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        基于電化學(xué)傳感器檢測赭曲霉毒素A的研究進(jìn)展

        2021-05-27 03:37:50李林芝何賽君黃添增曹宏梅
        分析測試學(xué)報 2021年5期
        關(guān)鍵詞:檢測

        李林芝,何賽君,黃添增,劉 星,3,4,5,陳 奇,3,4,5, 陳 健,3,4,5,曹宏梅,3,4,5*

        (1.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,海南 ???570228;2.海南大學(xué) 化學(xué)與工程技術(shù)學(xué)院,海南 海口 570228;3.海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海南 ???570228;4.熱帶多糖資源利用教育部工程 研究中心,海南 ???570228;5.海南省南海水產(chǎn)資源高效利用工程研究中心,海南 海口 570228)

        赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是一種由赭曲霉、青霉菌等真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,廣泛存在于糧谷類、飼料、堅(jiān)果、葡萄及葡萄酒、咖啡及其制品中[1]。雖然OTA在食品中的含量極少,但其能長期在人體和動物體中積累,不僅對肝臟、腎臟損害極大,還對神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)具有毒性,可能致畸和致癌[2]。

        OTA具有的廣泛毒性引起了國內(nèi)外的關(guān)注。1993年,國際癌癥研究中心將OTA認(rèn)定為ⅡB類致癌物[3]。隨后,歐盟、美國等[4]國家針對OTA在不同食品中的含量制定了限量標(biāo)準(zhǔn),如直接使用谷物加工品中OTA限量標(biāo)準(zhǔn)為3.0 μg/kg,未經(jīng)加工谷物為5.0 μg/kg,葡萄酒為2.0 μg/kg。我國針對谷物、豆類、辣椒及其制品等也規(guī)定了嚴(yán)格的OTA限量標(biāo)準(zhǔn),其中谷物及加工品、豆類中OTA限量為5.0 μg/kg。2017年,我國增加了對葡萄酒和咖啡中OTA的限量指標(biāo)[5-6],其中葡萄酒為2.0 μg/kg,咖啡豆和咖啡粉為 5.0 μg/kg,速溶咖啡為10.0 μg/kg。同時,GB 5009.96-2016規(guī)定了食品中OTA的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法,并針對不同檢測方法規(guī)定了檢出限或定量下限[6]。因此,食品中OTA含量的檢測對保障人民身體健康具有重要意義。

        目前已有較成熟的OTA檢測方法,如薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8]、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)[9]、時間分辨熒光免疫分析技術(shù)[10]、膠體金免疫層析技術(shù)[11]、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)[12]等。其中,薄層色譜法和膠體金免疫層析技術(shù)方法簡單,所用試劑廉價,但靈敏度低;高效液相色譜法的靈敏度高、重現(xiàn)性好,但成本高、操作過程復(fù)雜;酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)操作簡單,但靈敏度低。而電化學(xué)傳感作為快速發(fā)展的新檢測方法,具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測范圍廣、快速、便攜等優(yōu)點(diǎn),為OTA的定性、定量快速檢測提供了新的發(fā)展方向。近年來,研究者們開發(fā)了大量靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測范圍寬的新型OTA電化學(xué)傳感器,且廣泛應(yīng)用于谷物[13]、葡萄[14]、咖啡[15]等實(shí)際樣品中OTA含量的檢測。本文綜述了近年來電化學(xué)傳感在OTA檢測方面的研究進(jìn)展及在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用,為后期OTA電化學(xué)傳感在快速檢測領(lǐng)域的發(fā)展提供了一定參考。

        1 OTA電化學(xué)傳感的原理及分類

        近年來,利用電化學(xué)傳感在OTA檢測方面得到了快速發(fā)展,其檢測原理是基于識別分子和目標(biāo)物之間在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生電流的變化進(jìn)行分析[16]。因此,電化學(xué)傳感兼具化學(xué)反應(yīng)和電化學(xué)傳導(dǎo)的優(yōu)勢,如高特異性、強(qiáng)親和力、高靈敏性和反應(yīng)性。此外,電化學(xué)傳感還具有易便攜、微型化、消耗試劑少、無需復(fù)雜前處理等優(yōu)點(diǎn)[17]。因此,結(jié)合OTA的特征和現(xiàn)代檢測技術(shù)的要求,電化學(xué)傳感已成為目前分析OTA濃度的潛在方法。信號識別分子是電化學(xué)傳感的重要組成部分,根據(jù)OTA目標(biāo)物信號識別分子不同,例如適配體[18]、抗體[17-18]、分子印跡聚合物[19],OTA電化學(xué)傳感主要可以分為三類,即基于核酸適配體的電化學(xué)傳感、基于抗原-抗體的免疫電化學(xué)傳感和基于分子印跡的電化學(xué)傳感。本文將從此三方面具體介紹OTA電化學(xué)傳感的發(fā)展及其在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用。

