸緩沖溶液(PBS，用0.10 mol/L Na2HPO4，0.10 mol/L KH2PO4和0.10 mol/L KCl配制)；以上試劑均為分析純，實驗過程中均使用超純水。

1.2 Ir NDs的合成

通過納米沉淀法制備Ir NDs：將2.0 mg Ir(ppy)3和1.0 mg PSMA分別溶于2.0 mL和1.0 mL THF中，于室溫下超聲4 h后分別制得質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的儲備溶液A和B。將溶液B注入溶液A中，繼續(xù)超聲2 h后，在超聲處理下將上述混合溶液快速注入20.0 mL水中，隨后在75 ℃下攪拌以除去THF，最終得到0.1 mg/mL的Ir NDs分散液。上述整個超聲過程應避光處理。

1.3 傳感器的構(gòu)建

玻碳電極(GCE，直徑4.0 mm)依次用0.3 μm和 0.05 μm的氧化鋁粉末拋光，再用乙醇和水交替進行超聲清洗。待GCE自然晾干后，在其表面滴涂10.0 μL Ir NDs分散液，室溫下晾干制得傳感器，其制備過程如圖1所示。

圖1 傳感器的制備及響應機理Fig.1 Schematic description of the preparation and response of the ECL biosensor

1.4 檢測方法

采用三電極體系進行測試：修飾的GCE為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。以含有0.75 mmol/L TPrA 的3.0 mL PBS(0.10 mol/L，pH 7.4)為檢測底液，進行ECL信號采集。設置電位掃描范圍為0.0～1.2 V，光電倍增管(PMT)為800 V。在3.0 mL 5.0 mmol/L的鐵氰化鉀溶液(K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6])中進行循環(huán)伏安(CV)及電化學阻抗(EIS)測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ir NDs的表征

以透射電子顯微鏡(TEM)表征Ir NDs的形貌。如圖2A所示，Ir NDs呈現(xiàn)長度為204～1 158 nm的棒狀結(jié)構(gòu)。由長度分布圖(圖2B)可知，Ir NDs的平均長度為543 nm。同時，對Ir NDs的ECL光譜進行測定，可觀察到其在575 nm處發(fā)光(圖2C)。圖2D為Ir(ppy)3和Ir NDs的紅外光譜(IR)。與未羧基化的Ir(ppy)3相比，Ir NDs在1 780.42 cm-1處出現(xiàn)一新的吸收峰，其為—COOH的特征吸收峰。接著，對Ir(ppy)3和Ir NDs的紫外可見光譜(UV-Vis)進行測定，結(jié)果顯示Ir(ppy)3的特征吸收峰位于377 nm，經(jīng)過羧基化后得到的Ir NDs，其吸收峰紅移至388 nm(圖2E)，這可能是因為Ir NDs分子通過π-π 相互作用聚集而引起。最后，測試了Ir NDs的X光電子能譜(XPS)。如圖2F所示，可明顯觀察到Ir4f(61.19 eV)、O1s(532.57 eV)、N1s(399.51 eV) 和 C1s(284.74 eV)的特征峰。以上測試結(jié)果證明Ir(ppy)3已被羧基化而成功制備為Ir NDs。

2.2 傳感器構(gòu)建過程的表征

在5.0 mmol/L鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6])溶液中進行CV及EIS測定，在含0.75 mmol/L TPrA 的PBS(0.10 mol/L，pH 7.4)中進行ECL測試，以對傳感器的構(gòu)建過程進行表征。

CV表征結(jié)果如圖3A所示，裸電極的氧化還原峰電流值較大(曲線a)。當Ir NDs修飾于電極表面后，氧化還原峰電流減小(曲線b)，這是由于納米材料阻礙了氧化還原探針[Fe(CN)6]3-/4-的電子傳遞。EIS表征結(jié)果示于圖3B中?？梢姡汶姌O顯示出小的半圓直徑，說明裸電極上(曲線a)電子傳輸阻力小。Ir NDs修飾電極的EIS曲線的半圓直徑顯著增大，說明氧化還原探針與電極表面之間的電子傳遞受到Ir NDs阻礙，阻抗值增大。綜上，EIS與CV表征結(jié)果一致，表明該生物傳感器已成功制備。

為進一步證明傳感器的成功構(gòu)建，在含有0.75 mmol/L TPrA的PBS緩沖溶液(0.10 mmol/L,pH 7.4)中對傳感器進行ECL測試。如圖4所示，在裸電極(曲線a)上幾乎未檢出任何ECL信號，這是因為此時無發(fā)光物質(zhì)存在。當在電極上修飾 Ir NDs后(Ir NDs/GCE，曲線b)，可在1.2 V處觀察到強的ECL發(fā)射，表明在共反應試劑TPrA存在下，Ir NDs展現(xiàn)出好的ECL性能。為了證明DA對Ir NDs中ECL的猝滅作用，在含有4.0×10-4mol/L DA的底液中，對其ECL信號進行測試。結(jié)果如曲線c所示，傳感器的ECL信號明顯降低。根據(jù)文獻報道[13]，ECL機理可能為：在1.2 V電壓下，Ir NDs被氧化為Ir NDs+·(式1)，TPrA被氧化為TPrA+·(式2)；Ir NDs+·與TPrA+·反應，生成激發(fā)態(tài)的Ir NDs*(式3)；Ir NDs*回到Ir NDs時產(chǎn)生ECL信號(式4)。關于DA猝滅四苯乙炔基共軛微孔聚合物的ECL發(fā)射的機理已有報道[23]，據(jù)此推測，在本體系中，DA的氧化產(chǎn)物如亮多巴胺鉻、多巴胺鉻、5,6-二羥基吲哚和5,6-吲哚醌等與Ir NDs*可發(fā)生能量轉(zhuǎn)移而導致Ir NDs的ECL發(fā)射受到抑制。

