謝桂芳，蘇本超，謝曉霞，孫志昶，陳 奇，曹宏梅，劉 星

(海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228)

1 點(diǎn)擊化學(xué)簡介

點(diǎn)擊化學(xué)(Click chemistry)由化學(xué)家Sharpless于2001年首次提出[1]，又叫“鏈接化學(xué)”、“速配接合組合化學(xué)”，是一種新型合成方法，其核心是通過一系列可靠高效又具有選擇性及模塊化的化學(xué)反應(yīng)生成含雜原子的化合物，從而實(shí)現(xiàn)碳雜原子的連接(C—X—C)，突破傳統(tǒng)化學(xué)合成方法的制約。

點(diǎn)擊化學(xué)通常具有以下特征：反應(yīng)模塊化，可與其他反應(yīng)組合；無有毒有害等副產(chǎn)物；反應(yīng)效率高，接近定量；反應(yīng)條件溫和，對(duì)水和氧氣不敏感；立體選擇性好；實(shí)驗(yàn)原料易得等。鑒于以上優(yōu)勢，點(diǎn)擊化學(xué)已成為目前的熱門研究領(lǐng)域之一，并在材料科學(xué)和合成領(lǐng)域得到了大量的應(yīng)用[2-5]。

原位點(diǎn)擊化學(xué)(In situ click chemistry)[6]是目前點(diǎn)擊化學(xué)在合成和其他應(yīng)用中的常見方法。在合成過程中，參與點(diǎn)擊反應(yīng)的物質(zhì)均在溶液中生成，無需進(jìn)行分離提純，只需向反應(yīng)液中加入另一種能與之發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)的試劑即可，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，也在一定程度上提高了反應(yīng)速率。將原位點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用于合成類天然產(chǎn)物的研究中，以酶為反應(yīng)模板，選擇性地連接各模塊組分，可發(fā)現(xiàn)各種酶的高親和力抑制劑[7-9]。Bhardwaj等[10]以環(huán)氧合酶2為反應(yīng)容器，將疊氮基標(biāo)記的吡唑(5、14、27和31)和芳基乙炔進(jìn)行成對(duì)孵育，鑒定出18和21號(hào)為環(huán)氧合酶2的特異性抑制劑。與臨床使用的抗炎藥相比，化合物18和21表現(xiàn)出優(yōu)異的體內(nèi)抗炎活性。Hirose 等[11]利用生理?xiàng)l件下的惰性反應(yīng)物進(jìn)行不可逆的靶標(biāo)導(dǎo)向合成，生成了高親和的抑制劑。通過含疊氮化物Nω-甲基氨基甲酰基-L-精氨酸與乙炔庫之間的特異性偶極環(huán)加成反應(yīng)，篩選出高親和力的幾丁質(zhì)酶抑制劑，為進(jìn)一步開發(fā)抑菌性藥物提供了理論基礎(chǔ)。此外，原位點(diǎn)擊化學(xué)也被應(yīng)用于體內(nèi)腫瘤靶向治療[12]、抗HIV病毒因子的篩選[13]、抗體合成[14]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

隨著各學(xué)科間的交叉融合，檢測技術(shù)與點(diǎn)擊化學(xué)聯(lián)用后，展現(xiàn)出強(qiáng)大的分析檢測性能[15-17]。由于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)速率快、立體選擇性好、對(duì)溶劑不敏感等特點(diǎn)，基于點(diǎn)擊化學(xué)構(gòu)建的分析方法具有檢測限低、線性范圍廣、可對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行準(zhǔn)確定量的優(yōu)勢，在快速檢測方面有著良好的應(yīng)用前景。

2 常見的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)分類

點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)主要有4種：環(huán)加成反應(yīng)、親和開環(huán)反應(yīng)、非醇醛的羰基反應(yīng)和碳碳多鍵的加成反應(yīng)。