        2 基于核酸適配體的OTA電化學(xué)傳感及其應(yīng)用

        適配體是一種單鏈DNA或RNA核酸片段,含有10~50個可變堿基序列,能特異性識別目標(biāo)物,如蛋白質(zhì)、核酸、毒素、細(xì)胞、細(xì)菌等。通過配體的系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)可篩選合適的適配體序列,從含有不同序列的大型文庫中對寡核苷酸進(jìn)行多次的選擇和擴(kuò)增。2008年,Cruz-Aguado和Penner[20]首次通過配體的系統(tǒng)進(jìn)化指數(shù)富集技術(shù)分離出OTA適配體序列。適配體作為電化學(xué)傳感器構(gòu)建中的高效識別分子,具有生產(chǎn)成本低、容易修飾、穩(wěn)定性好、親和力強(qiáng)、特異性高等優(yōu)勢,因此,基于OTA適配體的電化學(xué)傳感器成為近幾年的研究熱點(diǎn)。 表1總結(jié)了近5年基于OTA適配體的電化學(xué)傳感方法快速檢測OTA的研究工作。從表中可以看出,除了在電極表面直接連接OTA適配體[21-30],不同類型的納米材料也越來越多地應(yīng)用于OTA適配體傳感器的構(gòu)建。例如具有良好導(dǎo)電性的納米金顆粒可直接電鍍到電極表面形成金層,或使用導(dǎo)電性好的銀離子,以起到信號放大的效果[31-38]。還有研究者將金納米粒子與其他金屬粒子結(jié)合,構(gòu)建更靈敏的OTA電化學(xué)適配體傳感器[39-44]。除了金屬納米材料,碳納米材料(如石墨烯、碳納米管、碳?xì)饽z)[45-52]和有機(jī)納米材料(如聚苯乙烯)也應(yīng)用到OTA適配體傳感器的構(gòu)建[53-55],以改進(jìn)傳感器的靈敏度與穩(wěn)定性。上述基于納米材料構(gòu)建的OTA適配體傳感中,根據(jù)應(yīng)用的電化學(xué)技術(shù)不同,可分為電流型OTA適配體電化學(xué)傳感和電阻型OTA適配體電化學(xué)傳感。

        表1 基于適配體的OTA電化學(xué)傳感Table 1 Electrochemical sensors based on OTA aptamer

        2.1 電流型OTA適配體電化學(xué)傳感

        電流型電化學(xué)傳感是基于工作電極在含有電活性物質(zhì)的溶液中產(chǎn)生電流,通過峰電位的位置識別作用靶點(diǎn),并通過峰電位的數(shù)值變化表征電化學(xué)傳感器的性能。目前該技術(shù)已經(jīng)成為一種強(qiáng)大的電化學(xué)生物傳感技術(shù),常用的伏安技術(shù)有差分脈沖伏安法(DPV)、循環(huán)伏安法(CV)和方波伏安法(SWV)。

        基于納米材料的電流型OTA適配體傳感主要利用DPV、CV和SWV 3種技術(shù)進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測目標(biāo)物(OTA)引起的電流信號變化,可進(jìn)一步細(xì)分為電流降低型OTA適配體電化學(xué)傳感和電流增大型OTA適配體電化學(xué)傳感。如基于單一貴金屬納米粒子(Au、Pt、Ag)[31,33,36,38]及雙金屬納米粒子[39,42,44]構(gòu)建的電流降低型OTA適配體電化學(xué)傳感。由于雙金屬的協(xié)同作用,基于雙金屬納米粒子構(gòu)建傳感器表現(xiàn)出更高的電催化活性。同時,有研究者利用雙金屬納米粒子與金屬有機(jī)物結(jié)合,構(gòu)建了高靈敏的電流型OTA適配體傳感。如Zhang等[39]在鐵卟啉金屬有機(jī)骨架上原位沉積AgPt雙金屬納米粒子,形成了金屬有機(jī)聚合物作為探針分子的電流降低型OTA適配體傳感(圖1A)。當(dāng)無OTA時,通過鏈霉親和素和生物素作用,AgPt/PCN-223-Fe結(jié)合OTA適配體,產(chǎn)生強(qiáng)氧化還原電化學(xué)信號,導(dǎo)致DPV峰電流增加,但當(dāng)OTA存在時,適配體更易結(jié)合OTA,使得DPV峰電流值降低。此傳感器的檢出限可低至14 fg/mL,已成功應(yīng)用于紅酒和玉米樣品中OTA含量的檢測。隨著石墨烯材料的廣泛開發(fā),氧化石墨烯材料由于穩(wěn)定性強(qiáng)和能夠促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移,因此成為理想的構(gòu)建OTA電化學(xué)傳感器的界面材料。Prabhakar等[46]基于石墨烯摻雜殼聚糖復(fù)合物構(gòu)建電流降低型適配體傳感(如圖1B),由于石墨烯能增加電極的活性比表面積,而殼聚糖能阻止適配體的泄漏,此傳感已成功應(yīng)用于葡萄汁中OTA含量的分析,檢出限可達(dá) 1 fg/mL。

