陳 超，潘佳釧，劉舒芹，郭鵬然*

(1.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心) 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070;2.廣東省科學(xué)院測試分析研究所(中國廣州分析測試中心) 廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程 技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070)

百草枯(1,1′-二甲基-4,4′-聯(lián)吡啶二氯鹽，Paraquat)和敵草快(1,1′-亞乙基-2,2′-聯(lián)吡啶二溴鹽，Diquat)均為聯(lián)吡啶類陽離子季銨鹽，具有高水溶性和低揮發(fā)性，屬于非選擇性觸殺滅生型除草劑，因價(jià)格低廉，在全球范圍內(nèi)被廣泛使用。由于百草枯和敵草快對人和動(dòng)物具有很強(qiáng)的毒性[1-2]，因此它們在農(nóng)業(yè)中的廣泛使用引起了人們對其在食品中殘留問題的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)長期接觸百草枯會(huì)增加帕金森病(PD)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，因此其也被認(rèn)為是帕金森病的環(huán)境危險(xiǎn)因素之一[3]。我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763-2016)對蔬菜和水果中百草枯和敵草快殘留均有明確限量要求，其中百草枯的最大殘留限量為0.01～0.2 mg/kg，敵草快為0.01～0.1 mg/kg[4]。

目前，已被報(bào)道用于水果蔬菜中百草枯和敵草快含量測定的方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)[5-7]、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)[8]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法(SERS)[9-10]、液相色譜法(HPLC)[11]和電化學(xué)法(EIS)[12-13]等。但這些方法大部分需要對蔬菜提取液進(jìn)行凈化處理，無法實(shí)現(xiàn)快速、高通量篩查。而基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)分析技術(shù)因樣品分散在固體基質(zhì)中，能更有效地吸收激光能量，利用紫外或紅外激光的脈沖輻射將待測物快速解析/電離成帶正電荷或負(fù)電荷的離子[14]，可實(shí)現(xiàn)樣品的快速、高通量分析。

傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR-MS)則具有超高分辨率、靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)，將MALDI與FTICR-MS聯(lián)用，具有分析速度快、耐鹽度好等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。鑒于此，本研究建立了一種利用MALDI-FTICR-MS測定蔬菜中百草枯和敵草快的方法，樣品用含1%甲酸的乙腈溶液提取后，與MALDI基質(zhì)混合即可直接進(jìn)樣分析，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品無需凈化，提取后即可直接快速測定樣品中微量的百草枯和敵草快，有效填補(bǔ)了蔬菜中百草枯和敵草快快速高通量篩查檢測研究的空白。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

配有基質(zhì)輔助激光解吸電離源的Solarix XR 7.0 T傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(MALDI-FTICR-MS，德國Bruker公司)，配Smartbeam Ⅱ型固態(tài)激光器，最大能量300 μJ，頻率在 0～1 kHz 內(nèi)可調(diào)，波長為355 nm；數(shù)據(jù)處理軟件(DataAnalysis 5.0，德國 Bruker 公司)；BSA224S 型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；H1850型離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；HR2534手持?jǐn)嚢枇侠頇C(jī)(飛利浦中國投資有限公司)；JP-060S 型超聲波清洗機(jī)(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；VORTEX 1型旋渦混合器(德國IKA公司)。

百草枯(純度為82.4%)、百草枯-D8(純度為95.9%)、敵草快(純度為96.4%)、敵草快-D4(純度為93.4%)標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr Ehrenstorfer公司；2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB，德國Bruker公司)；α-氰基-4-羥基肉桂酸和芥子酸(CHCA和SA，美國Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，美國Honeywell公司)；甲酸(LC-MS級，美國Thermo Fisher Scientific公司)；三氟乙酸鈉校準(zhǔn)溶液(NaTFA，美國Sigma-Aldrich公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水系統(tǒng)制備的超純水；蔬菜樣品均為當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取適量(精確至0.000 1 g)百草枯、敵草快、百草枯-D8和敵草快-D4標(biāo)準(zhǔn)品，用純水溶解并定容，分別配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲(chǔ)備液，置于塑料瓶中于-20 ℃保存。用溶劑或不同基質(zhì)溶液分別配制含百草枯和敵草快質(zhì)量濃度為5、10、20、50、100、200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；用乙腈-0.2%甲酸水溶液(體積比1∶1)將百草枯-D8儲(chǔ)備液和敵草快-D4儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為100 μg/L的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.3 樣品制備

1.3.1 提 取取250 g蔬菜樣品，用手持?jǐn)嚢枇侠頇C(jī)直接勻漿，精密稱取1 g(精確至0.001 g)于10 mL塑料離心管中，加入4 mL含1%甲酸的乙腈溶液混勻后，超聲10 min，再渦旋1 min，在室溫下以5 000 r/min離心5 min，取上清液定容至5 mL，混勻后備用。

1.3.2 點(diǎn) 樣取10 μL上清液與10 μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液(100 μg/L)及20 μL CHCA(2 g/L，用30%乙腈水溶液配制)溶液混合均勻，準(zhǔn)確量取3 μL該混合液點(diǎn)于MALDI靶板上，待液滴自然晾干(需等待5～10 min)形成均勻結(jié)晶層后進(jìn)樣分析。