2.1 環(huán)加成

環(huán)加成反應(yīng)即充分利用模塊化反應(yīng)融合過程，將兩種不飽和的反應(yīng)物連接起來，形成各種五元雜環(huán)和六元雜環(huán)的反應(yīng)，如Diels Alder反應(yīng)及1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)。研究最多的是1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)，其中以炔烴和疊氮基的反應(yīng)最為突出，由Arthur[18]在1983年首次報(bào)道，后由Huisgen等[19]正式確立為一類重要的新型反應(yīng)。在一價(jià)銅的催化下，炔基和疊氮基的不飽和鍵發(fā)生成環(huán)反應(yīng)(CuAAC反應(yīng))，形成1,2,3-三唑，該反應(yīng)在室溫下即可發(fā)生，且對(duì)氧氣、pH值、溫度等條件不敏感，為復(fù)雜有機(jī)物的合成和生物大分子的改性提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。隨著各種交叉學(xué)科的出現(xiàn)，當(dāng)前基于新型點(diǎn)擊反應(yīng)試劑構(gòu)建的各類CuAAC檢測方法已有大量報(bào)道，主要包括熒光檢測法、比色檢測法、電化學(xué)檢測法等(表1)。

表1 基于CuAAC反應(yīng)的快速檢測方法Table 1 Rapid detection methods based on the CuAAC reaction

CuAAC檢測法通常具有反應(yīng)基團(tuán)易修飾、靈敏度好、結(jié)果可視化等優(yōu)勢，然而CuAAC反應(yīng)需要引入一些具有潛在毒性的金屬催化劑，使其在生物醫(yī)藥以及食品領(lǐng)域的應(yīng)用受限。

2.2 親和開環(huán)

親和開環(huán)主要是三元雜原子張力環(huán)開環(huán)并釋放張力能的過程，如環(huán)氧衍生物、氮雜環(huán)丙烷、環(huán)狀硫酸酯、環(huán)狀硫酰胺、吖丙啶離子等。在這些三元雜環(huán)化合物中，環(huán)氧衍生物和吖丙啶離子是最常用的底物，可在醇/水混合溶劑或無溶劑條件下開環(huán)形成各種高區(qū)域選擇性化合物。此類反應(yīng)還包括α,β-不飽和羰基化合物的邁克爾加成反應(yīng)，主要用于天然產(chǎn)物和藥物的合成[34-39]。

2.3 非醇醛的羰基化

非醇醛的羰基化反應(yīng)又稱“保護(hù)基反應(yīng)”，是一類溫和的羰基化合物縮合反應(yīng)。此類反應(yīng)包括：醛或酮與1,3-二醇反應(yīng)生成1,3-環(huán)氧戊環(huán)；醛與肼或胲反應(yīng)生成腙和肟；α-和β-羰基醛、酮和酯生成雜環(huán)化合物[40-42]。這些反應(yīng)均能夠在環(huán)境友好的體系中進(jìn)行，且不產(chǎn)生有害副產(chǎn)物。

2.4 碳碳多鍵加成

碳碳多鍵加成反應(yīng)通過將原子或基團(tuán)加成在碳碳鍵兩端，生成具有更高分子量的化合物，包含環(huán)氧化反應(yīng)、二羥基化反應(yīng)、氮雜環(huán)丙烷化反應(yīng)、雙氫加成以及巰基-烯反應(yīng)等典型反應(yīng)。

因不需要金屬催化劑、反應(yīng)原料范圍廣、具有點(diǎn)擊反應(yīng)的所有特性，巰基-雙鍵反應(yīng)近年來已成為點(diǎn)擊反應(yīng)的研究熱點(diǎn)。根據(jù)雙鍵化合物的不同，巰基-雙鍵反應(yīng)分為兩種反應(yīng)機(jī)理：(1)在光或熱的條件下，巰基與烷烴單烯之間的自由基加成；(2)有機(jī)堿(有機(jī)胺、有機(jī)磷化物等)作為催化劑時(shí)，巰基與馬來酰亞胺、(甲基)丙烯酸酯等共軛烯烴的巰基-邁克爾加成。Cleophas等[43]采用巰基-雙鍵點(diǎn)擊化學(xué)制備了一種具有優(yōu)異抗菌性能的PEG基水凝膠涂層，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)，該涂層對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌接種物具有>99%的完全殺死率，顯示了巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)在抑菌方面的應(yīng)用功能性。