        圖1 電流型OTA適配體傳感器的構(gòu)建Fig.1 Fabrication of OTA aptasensing based the change of current A.current reduction adaptor sensing based AgPt bimetallic nanoparticles decorated iron-porphyrinic metal-organic framework(基于 AgPt雙金屬負(fù)載金屬有機(jī)物的電流降低型OTA適配體傳感);B.current reduction adaptor sensing based on graphene doped chitosan nanocomposites(基于石墨烯摻雜殼聚糖復(fù)合物的電流降低型OTA適配體傳感);C.current amplification OTA aptamer sensing based on exonuclease I-assisted silver-metallized(基于核酸外切酶- 輔助的銀金屬化電流增大型OTA適配體傳感);D.current amplification OTA aptamer sensing based on graphene oxide nanosheets and DNase I-based target recycling reaction (基于氧化石墨烯納米片-硫堇的信號放大型OTA適配體傳感)

        相比電流降低型OTA適配體電化學(xué)傳感,電流增大型OTA適配體電化學(xué)傳感因具有降低背景信號干擾,提高分析靈敏度等優(yōu)勢,近年來引起研究者的廣泛關(guān)注。deMello等[32]最近發(fā)展了一種核酸外切酶-輔助的銀金屬化電流增大型OTA適配體電化學(xué)傳感(如圖1C),此傳感器以金屬銀作為信號增強(qiáng)器,利用核酸外切酶降解未結(jié)合適配體,可抑制背景信號,提高傳感器檢測靈敏度。該傳感器用于啤酒中OTA含量的檢測,檢出限為0.7 pg/mL。Sun等[51]也構(gòu)建了基于氧化石墨烯的電流增大型OTA適配體傳感器,該傳感器由硫堇-核酸適體共軛組裝的氧化石墨烯納米片、脫氧核糖核酸酶I組成。在OTA存在下,脫氧核糖核酸酶I裂解為硫堇-適配體/目標(biāo)分子復(fù)合物,通過監(jiān)測硫菫分子的電流變化,可定量評估小麥樣品中OTA的濃度(如圖1D)。

        2.2 電阻型OTA適配體電化學(xué)傳感

        電阻型免疫電化學(xué)傳感器的建立是通過表征電化學(xué)阻抗值的變化。當(dāng)工作電極表面修飾抗體、OTA等分子后,分子的阻擋作用使其表面的電子傳遞效率降低,從而導(dǎo)致阻抗值增大。近年來,研究者利用電化學(xué)阻抗技術(shù)構(gòu)建了阻抗型OTA適配體電化學(xué)傳感。目前的研究中,大多為電阻增大型OTA適配體傳感,Bi等[34]以巰基化適體在金基底上的自組裝單分子膜為基礎(chǔ),構(gòu)建了無標(biāo)記阻抗型OTA適配體傳感器。該方法成功地應(yīng)用于白酒和葡萄汁中OTA的檢測,其檢出限為0.03 ng/mL,低于一步法硫?;疍NA適配傳感器。

        除了以納米金為基底構(gòu)建OTA適體傳感器,研究人員還著力于探究新的金屬材料在電化學(xué)中的應(yīng)用,Zhou等[40]基于Cu-Co類普魯士藍(lán)立方體復(fù)合物耦合金納米粒子構(gòu)建了阻抗型OTA適配體傳感(圖2A)。此雙金屬立方體復(fù)合物顯示了優(yōu)良導(dǎo)電性,強(qiáng)適配體結(jié)合力,以及穩(wěn)定四面體,可實(shí)現(xiàn)對果汁樣品中OTA濃度的定量分析,檢出限低至5.2 fg/mL。最近,Marty等[21]發(fā)展了基于廉價、高活性比表面積的鉛筆石墨檢測OTA的新型電化學(xué)阻抗型適配體傳感(圖2B),其檢測范圍為 0.1~2.0 ng/mL,檢出限可達(dá)0.1 ng/mL,并成功應(yīng)用于啤酒樣品中OTA的檢測。

