盧 瑤，牛衛(wèi)東，徐 瑾，李玉林，王繼創(chuàng)， 李永偉，張 恒，王云龍,7,1*

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000;2.河南省生物技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450000； 3.鄭州市疾病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450000；4.河南省疾病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450000； 5.河南中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；6.河南省職工醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 7.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450000)

2019年12月以來，武漢市部分醫(yī)院相繼報告了多例無法解釋的肺炎。由于春節(jié)期間人口流動性很高，2020年1月該肺炎迅速傳播到整個中國[1]，同時證實其是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2，以前稱為2019-nCoV)引起的急性呼吸道疾病[2]，并被命名為新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)。2020年1月30日，世界衛(wèi)生組織(WHO)正式宣布COVID-19已經(jīng)成為國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件[3]。到目前為止，這種疾病已經(jīng)迅速傳播到中國的其他地區(qū)和66個國家。在中國新病例數(shù)量有所減少的情況下，美國、意大利和西班牙在內(nèi)的其他國家的新病例卻呈指數(shù)增長[4]。傳染源主要是SARS-CoV-2感染患者，包括無癥狀感染者。該疾病的傳播途徑主要為直接傳播、氣溶膠傳播和接觸傳播[5-6]。SARS-CoV-2感染患者通常表現(xiàn)為肺炎樣癥狀(發(fā)熱、干咳和呼吸困難等)和腹瀉等胃腸道癥狀，其次為嚴(yán)重急性期呼吸道感染，部分病例會出現(xiàn)急性呼吸窘迫癥合并嚴(yán)重呼吸道并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致死亡[7-8]。至今已研發(fā)出多種針對COVID-19的疫苗，但仍沒有特定的藥物治療方案出現(xiàn)，早期診斷并及時管控，是阻止疫情進(jìn)一步散播的關(guān)鍵[9]。因此，加強疫情監(jiān)控，及時篩查并確診SARS-CoV-2感染者是疫情防控的首要任務(wù)[10]。

目前對COVID-19患者的檢測主要采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法、化學(xué)發(fā)光法以及膠體金法。熒光定量PCR法檢測人體內(nèi)提取出的核酸時靈敏度較低，容易出現(xiàn)假陰性，同時由于此類方法的檢測時間長，對于檢測環(huán)境的要求高，不宜于基層醫(yī)院普及[11]；化學(xué)發(fā)光法和膠體金法方便快速，成本低，應(yīng)用范圍廣，技術(shù)難度系數(shù)相對較低，但存在靈敏度較低等局限[12]。近年來熒光層析免疫技術(shù)不斷成熟，該技術(shù)操作簡便、易自動化，可有效排除非特異熒光的干擾，分析靈敏度有了很大提高[13]。

SARS-CoV-2核衣殼(N)蛋白是一種豐富的RNA結(jié)合蛋白，可在病毒的生命周期中發(fā)揮多種作用[14]。N蛋白相對保守，在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，感染早期機體即能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體。目前已在確認(rèn)的COVID-19患者稀釋度不同的血清中檢測到針對N蛋白的IgG和IgM抗體存在，該結(jié)果進(jìn)一步證實可以利用N蛋白建立快速檢測 SARS-CoV-2 的血清抗體方法[15]。但靶向保守的 N1b 和 N2b 結(jié)構(gòu)域的患者抗體可能與相關(guān)冠狀病毒如SARS-CoV的核衣殼發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性較低[16]。河南省生物工程技術(shù)研究中心制備的截短N蛋白(NC蛋白)截取了SARS-CoV-2 N蛋白C末端301～419的119個氨基酸對應(yīng)片段，相較于N 蛋白的全長片段(NF蛋白)具有較強的特異性。因此可基于這兩種蛋白進(jìn)行研究，根據(jù)配對檢測結(jié)果選擇較優(yōu)組合。