3 點(diǎn)擊化學(xué)在檢測分析中的應(yīng)用

3.1 食品成分及食品添加劑的檢測

近年來，抗壞血酸常用作護(hù)色劑被添加到食品中，而攝入過量的抗壞血酸會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)。Qiu等[24]利用CuAAC點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建了一種超靈敏檢測抗壞血酸(AA)的電化學(xué)傳感器，將炔丙基功能化的二茂鐵通過與修飾在金電極上的疊氮化末端發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)修飾到電極上，并采用電化學(xué)交流阻抗法檢測金電極在點(diǎn)擊反應(yīng)前后的電子轉(zhuǎn)移電阻，以此確定不同濃度抗壞血酸的表面覆蓋分?jǐn)?shù)(θ) 。結(jié)果表明，θ值與抗壞血酸濃度對(duì)數(shù)值在 5.0×10-12～1.0×10-9mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。該傳感器檢測限低至1.3×10-12mol/L，選擇性和穩(wěn)定性良好，并已成功應(yīng)用于抗壞血酸的實(shí)際檢測。

李燕萍等[25]利用巰基丙酸修飾納米金，并借助酰胺反應(yīng)分別構(gòu)建了炔基和疊氮基修飾的兩種不同的AuNPs，通過還原糖將Cu2+還原為Cu+觸發(fā)兩種AuNPs的CuAAC反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)還原糖的定量檢測。該方法的檢出限為0.001 5 μmol/L，可直接用于蜂蜜產(chǎn)品的還原糖檢測。

3.2 農(nóng)殘獸殘檢測

當(dāng)前檢測農(nóng)獸藥殘留的金標(biāo)準(zhǔn)方法主要是高效液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜和質(zhì)譜法，但是這些方法前處理復(fù)雜，需借助各種大型儀器，不適用于快速檢測。Dong 等[21]基于點(diǎn)擊化學(xué)原理，開發(fā)了一種快速高靈敏檢測毒死蜱的免疫分析方法。研究者分別制備了聚谷氨酸(PGA)、疊氮基修飾的聚苯乙烯(PGA-Azide-PS1000)納米粒子和炔基修飾的磁納米顆粒(Alkyne-MNPs)，PGA和Cu2+之間可通過配位化學(xué)結(jié)合形成刷狀納米結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)體系中Cu2+的濃度可觸發(fā)CuAAC。毒死蜱會(huì)阻止PGA-PS1000-抗原與MNPs-Ab之間形成MNPs-Ab-抗原-PS1000-PGA復(fù)合物，因此較少的Cu2+被PGA鍵合，溶液中更多游離Cu2+被抗壞血酸還原為Cu+從而發(fā)生CuAAC反應(yīng)，導(dǎo)致PS1000-MNP30共軛物的形成。MNPs聚集狀態(tài)以及濃度變化均會(huì)使磁傳感器的橫向馳豫(T2)發(fā)生變化，可通過測定體系的T2值來檢測毒死蜱。這種點(diǎn)擊化學(xué)和配位化學(xué)介導(dǎo)的免疫傳感器可實(shí)現(xiàn)對(duì)毒死蜱殘留物的超靈敏檢測，檢測限(0.022 ng/mL)較酶聯(lián)免疫吸附法(1.28 ng/mL)提高了58倍，所用時(shí)間也比金標(biāo)準(zhǔn)法短(圖1A)。