        圖2 電阻型OTA適配體傳感器的構(gòu)建Fig.2 Fabrication of OTA impedimetric aptasensing A.based on the bimetallic(Cu-Co) prussian blue analogue loaded with gold nanoparticles(AuNP@CuCoPBA)(基于Cu-Co類 普魯士藍(lán)復(fù)合物載入金納米粒子);B.based on modified pencil graphite electrodes(基于鉛筆石墨)

        3 基于抗原-抗體的OTA免疫電化學(xué)傳感及應(yīng)用

        免疫電化學(xué)傳感是基于抗原-抗體的特異性識別作用進(jìn)行定性定量的分析方法。OTA是非免疫原性小分子,能與特異性抗體(如單克隆抗體、多克隆抗體、噬菌體模擬表位肽、納米抗體)進(jìn)行結(jié)合。目前,基于免疫型電化學(xué)傳感器檢測OTA的研究相對較少,其中大多是基于金屬納米材料的良好性能而構(gòu)建,表2總結(jié)了近10年基于抗原-抗體的電化學(xué)免疫傳感檢測OTA的研究[56-68]。根據(jù)應(yīng)用的電化學(xué)技術(shù)的不同,免疫電化學(xué)傳感可分為電流型免疫電化學(xué)傳感和電阻型免疫電化學(xué)傳感。

        表2 基于抗原-抗體的電化學(xué)免疫傳感檢測OTATable 2 Electrochemical immunoassay based on antigen-antibody for OTA detection

        3.1 電流型OTA免疫電化學(xué)傳感

        在已報道的電流型OTA免疫電化學(xué)傳感中,根據(jù)檢測策略不同,可分為直接檢測型[56-64]和競爭型[65-67]。Solanki等[57]報道了利用直接檢測策略構(gòu)建電流型OTA免疫電化學(xué)傳感。其將殼聚糖碳化成氨基功能化的碳納米材料,同時原位生長氧化鋯納米粒子(nZrO2),構(gòu)建的傳感器顯示良好的性能,利用DPV技術(shù)對OTA直接進(jìn)行特異性檢測,其檢出限為1 ng/mL,此傳感器被應(yīng)用于咖啡樣品中OTA的定量分析(圖3A)。Bechelany等[68]發(fā)展了免標(biāo)記型免疫電化學(xué)傳感直接檢測OTA,利用原子層沉積技術(shù)在碳?xì)蛛姌O表面負(fù)載Pd納米粒子,然后共價連接抗-OTA單克隆抗體,構(gòu)建了BSA/anti-OTA/PdNPs/CF傳感。此傳感對稀釋咖啡樣品中的OTA顯示良好分析性能,檢出限可達(dá) 0.096 ng/mL。

        Vidal等[65]發(fā)展了競爭型OTA電化學(xué)免疫傳感,OTA-BSA和OTA-BSA-AuNPs分別作為工作電極,連接多克隆抗OTA抗體構(gòu)建兩種間接免疫傳感(圖3B),結(jié)果顯示基于金納米結(jié)構(gòu)的傳感具有更低的檢出限,此傳感器可應(yīng)用于小麥中OTA含量的測定。盡管基于單克隆抗體、多克隆抗體構(gòu)建的OTA免疫電化學(xué)傳感顯示了良好的性能,如高特異性、良好重現(xiàn)性、低檢出限等,但存在抗體之間交叉反應(yīng)的不足。為了克服上述缺點(diǎn),研究者們開發(fā)其他類型的OTA識別分子,如噬菌體模擬表位肽、納米抗體等。He等[66]利用噬菌體模擬表位肽構(gòu)建了高靈敏的競爭型OTA電化學(xué)免疫傳感器(圖3C),可忽略交叉反應(yīng)的影響,所建免疫傳感器的檢出限為2.04 fg/mL,線性范圍為7.17~548.76 fg/mL,已應(yīng)用于玉米、啤酒兩種樣品中OTA含量的檢測。