本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗體熒光免疫層析檢測方法，通過對其精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行評價，配合相應(yīng)的熒光分析儀，實現(xiàn)了人體內(nèi)SARS-CoV-2抗體水平的評價。整套系統(tǒng)操作簡便，成本低廉，能夠在15 min內(nèi)即時完成檢測，大大降低了檢測時間，可有效提升復(fù)工復(fù)學(xué)群體的檢測效率。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

熒光微球(FMs,美國Bangs Lab公司)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)(中國Aladdin公司)，2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物(MES)緩沖液、樣品稀釋液、包被液、微球保護(hù)液、微球封閉液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BL21(DE3)/pET21b-NC菌株、SARS-CoV-2陰性樣本和免疫NC抗原兩周的兔血清(中國河南省生物工程技術(shù)研究中心)。

PVC板和吸水紙(中國通成紙業(yè))，玻璃纖維素膜(中國JY Biotech公司)，XYZ三維點膜噴金儀和微電腦自動斬切機(中國上海金標(biāo)生物科技有限公司)，熒光免疫層析讀數(shù)儀(中國杭州峰航科技有限公司)，高電流電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗原理

本實驗采用雙抗夾心法檢測血清中SARS-CoV-2抗體的水平。將待測血清和樣本稀釋液按照一定比例混合后加入加樣孔中，血清中的SARS-CoV-2抗體會和結(jié)合墊上的熒光標(biāo)記抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，并通過毛細(xì)作用沿著液體層析方向移動，隨后通過層析作用逐漸在硝酸纖維素膜(NC膜)上移動，最后被固定在檢測線(T線)上的包被抗原特異性地捕獲，形成抗原-抗體-抗原復(fù)合物，而鼠IgG繼續(xù)移動與質(zhì)控線(C線)上的羊抗鼠IgG抗體結(jié)合。其原理如圖1所示。當(dāng)檢測卡插入熒光檢測儀后，儀器自動讀取檢測卡上T線和C線的熒光信號強度，T/C值可表示待測血清中SARS-CoV-2抗體的水平[17]。

圖1 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條原理圖Fig.1 The schematic diagram of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip FMs-(labeled antigen) FMs-(mouse IgG) Coated antigen Goat-anti-mouse IgG SARS-CoV-2 antibody FMs-(labeled antigen)-(SARS-CoV-2 antibody) FMs-(labeled antigen)-(SARS-CoV-2 antibody)(coated antigen) FMs-(mouse IgG)-(goat-anti-mouse IgG)

1.3 NC蛋白的制備及純化

1∶100接種菌株BL21(DE3)/pET21b-NC于1.2 L Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基中(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)至OD600 nm≈0.8～1.2。溫度降至16 ℃后，加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.2 mmol/L并誘導(dǎo)20 h，8 000 r/min離心10 min收集菌體，20 mmol/L Tris(pH 8.0，300 mmol/L NaCl)緩沖液重懸菌體，超聲破碎(250 W，超聲3 s，間隙3 s)20 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，濾紙過濾后上樣Ni2+親和層析柱。

1.4 熒光微球活化

取1%固含量的200 nm熒光微球40 μL于1.5 mL離心管中，加入1 mL純化水后在15 000 r/min條件下離心15 min。棄上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)緩沖液振蕩混勻，再加入10 mg/mL EDC溶液30 μL，振蕩混勻，繼續(xù)加入20 mg/mL NHS溶液80 μL，水浴超聲 120 s混勻。將其置于臺式恒溫振蕩器中避光活化30 min，然后在15 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)緩沖液，超聲混勻。

1.5 熒光微球偶聯(lián)物的制備

在上述溶液中加入待標(biāo)記抗原30 μg振蕩混勻，避光條件下偶聯(lián)1 h，繼續(xù)加入20 μg鼠IgG，避光條件下偶聯(lián)1 h。偶聯(lián)完成后，于15 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，加入封閉液1 mL，超聲混勻避光條件下封閉1 h。封閉完成的熒光微球于15 000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，加入微球保護(hù)液1 mL，超聲混勻。