納米金顆粒易與硫醇形成穩(wěn)定的Au—S鍵，F(xiàn)u等[22]利用疊氮化物和炔基化合物修飾的AuNPs之間的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，開發(fā)了一種快速、高靈敏、肉眼可視化檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的方法(圖1B)。多孔有機(jī)骨架孔隙率高、比表面積大，在溶劑中有很好的穩(wěn)定性，Wu等[44]通過光催化的巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)制備了高度交聯(lián)的共價(jià)有機(jī)骨架(CFOs)，將其固定在化學(xué)惰性不銹鋼纖維(SSF)上用作固相微萃取(SPME)的涂層，并與氣相色譜法聯(lián)用對(duì)黃瓜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了檢測。

殺螨劑氟咪唑嗪的炔基能夠與3-疊氮-7-羥基香豆素反應(yīng)，在Cu+催化下發(fā)生疊氮炔環(huán)加成生成強(qiáng)熒光的1,2,3-三唑，Lu等[23]據(jù)此開發(fā)了一種能夠靈敏特異性檢測氟咪唑嗪的熒光傳感方法，線性范圍為0.25～6.0 μg/L，檢測限為0.18 μg/L(圖1C)。

抗生素殘留是繼農(nóng)藥殘留后又一嚴(yán)重的獸藥殘留問題，目前對(duì)食品中抗生素的檢測仍以大型精密儀器分析法為主，其樣品前處理復(fù)雜耗時(shí)，而點(diǎn)擊化學(xué)與其他技術(shù)聯(lián)用可大大縮短檢測時(shí)長。Belal等[45]基于DNA適配體片段的互補(bǔ)作用以及Cu+催化的點(diǎn)擊反應(yīng)，開發(fā)出能夠高靈敏、快速(2 h內(nèi))檢測卡那霉素的熒光分析法。主要機(jī)理為：一條DNA單鏈采用生物素修飾，另一條DNA單鏈采用CuS納米顆粒修飾，僅在卡那霉素存在的情況下這兩條DNA單鏈互補(bǔ)形成雙鏈，產(chǎn)生的卡那霉素-雙鏈DNA-CuS經(jīng)磁分離后，CuS被抗壞血酸還原為Cu+而觸發(fā)3-疊氮基-7-羥基香豆素與炔丙醇之間的CuAAC反應(yīng)，生成具有熒光的1,4-二取代-1,2,3-三唑。該反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度與卡那霉素濃度(0.04～20 nmol/L)具有良好的線性關(guān)系，方法檢測限低至26 pmol/L。

Xianyu等[46]通過不同尺寸的反式環(huán)辛烯(TCO)功能化的聚苯乙烯珠(TCO-PS)和1,2,4,5-四嗪(Tz)功能化的30 nm磁珠(Tz-MNP30)之間的“TCO-Tz點(diǎn)擊反應(yīng)”制備了具有核-衛(wèi)星結(jié)構(gòu)的磁探針，結(jié)合抗體-抗原相互作用和磁分離，利用這些多功能磁探針產(chǎn)生的磁弛豫轉(zhuǎn)換(Magnetic relaxation switching,MRS)信號(hào)可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種抗生素的高靈敏檢測。用該方法分別進(jìn)行土霉素、磺酰胺和氯霉素的含量檢測，所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并有望進(jìn)一步應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和食品安全檢測。

圖1 基于點(diǎn)擊化學(xué)引起T2信號(hào)值變化檢測毒死蜱(A)[21]，點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合納米金顆粒可視化檢測有機(jī)磷農(nóng)藥(B)[22]， 利用點(diǎn)擊化學(xué)生成強(qiáng)熒光的1,2,3-三唑(C)[23]Fig.1 Detection of chlorpyrifos based on changes in T2 signal value caused by click chemistry(A)[21], combination of click chemistry and gold nanoparticles to visually detect organophosphorus pesticides(B)[22]， preparation of 1,2,3-triazole with highly fluorescence using click chemistry(C)[23] 1.3-azide-7-hydroxycoumarin(3-疊氮化物-7-羥基香豆素);2.flumioxazin(氟米嗪);3.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA (3-疊氮化物-7-羥基香豆素+二價(jià)銅離子+鏈霉親和素);4.flumioxazin+Cu2++SA(氟米嗪+二價(jià)銅離子+鏈霉親和素); 5.3-azide-7-hydroxycoumarin+Cu2++SA+flumioxazin(3-疊氮化物-7-羥基香豆素+二價(jià)銅離子+鏈霉親和素+氟米嗪)