        3.2 電阻型OTA免疫電化學(xué)傳感

        電阻型免疫電化學(xué)傳感器的建立大多通過電化學(xué)阻抗值的變化來表征,如抗體、OTA等分子的阻擋作用使工作電極表面的電子傳遞效率降低,從而導(dǎo)致阻抗值增大。近年的研究也多基于電化學(xué)阻抗值增大的原理建立電阻型免疫電化學(xué)傳感器。如Jaffrezic-Renault等[59]通過磁場作用,利用磁性納米粒子將OTA單克隆抗體固定在修飾的金電極表面,構(gòu)建了電阻型OTA免疫電化學(xué)傳感,檢出限可達(dá) 0.01 ng/mL(圖4A)。

        隨著不同材料的應(yīng)用及電化學(xué)檢測方法的建立,研究人員成功構(gòu)建了電阻減小型OTA免疫電化學(xué)傳感器,獲得了較低的檢出限,并取得了良好的實(shí)際樣品檢測效果。2016年,Tang等[67]通過構(gòu)建全新阻抗型免疫電化學(xué)傳感器,實(shí)現(xiàn)了對紅酒樣品中OTA含量的檢測(圖4B)。實(shí)驗(yàn)將信號分子Mn2+固定在OTA多克隆抗體與氧化石墨烯-聚合物模板上,當(dāng)OTA存在時,分析物、固定在電極上的OTA-BSA、氧化石墨烯-聚合物模板與OTA抗體之間發(fā)生競爭反應(yīng),二氧化錳高效催化劑可在無H2O2情況下催化4-氯-1-萘酚(4-CN)在電極上的沉淀,構(gòu)建的競爭型免疫傳感器的電阻抗值會隨著樣品中OTA濃度的增加而降低。

        4 基于分子印跡聚合物的OTA電化學(xué)傳感及應(yīng)用

        分子印跡聚合物(MIP)是模板分子(目標(biāo)化合物)從聚合物中去除后的分子印跡過程的最終產(chǎn)物。其內(nèi)部具有與模板分子互補(bǔ)的孔道形狀,這賦予了MIPs的高度選擇性和模仿自然抗體和生物受體的能力,同時具有高穩(wěn)定性、可重復(fù)性利用等優(yōu)點(diǎn)。因此MIPs被廣泛應(yīng)用于分離純化、催化、傳感等領(lǐng)域[18]。Pacheco等[69]利用OTA分子印跡聚合物構(gòu)建了OTA電化學(xué)傳感,傳感器顯示了高的穩(wěn)定性和重復(fù)性,并成功應(yīng)用于啤酒和白酒中OTA含量的測定。目前已開發(fā)的基于適配體、抗體、分子印跡的新型OTA電化學(xué)傳感器在谷物、葡萄、咖啡等樣品中得到廣泛應(yīng)用,方法具有良好的檢測性能,因此其在食品安全檢測領(lǐng)域中具有重要的應(yīng)用價值。

        5 展 望

        近年來,用于OTA檢測的電化學(xué)傳感器發(fā)展迅速,成為OTA快速檢測的新選擇和新發(fā)展趨勢,有望取代復(fù)雜、耗時的傳統(tǒng)方法。將電化學(xué)檢測技術(shù)與納米材料相結(jié)合,構(gòu)建基于抗原-抗體的OTA免疫傳感或基于適配體的OTA適體傳感能獲得更低的檢出限和更寬的檢測范圍。不同金屬納米顆粒、復(fù)合納米材料、有機(jī)納米材料等已被應(yīng)用于傳感器的構(gòu)建。然而,目前的電化學(xué)傳感器大部分僅限于理論研究,無法針對復(fù)雜的食物基質(zhì)進(jìn)行現(xiàn)場快速分析。因此急需開發(fā)出可靠、靈敏的可用于復(fù)雜樣品快速現(xiàn)場分析的傳感器。因此,對于該領(lǐng)域進(jìn)一步的研究方向仍需開發(fā)新的具有高穩(wěn)定性和優(yōu)異功能的納米材料,并將其與電化學(xué)技術(shù)相結(jié)合,構(gòu)建穩(wěn)定性更高、檢出限更低的OTA電化學(xué)傳感器,以克服傳感器穩(wěn)定性差等不足。近幾年,本課題組 Liu 等成功篩選出OTA納米抗體——分子量小、性能優(yōu)異納米抗體,并應(yīng)用于ELISA[70]或FRET[71]技術(shù)。但目前,尚無將OTA納米抗體應(yīng)用于電化學(xué)傳感領(lǐng)域,這也是本課題組未來的研究方向。我們相信基于納米抗體的電化學(xué)傳感將有更多的開發(fā)空間。

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