1.4 質(zhì)譜條件

在正離子模式下采用MALDI源，質(zhì)量采集范圍為m/z50～300，采樣大小為2 M，累加次數(shù)為8，Skimmer(錐孔電壓)為40 V；激光能量為40%，頻率為100 Hz，激光點(diǎn)數(shù)為100 Shots，光斑為Medium，激光路徑為Random。數(shù)據(jù)采集前，在ESI離子源模式下采用0.01 g/L三氟乙酸鈉溶液(用50%乙腈水溶液配制)進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；數(shù)據(jù)采集過程中鎖定百草枯-D8內(nèi)標(biāo)離子m/z194.165 36進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，以保證數(shù)據(jù)采集中質(zhì)量軸的準(zhǔn)確性。定性分析離子對：百草枯m/z186.115 15 → 171.091 67，敵草快m/z184.099 50 → 183.091 67；百草枯和敵草快的定量離子分別為m/z186.115 15和m/z184.099 50，內(nèi)標(biāo)法定量(百草枯-D8和敵草快-D4參與計(jì)算的離子峰分別為m/z194.165 36和188.124 61)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MALDI基質(zhì)類型與濃度的選擇

前期實(shí)驗(yàn)[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MALDI基質(zhì)濃度選用10 g/L時(shí)，2,5-DHB和CHCA比SA更適用于百草枯測定時(shí)的輔助電離基質(zhì)，而2,5-DHB可使方法檢出限更低，這是因?yàn)樵诖藵舛认翪HCA的結(jié)晶層很厚，影響了待測物的激發(fā)。由于2,5-DHB和CHCA對聯(lián)吡啶類化合物均有較強(qiáng)輔助電離作用[17]，本研究對比了低濃度2,5-DHB 和CHCA對百草枯和敵草快響應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)2,5-DHB的質(zhì)量濃度低于10 g/L點(diǎn)樣時(shí)，形成的結(jié)晶層太薄且不均勻，易產(chǎn)生“甜點(diǎn)效應(yīng)”(由于基質(zhì)-分子的共結(jié)晶不均勻，以及樣品溶液晾干時(shí)的咖啡環(huán)效應(yīng)，分子在基底上分布極其不均勻，產(chǎn)生分子聚集，使得檢測時(shí)點(diǎn)與點(diǎn)之間信號(hào)差異特別大，導(dǎo)致信號(hào)很強(qiáng)的區(qū)域被稱之為“甜點(diǎn)”；這種分子分布不均勻最終導(dǎo)致選點(diǎn)時(shí)存在偶然性以及主觀性，不能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的分析)[18]；而CHCA的質(zhì)量濃度為1 g/L時(shí)仍能形成均勻的結(jié)晶層，且百草枯和敵草快的響應(yīng)比采用10 g/L時(shí)的2,5-DHB高5倍，因此實(shí)驗(yàn)選擇CHCA為輔助電離基質(zhì)。

本研究按“1.3”進(jìn)行樣品提取及點(diǎn)樣，考察不同濃度CHCA分別與純標(biāo)準(zhǔn)溶液(用空白溶劑配制，100 μg/L)和樣品基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(小白菜提取液，100 μg/L)等比例混合點(diǎn)樣后的分析結(jié)果(圖1)。由圖可見，純標(biāo)準(zhǔn)溶液與1 g/L CHCA混合后點(diǎn)樣得到的百草枯和敵草快的響應(yīng)最高，而樣品基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在2 g/L CHCA中信號(hào)強(qiáng)度最高，與純標(biāo)液和樣品基質(zhì)配制的標(biāo)液響應(yīng)相近，且重復(fù)6次點(diǎn)樣測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.6%和4.8%，檢出限滿足檢測要求[19]。故本方法最終選擇質(zhì)量濃度為2 g/L的CHCA為MALDI基質(zhì)輔助用于樣品中百草枯和敵草快的電離。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本研究在前期實(shí)驗(yàn)[16]的質(zhì)譜條件下進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)用2 g/L CHCA為MALDI基質(zhì)時(shí)，儀器激光能量和Skimmer電壓分別提高至40%和40 V，且儀器未出現(xiàn)質(zhì)量軸偏移的情況。在此質(zhì)譜條件下，百草枯和敵草快產(chǎn)生3種類型的離子峰：百草枯m/z186.115 15、185.107 32和171.091 67，敵草快m/z184.099 50、183.091 67和157.076 02，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。每種待測物選取一對響應(yīng)高的離子峰作為定性分析的離子對，并以其中響應(yīng)最高的離子峰作為定量離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見“1.4”。