3.3 真菌毒素檢測

真菌毒素如黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等極易污染糧食、谷物、咖啡、啤酒和茶葉等，對(duì)動(dòng)物和人具有致畸、致癌、致突變和免疫抑制等毒性作用[47-49]。當(dāng)前，對(duì)AFB1、OTA、ZEN等的檢測以傳統(tǒng)的儀器分析法為主，如高效液相色譜法[50]、薄層色譜[51]等。這類方法靈敏度高且準(zhǔn)確性好，但存在樣品前處理復(fù)雜、需要專業(yè)操作人員和設(shè)備昂貴等不足，限制了其在基層的推廣使用。因此，開發(fā)低成本快速檢測抗生素的方法作為大型精密儀器分析法的有力補(bǔ)充顯得尤為重要。

Qiu等[26]分別制備了疊氮基-OTA適配體修飾的磁珠(N3-OTA適配體-MBs，DNA1)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能化的炔基-DNA偶聯(lián)物(炔基DNA-蔗糖轉(zhuǎn)化酶，DNA2)，以個(gè)人血糖儀(Personal glucose meter,PGM)作為信號(hào)讀出器建立了微量OTA(72 pg/mL)的檢測方法。DNA1與DNA2間發(fā)生CuAAC反應(yīng)形成雙鏈的dsDNA，存在OTA時(shí)，OTA與其適配體結(jié)合，使得dsDNA雙鏈解開，經(jīng)磁珠分離后上清液中的DNA2量增多，PGM信號(hào)變強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)OTA的高靈敏檢測。

Xu等[52]通過光引發(fā)多面體低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS) 單體聚合形成含活性烯基的剛性骨架，并在70 ℃下引發(fā)巰基化的玉米烯酮適體(SH-ZEN適體)和烯基間的“巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)”,得到被極性適體致密包被的親和整體柱，最終與HPLC聯(lián)用對(duì)大米中的ZEN進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。Chen等[53]基于自由基聚合和“硫醇-烯”點(diǎn)擊反應(yīng)，采用“一鍋法”直接制備了一種新型的基于OTA適體的含POSS雜合親和性整體柱，并用于啤酒樣品中OTA的檢測，該法特異性好且能夠檢測痕量OTA。

圖2 點(diǎn)擊化學(xué)引起的GO-C2和Rho-N3間的FRET效 應(yīng)(A)[32]，點(diǎn)擊化學(xué)形成的Mg2+依賴性DNA酶結(jié)合 血紅素比色檢測Cu2+(B)[30]Fig.2 FRET effect between GO-C2 and Rho-N3 caused by click chemistry(A)[32]，colorimetric detection of Cu2+ using Mg2+ dependent DNAzyme formed by click chemistry and heme(B)[30]

3.4 重金屬檢測

微量金屬如銅、鐵等是人體生長發(fā)育的必需元素，但攝入過量或者不足以及不平衡均會(huì)引起人體生理異?；虬l(fā)生疾病[54-55]。此外，環(huán)境中的重金屬如汞、鎘等也會(huì)影響人體健康[56-57]。因此，開發(fā)金屬殘留的高靈敏檢測方法極為重要。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢，常作為反應(yīng)信號(hào)放大手段用于分析檢測。氧化石墨烯(GO)是一種理想的能量受體，可與許多物質(zhì)發(fā)生FRET猝滅其熒光。Zheng等[32]利用炔基修飾的氧化石墨烯(GO-C2)和疊氮基修飾的羅丹明100(Rho-N3)間發(fā)生CuAAC反應(yīng)導(dǎo)致Rho-N3的熒光被顯著猝滅的機(jī)理，實(shí)現(xiàn)了Cu2+的高靈敏檢測。該方法可以高效快速(1 min)地檢測尿液中的Cu2+，為臨床診斷提供了一定的理論基礎(chǔ)(圖2A)。