1.6 試紙條的制備

將包被抗原和羊抗鼠IgG噴于硝酸纖維素膜的T線和C線上，質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL，兩帶間隔4 mm，置于真空干燥箱中抽真空干燥2 h。將制備的熒光微球偶聯(lián)物稀釋后用XYZ噴金劃膜儀噴涂于結(jié)合墊上，置真空干燥箱中抽真空干燥5 h。將樣品墊、結(jié)合墊以及吸水紙按照一定順序組裝在PVC板上，使用微電腦自動斬切機將組裝好的PVC板切成寬度為3.9 mm的試紙條(試紙條結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示)，將試紙條裝入特定的塑料檢測卡中，以壓卡機壓緊檢測卡上下蓋，置于干燥房待用。

圖2 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Structural diagram of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

1.7 試紙條的檢測

在室溫下將待測血清和樣本稀釋液按照一定比例混合，用移液器吸取80 μL稀釋后的血清，垂直懸空緩慢加入到樣品墊上，15 min后在熒光免疫層析讀數(shù)儀上進(jìn)行檢測，讀取對應(yīng)的T、C值。無論樣品中是否含有SARS-CoV-2抗體，C 線都應(yīng)出現(xiàn)熒光條帶，否則試紙條檢測結(jié)果判定為無效。試紙條檢測結(jié)果示意圖如圖3所示[18]。

圖3 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條檢測結(jié)果示意圖Fig.3 Schematic diagram of detection results by SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

圖4 NC蛋白的SDS-PAGE鑒定結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE analysis of NC protein M.protein molecular weight marker ;1.BL21(DE3)/pET21b-NC non-inducted;2.BL21(DE3)/pET21b-NC inducted with IPTG for overnight;3.purified NC protein

2 結(jié)果與討論

2.1 NC蛋白的制備及純化

本實驗在對重組菌株BL21(DE3)/pET21b-NC進(jìn)行培養(yǎng)后，使用鎳親和層析法純化蛋白，以含100 mmol/L咪唑的20 mmol/L Tris(pH 8.0，300 mmol/L NaCl)緩沖液洗滌雜蛋白，含300 mmol/L咪唑上述Tris的緩沖液洗脫目的蛋白。20 mmol/L Tris(pH 8.0)緩沖液透析目的蛋白除去咪唑和NaCl后，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定，結(jié)果見圖4。純化后得到了單一的目的條帶，大小約13 kD。

2.2 配對抗原篩選

本實驗選擇NF蛋白以及NC蛋白進(jìn)行配對組合，使用時間分辨免疫層析法對其陰性和陽性進(jìn)行評價，綜合篩選出較優(yōu)抗原配對組合。抗原配對方式為兩組，均選擇NF蛋白作為包被抗原，a組使用NF標(biāo)記，b組使用NC標(biāo)記，按照“1.4”、“1.5”以及“1.6”中的方法制備試紙條。

將兔血清稀釋10、20、40、80、160倍，并編號為P1、P2、P3、P4、P5，使用研制的試劑卡進(jìn)行檢測，T值大于1 000，且T/C大于0.1即為符合要求；同時設(shè)置平行組，并在此基礎(chǔ)上使用樣本稀釋液對兔血清進(jìn)行稀釋，直至檢測結(jié)果不符合陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表2。a組(NF包被，NF標(biāo)記)P3(血清稀釋至40倍時)樣品的T值仍大于1 000，且T/C大于0.1，P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值小于1 000，不符合陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)；b組(NF包被，NC標(biāo)記)P4(血清稀釋至80倍)樣品的T值仍大于1 000，且T/C大于0.1，P5(稀釋至160倍)樣品的T值小于1 000，不符合陽性檢測標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，b組的靈敏度優(yōu)于a組。綜合陰性和陽性檢測結(jié)果，選擇b組(NF包被，NC標(biāo)記)抗原配對組合進(jìn)行性能檢測。