圖4 0.75 mmol/L TPrA溶液中，裸GCE(a)及Ir NDs/GCE在加入4.0×10-4 mol/L DA前(b)后 (c)的ECL曲線Fig.4 ECL curves of bare GCE(a),Ir NDs/GCE without(b) and with(c) 4.0×10-4 mol/L DA 0.10 mol/L PBS(pH 7.4) containing 0.75 mmol/L TPrA,scan range:0-1.2 V

(1)

(2)

(3)

(4)

(P代表TPrA的反應產(chǎn)物)

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 TPrA用量的優(yōu)化研究了共反應試劑TPrA濃度對ECL信號強度的影響。在3.0 mL含有不同濃度(0.25、0.50、 0.75、1.00、1.25 mmol/L)TPrA的PBS緩沖溶液(0.10 mol/L,pH 7.4)中，對修飾了10.0 μL Ir NDs分散液的電極的ECL響應進行測試。當TPrA濃度從0.25 mmol/L增加到0.75 mmol/L，Ir NDs修飾電極的ECL信號強度逐漸增大。當濃度達到1.0 mmol/L時，ECL信號強度已超過儀器檢測量程，為確保實驗的準確度，本實驗選擇TPrA的最佳濃度為0.75 mmol/L。

2.3.2 Ir NDs修飾量的優(yōu)化為進一步探究Ir NDs修飾量對生物傳感器ECL信號強度的影響，在3.0 mL含有0.75 mmol/L TPrA的PBS 緩沖溶液(0.10 mol/L,pH 7.4)中，測試了電極在修飾不同量(4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL)Ir NDs情況下的ECL響應。結(jié)果顯示，當Ir NDs修飾量由4.0 μL增至10.0 μL時,Ir NDs的ECL信號強度逐漸增加。當Ir NDs修飾量達到12.0 μL時，ECL信號強度已超出儀器的檢測量程。為保證檢測的準確度，本實驗選擇10.0 μL Ir NDs 作為傳感器的最佳修飾量。

2.4 傳感器對DA的響應

在最佳實驗條件下，探究該生物傳感器對DA的響應情況。如圖5A所示，隨著DA濃度的增加，Ir NDs的ECL強度下降。結(jié)果表明，DA濃度在2.0×10-8～4.0×10-4mol/L范圍內(nèi)，ECL信號與DA濃度的對數(shù)呈良好的線性關系，其線性方程為I=-1 927.9 lgc-2 725.7(I為ECL信號強度，c為DA的濃度)，相關系數(shù)(r)為 0.993 4，檢出限(S/N=3)為6.3×10-9mol/L。將該方法與所報道的其他檢測DA的方法進行比較，如表1所示。本文所構(gòu)建的傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限。

表1 檢測DA的不同方法比較Table 1 Comparisons of different methods for DA detection

2.5 傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及選擇性

為檢測該傳感器的穩(wěn)定性，在3.0 mL含有0.75 mmol/L TPrA和0.2 μmol/L多巴胺的PBS緩沖液中，對所構(gòu)建的傳感器進行測試。連續(xù)掃描10圈，其ECL信號值的相對標準偏差(RSD)為 1.7 %，表明該生物傳感器的穩(wěn)定性良好。為探究該傳感器的重現(xiàn)性，使用同一批次和不同批次制備的4只傳感器對含有4.0×10-4mol/L DA的溶液進行批內(nèi)和批間重復性測試，獲得相應的RSD分別為2.8%和1.4%，表明該傳感器具有良好的重復性。為評估該傳感器的選擇性，以葡萄糖(Glu)、尿酸(UA)、抗壞血酸(AA)、精氨酸(L-Arg)、甘氨酸(Gly)、K+和去甲腎上腺素(NA)為干擾物質(zhì)，控制干擾物質(zhì)的濃度為2.0 μmol/L(為DA濃度的10倍)，測試了傳感器的選擇性。結(jié)果如圖5B所示，除NA以外，其余物質(zhì)對DA的響應無干擾，其ECL響應幾乎與空白值相同。而0.2 μmol/L DA存在時，ECL響應顯著下降。實驗結(jié)果表明，該傳感器對NA與DA均具有好的響應，而對測試的其余物質(zhì)無響應，可能的原因在于：(1)NA與DA結(jié)構(gòu)相似，均屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)易被氧化成苯醌，對Ir NDs信號起到猝滅作用；(2)Ir NDs被羧基功能化，帶負電荷，可以通過靜電作用吸附帶正電的DA與NA，利于傳感器對二者的ECL響應。

表2 人體血清中DA的回收率Table 2 Recoveries of DA in human serum samples

2.6 實際樣品的檢測

為評估所構(gòu)建的ECL傳感器的實際應用能力，對人體血清樣品進行加標回收。在稀釋了50倍的人體血清樣品中分別加入4.00、 20.0、 100 μmol/L的DA，并用所構(gòu)建的ECL傳感器進行檢測。測定結(jié)果如表2所示，實際樣品的回收率為97.5%～106%，3次測定的RSD均在5.0%以內(nèi)。表明該傳感器具有良好的實際應用潛力。

3 結(jié) 論

本文采用PSMA將Ir(ppy)3羧基功能化以制備具有優(yōu)良ECL性能的水溶性Ir NDs，并基于Ir NDs構(gòu)建ECL生物傳感器，借助DA對Ir NDs-TPrA體系 ECL信號的高效猝滅作用實現(xiàn)了對DA的高靈敏檢測。羧基功能化的Ir NDs為銥(Ⅲ)配合物在ECL領域的應用提供了理想的平臺，也為DA的檢測提供了新方法。