在AuNPs的局部表面等離子體激元共振(LSPR)和CuAAC反應(yīng)高特異性的基礎(chǔ)上，Zhou等[33]通過配體交換反應(yīng)制備了疊氮基和炔基修飾的AuNPs，利用CuAAC反應(yīng)使兩種AuNPs交聯(lián)并引發(fā)聚集使體系溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)色，進(jìn)而通過肉眼對(duì)Cu2+進(jìn)行了定性檢測。Carol等[27]通過二炔交聯(lián)劑誘導(dǎo)疊氮基修飾的AuNPs聚集實(shí)現(xiàn)了Cu2+的靈敏檢測，檢測限低至1.8 μmol/L。AuNPs易在高濃度鹽溶液中發(fā)生聚集，導(dǎo)致顏色由紅變藍(lán)，但是谷胱甘肽存在時(shí)則會(huì)抑制這一現(xiàn)象。

除CuAAC反應(yīng)外，光或熱引發(fā)的“巰-烯”點(diǎn)擊化學(xué)也常應(yīng)用于材料修飾中。Zuo等[58]通過光引發(fā)的“巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)”合成咪唑官能化聚硅氧烷(PMMS-IM)，該材料在365 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈熒光。過渡金屬離子Fe3+等能夠與富電子基團(tuán)發(fā)生配位結(jié)合而引起熒光猝滅，故作者將PMMS-IM用作Fe3+的熒光檢測探針，并用于檢測Hela細(xì)胞中Fe3+的原位循環(huán)。

脫氧核酶(DNAzyme)是在體外篩選、擴(kuò)增獲得的一種具有催化功能的DNA片段[59]，可形成G-四鏈體并結(jié)合血紅素，適用于小分子、金屬離子、DNA等的檢測。Li等[30]結(jié)合Cu+催化的點(diǎn)擊化學(xué)和Mg2+依賴性DNAzyme循環(huán)擴(kuò)增的策略，開發(fā)了一種可靈敏檢測人血清中Cu2+的比色傳感法，該方法的線性范圍為5～500 nmol/L，檢測限低至2 nmol/L(圖2B)。

CuAAC反應(yīng)生成的三唑環(huán)在檢測體系中具有極大的作用：(1)作為與目標(biāo)分析物的結(jié)合位點(diǎn)；(2)作為離子載體與熒光團(tuán)之間的連接基團(tuán)。Hou等[29]利用CuAAC反應(yīng)合成了含有兩個(gè)三唑環(huán)的新型二甲苯苯基環(huán)烷烴1，其在292 nm激發(fā)波長處具有強(qiáng)熒光。在甲醇溶液中，該環(huán)烷烴1的三唑環(huán)能特異性地結(jié)合Ag+，同時(shí)，由于螯合增強(qiáng)熒光猝滅(CHEQ)效應(yīng)，使得環(huán)烷烴1的熒光被顯著猝滅，從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+的檢測。Zhang等[33]利用Cu+觸發(fā)UiO-66-N3與苯乙炔的點(diǎn)擊反應(yīng)，合成了一種新型金屬有機(jī)骨架(MOF)熒光探針UiO-66-PSM，該探針的三唑環(huán)可以與Hg2+配位結(jié)合猝滅UiO-66-PSM的熒光，較其他金屬離子表現(xiàn)出更明顯的熒光響應(yīng)，且在水溶液中有很好的穩(wěn)定性，可用于環(huán)境水體中Hg2+的檢測。

Fomo等[28]基于疊氮基苯胺鹽酸鹽與炔烴封端的金屬鈦氰(MPc)的CuAAC反應(yīng)，制備了一種新型低對(duì)稱炔末端鈷——酞菁鈷(CoPc)。將該CoPc經(jīng)差動(dòng)脈沖溶出伏安法(DPSV)修飾于玻碳電極上，可同時(shí)檢測Hg2+、Cu+、Pb2+、Cd2+和As3+等金屬離子。