表1 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條陰性檢測結(jié)果Table 1 Negative detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

表2 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條陽性檢測結(jié)果Table 2 Positive detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.3 精密度實驗

本實驗選擇N2、N15、P1、P3以及P5 5份樣本，分別對同批次試紙條進(jìn)行批內(nèi)精密度檢測，再分別對3個不同批次的試紙條進(jìn)行批間精密度檢測，每個待檢樣本重復(fù)檢測10次。計算每個待檢樣本的CV值，對批內(nèi)和批間精密度進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。批內(nèi)各樣品T/C值的CV范圍為3.48%～10.05%；批間各樣品T/C值的CV范圍為4.77%～11.73%。批內(nèi)以及批間的CV均小于15%，在允許范圍之內(nèi)。

表3 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條批內(nèi)及批間精密性檢測結(jié)果Table 3 Intra-assay and inter-assay precision of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

表4 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條特異性檢測結(jié)果Table 4 Specificity detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.4 特異性實驗

根據(jù)《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊技術(shù)審評要點》選擇肺炎支原體、甲型流感病毒、乙型流感病毒以及EB病毒陽性血清各3份，每份血清使用本實驗構(gòu)建的試紙條重復(fù)檢測5次。另外檢測3份陰性對照血清，重復(fù)5次，分析其特異性。結(jié)果見表4，所有4種病毒陽性的血清以及陰性對照血清的檢測結(jié)果均為陰性，說明該試紙條有良好的特異性。

圖5 SARS-CoV-2熒光免疫層析試紙條穩(wěn)定性實驗結(jié)果Fig.5 Stability detection results of SARS-CoV-2 fluorescent immunochromatographic strip

2.5 加速穩(wěn)定性實驗

將試紙條與干燥劑一起放入鋁箔袋中密封后，置于37 ℃干燥箱中保存。分別在3、6、9、12、15、18、21 d時取出，于常溫環(huán)境中檢測。每個待檢樣本平行測定 3 次取平均值，樣本稀釋液4 ℃保存，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見圖5。試紙條在37 ℃干燥箱保存3、6、9、12、15、18、21 d 后，T值與放入當(dāng)天相比變化均在15%以內(nèi)，說明其穩(wěn)定性良好，可在37 ℃條件下保存21 d。

2.6 方法學(xué)對比

隨機抽取本實驗制備的37個試紙條與廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)的新型冠狀病毒抗體檢測試劑盒(膠體金法)同時對37份COVID-19患病者血清進(jìn)行檢測；并使用兩種方法檢測118例非COVID-19患病者血清，其中其他發(fā)熱伴呼吸道癥狀病例為76份，計算其符合率，結(jié)果見表5。兩種方法的總符合率為96.13%，陽性符合率為90.63%，陰性符合率為97.56%。表明兩種方法之間的相關(guān)性良好，本文所研制的試紙條具有一定的商用價值。

表5 研制試紙條和膠體金法試劑盒方法學(xué)對比結(jié)果Table 5 Comparative evaluation results of developed strip and immunological gold-labeled kit

3 結(jié) 論

本實驗基于截短新型冠狀病毒N蛋白開發(fā)的熒光免疫層析試紙條能夠快速評價體內(nèi)SARS-Cov-2抗體水平，批內(nèi)和批間的精密性均小于15%，可37 ℃條件下穩(wěn)定保存21 d，不需要龐大的人力物力，有效節(jié)約了資源，有利于基層單位新型冠狀肺炎的檢測，對疫情的防控也具有一定的現(xiàn)實意義。但該方法也存在一定的局限性，一方面，抗體的產(chǎn)生需要一定的時間，新型冠狀病毒肺炎在潛伏期時體內(nèi)并未產(chǎn)生抗體；另一方面，不同個體間感染病毒后抗體出現(xiàn)的時間也存在差異，因此該方法無法排除潛伏期和感染初期患者。