2.3 提取條件的選擇

百草枯和敵草快均為堿性陽離子型化合物，易溶于酸性水溶液而不溶于有機(jī)試劑[21]。在提取條件優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)由于新鮮蔬菜的水分含量一般大于50%，若提取溶劑中水的比例過高或提取的物質(zhì)濃度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致百草枯和敵草快的質(zhì)譜峰響應(yīng)低且加標(biāo)回收率均低于50%。同時(shí)，觀察到MALDI靶板上的點(diǎn)樣點(diǎn)形成的結(jié)晶層很厚且不均勻，這可能是因?yàn)楦弑壤畷?huì)從樣品中提取出大量糖類物質(zhì)，從而形成緊密的類似膠狀物的結(jié)晶層，使得待測物分散的不夠均勻，且激光無法穿透過厚的樣品層，影響待測物的離子化效率。參考文獻(xiàn)報(bào)道[6,21]，分別選取乙腈-0.2%甲酸水溶液(1∶1)、含0.2%甲酸的乙腈溶液、含1%甲酸的乙腈溶液和含5%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑，按“1.3”方法對空白小白菜進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(加標(biāo)量為100 μg/L)。結(jié)果顯示，采用含1%甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時(shí)的加標(biāo)回收率最高，故最終選擇含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性與基質(zhì)效應(yīng)的評價(jià)選取7種空白蔬菜(冬瓜、黃瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜、生菜)在優(yōu)化條件下提取和點(diǎn)樣分析，采用精確分子量對應(yīng)的質(zhì)譜峰強(qiáng)度定量，發(fā)現(xiàn)百草枯、敵草快及其內(nèi)標(biāo)在7種空白蔬菜樣品中定量定性離子峰位置均無干擾離子峰，專屬性符合要求。

實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects,ME)，其計(jì)算公式為ME=Ka/Kb，其中Ka為樣品基質(zhì)的校準(zhǔn)曲線斜率，Kb為溶劑校準(zhǔn)曲線的斜率。若ME=100%表明無基質(zhì)效應(yīng)，ME為80%～120%為弱基質(zhì)效應(yīng)，50%150%表示基質(zhì)效應(yīng)強(qiáng)[22]。由表1數(shù)據(jù)可知，7種蔬菜的ME均在80%～120%，表示雖然存在一定程度的基質(zhì)效應(yīng)，但影響不明顯，因此可直接采用空白溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2.4.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限以百草枯和敵草快的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，μg/L)，對應(yīng)待測物的定量離子與內(nèi)標(biāo)離子峰強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，8種基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液在2～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(r)為0.997 2～0.999 6(表1)。以3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算得百草枯和敵草快在7種蔬菜基質(zhì)中的檢出限(LOD)分別為1.0～1.5 μg/kg和5.0～7.5 μg/kg，定量下限(LOQ，S/N=10)分別為3.0～4.5 μg/kg和15～23 μg/kg。本方法的檢出限和定量下限雖遜于文獻(xiàn)報(bào)道的LC-MS法[5-6]，但已可滿足主要蔬菜品種中百草枯和敵草快的國家標(biāo)準(zhǔn)限量要求[1]，同時(shí)也滿足標(biāo)準(zhǔn)SN/T 0293-2014[19]中的檢出限(百草枯和敵草快的檢出限均為10 μg/kg)要求。

表1 敵草快和百草枯在不同基質(zhì)溶液中的基質(zhì)效應(yīng)(ME)、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 1 Matrix effects(ME),linear ranges,linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of diquat and paraquat in different matrix solution

2.4.3 準(zhǔn)確度與精密度分別以上述7種蔬菜空白樣品，進(jìn)行低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，按“1.3”方法進(jìn)行樣品制備，每個(gè)濃度設(shè)6組平行實(shí)驗(yàn)，其準(zhǔn)確度與精密度結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，百草枯和敵草快在7種蔬菜中的回收率分別為73.0%～109%和81.7%～117%，RSD分別為1.0%～8.2%和1.0%～7.0%，表明方法的回收率和精密度均能滿足相關(guān)檢測要求。

表2 敵草快和百草枯在7種蔬菜中的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSD) of Paraquat diquat and paraquat in vegatables (n=6)

圖2 韭菜中添加百草枯和敵草快(100 μg/kg)的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of paraquat and diquat spiked in garlic chives (100 μg/kg)

2.5 實(shí)際樣品測定

采用本文建立的方法對當(dāng)?shù)厥袌鲭S機(jī)購買的7種蔬菜共14份樣品中百草枯和敵草快進(jìn)行快速檢測，其中冬瓜、黃瓜、小白菜、上海青、韭菜、芹菜和生菜各2份，均未檢出百草枯和敵草快。圖2為韭菜基質(zhì)中添加100 μg/kg百草枯和敵草快的質(zhì)譜圖。

3 結(jié) 論

本研究以含1%甲酸的乙腈溶液為提取溶劑，建立了蔬菜中百草枯和敵草快的MALDI-FTICR-MS檢測方法，該方法于在30 min內(nèi)即可獲得測樣結(jié)果，具有操作簡單、分析速度快和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品無需經(jīng)過凈化處理，提取后即可直接快速測定樣品中痕量的百草枯和敵草快，有望實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣品中百草枯和敵草快的快速、高通量、高靈敏分析和檢測。