3.5 食源性致病菌

食源性疾病是全球最突出的公共衛(wèi)生問題之一，隨著食品供應(yīng)鏈的快速發(fā)展，食源性疾病在全球各地的蔓延不僅危害人體健康，還會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)問題。目前食源性致病菌的檢測手段主要是傳統(tǒng)的選擇性平板培養(yǎng)和凝集實(shí)驗(yàn)等，以上方法存在操作繁瑣、檢測周期長等缺點(diǎn)，不能滿足食源性致病菌快速檢測的迫切需求。

Huang等[60]開發(fā)了一種無酶生物傳感器用于快速(1 h內(nèi))檢測沙門氏菌。研究者首先制備了姜黃素-牛血清白蛋白納米顆粒(CUR-BSA)，通過反式環(huán)辛烯(Tz)-1,2,4,5-四嗪(TCO)間的無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)形成Tz-TCO-CUR復(fù)合物后將其進(jìn)行抗體功能化，并結(jié)合磁分離技術(shù)對(duì)沙門氏菌進(jìn)行定性和定量檢測，方法檢測限低至50 CFU/mL。

此外，Guo等[16]綜合旋轉(zhuǎn)磁分離法、金納米管(GNR)指示法以及Tz-TCO點(diǎn)擊化學(xué)信號(hào)放大法，建立了一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的比色免疫傳感器。該免疫傳感器檢測時(shí)間為3 h，線性范圍為101～105CFU/mL，檢出限為35 CFU/mL。

大腸桿菌(E.coli)能夠特異性地捕獲環(huán)境中的Cu2+將其還原為Cu+，Mou等[20]基于此并利用疊氮-AuNPs和炔烴-AuNPs的CuAAC反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌的快速靈敏檢測。當(dāng)存在E.coli時(shí)，外源性Cu2+被E.coli還原為Cu+而觸發(fā)CuAAC反應(yīng)，導(dǎo)致金納米顆粒聚集并使體系由紅色變?yōu)樗{(lán)色，僅用肉眼即可快速輕松地實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測。

4 結(jié)論與展望

作為一類新型的合成反應(yīng)，點(diǎn)擊化學(xué)由于其生物相容性和環(huán)境友好性等優(yōu)勢被大量研究，并在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。值得注意的是，將免疫分析法和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)有效結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)分析物更加快速靈敏的檢測，例如，利用基因工程技術(shù)制備抗體與反應(yīng)底物催化酶的融合蛋白用于替代傳統(tǒng)免疫分析法中的一抗和酶標(biāo)二抗，能夠減少孵育反應(yīng)次數(shù)和洗滌次數(shù)，極大地縮短檢測時(shí)間，同時(shí)避免了過多孵育和洗滌次數(shù)對(duì)靈敏度的影響。當(dāng)前，點(diǎn)擊化學(xué)在食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究尚處于初期階段，盡管已取得了較好的研究進(jìn)展，但現(xiàn)階段點(diǎn)擊化學(xué)自身存在的局限性仍需引起研究人員的重視。如：(1)點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)生需要特定的反應(yīng)基團(tuán)參與，而在納米材料上修飾反應(yīng)基團(tuán)則操作繁瑣費(fèi)時(shí)；(2)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)類型較少，已報(bào)道的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)大部分都是疊氮化物與端基炔的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)和巰基-烯加成反應(yīng)；(3)需要加入過量的銅鹽使點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)完全，提高了反應(yīng)成本；(4)疊氮化合物危險(xiǎn)性高、毒性強(qiáng)，嚴(yán)重威脅研究人員的生命健康。因此，針對(duì)上述問題，亟需開發(fā)出更為經(jīng)濟(jì)、綠色、安全的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)類型，使點(diǎn)擊化學(xué)在食品安全檢測領(lǐng)域得到更為深入的研究，同時(shí)有助于拓寬點(diǎn)擊化學(xué)在其他研究方向的應(yīng)用。