楊湛森，蔣雅楠，程 楠，李相陽，黃昆侖， 劉清亮，孫艷麗，許文濤*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206；3.山東拜爾檢測股份有限公司，山東 濰坊 261061)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種影響各個(gè)品種與年齡段豬的毀滅性傳染病[1]，其特征包括高燒，皮膚發(fā)紺，淋巴嚴(yán)重出血，死亡率高達(dá)100%，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(International Epizootic Office，OIE)列為必須及時(shí)通報(bào)的動(dòng)物疫病，對(duì)養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)構(gòu)成了巨大威脅，我國也將其列為主要的外來動(dòng)物疾病[2-3]。非洲豬瘟是由雙鏈DNA蟲媒病毒——非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的，它是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員[2,4]，具有復(fù)雜的二十面體結(jié)構(gòu)，直徑約200 nm，基因組大小在170～190 kb范圍之間[5]。非洲豬瘟病毒首次報(bào)道于1921年的肯尼亞[6]，在20世紀(jì)中葉于歐洲、南美爆發(fā)，90年代在歐洲大部分地區(qū)被消滅后仍流行于意大利撒丁島[7]。2007年，非洲豬瘟首次進(jìn)入俄羅斯高加索地區(qū)格魯尼亞，并傳播到烏克蘭(2012)、白俄羅斯(2013)、立陶宛(2014)、愛沙尼亞(2014)、波蘭(2014)、拉脫維亞(2014)、羅馬尼亞(2017)、捷克共和國(2017)和匈牙利(2017)等東歐其他國家，2018年在我國沈陽發(fā)現(xiàn)首例非洲豬瘟病毒疫情報(bào)道[6]。2019年的越南同樣爆發(fā)了非洲豬瘟疫情[8]。2020年以來，全球共有26個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生了2 300起家豬和7 437起野豬共9 737起非洲豬瘟疫情[9],對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大威脅，造成了巨額經(jīng)濟(jì)損失[10]。

目前，尚未有針對(duì)非洲豬瘟病毒的特效藥和疫苗，其主要的防控策略依靠衛(wèi)生措施的實(shí)施以及對(duì)感染或暴露動(dòng)物的屠宰[11]。因此，非洲豬瘟病毒的檢測與早期診斷對(duì)于疫情確認(rèn)和控制至關(guān)重要。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織建議的非洲豬瘟病毒檢測方法包括病毒分離、熒光抗體檢測以及實(shí)時(shí)和常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)檢測[12]。本文根據(jù)非洲豬瘟病毒的檢測原理將其檢測方法分為病毒分離方法、免疫學(xué)檢測方法與分子學(xué)檢測方法，對(duì)各方法的原理和特點(diǎn)進(jìn)行簡單介紹，并對(duì)非洲豬瘟病毒檢測的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 病毒分離法檢測非洲豬瘟病毒

1960年，Malmquist等[13]開發(fā)了病毒分離法即紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(Haemadsorption test，HAD test)，其原理是豬紅細(xì)胞會(huì)吸附在感染非洲豬瘟病毒的豬單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的表面，這些細(xì)胞可從豬血液、肝臟、脾臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織器官中分離[14]。HAD試驗(yàn)的陽性結(jié)果對(duì)非洲豬瘟的診斷是決定性的，是非洲豬瘟病毒的特異性反應(yīng)，但該方法也存在一些缺陷，包括：對(duì)于試驗(yàn)要求的技術(shù)手段較高，陰性診斷由于原代細(xì)胞培養(yǎng)的緣故費(fèi)時(shí)費(fèi)力，部分非洲豬瘟病毒沒有紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象存在假陰性，因此通常作為其他方法的參考與補(bǔ)充參與非洲豬瘟病毒的檢測。

2 免疫學(xué)方法檢測非洲豬瘟病毒

免疫學(xué)檢測方法可根據(jù)檢測靶標(biāo)的不同分為抗原檢測與抗體檢測，其中因非洲豬瘟病毒抗體在被感染后的幾個(gè)月或幾年中依舊存在，因此可依此發(fā)現(xiàn)幸存的感染動(dòng)物[15]。免疫學(xué)檢測方法根據(jù)檢測手段可分為免疫熒光試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與免疫層析試紙等。目前，在非洲豬瘟病毒的54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中，有19個(gè)蛋白的編碼基因是已知的，除此之外，非洲豬瘟病毒也有一些非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在滿足要求的情況下可作為免疫學(xué)方法檢測的靶標(biāo)[16-18]，非洲豬瘟病毒蛋白與其編碼基因信息見表1。

表1 非洲豬瘟病毒蛋白與其編碼基因Table 1 Proteins of ASFV and these coding genes

2.1 免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光試驗(yàn)可分為熒光抗體試驗(yàn)(Fluorescent antibody test，F(xiàn)AT)與間接熒光抗體試驗(yàn)(Indirect fluorescent antibody test，IFAT)，其區(qū)別在于檢測靶標(biāo)是非洲豬瘟病毒抗原還是因其產(chǎn)生的抗體。熒光抗體試驗(yàn)原理是利用熒光標(biāo)記的抗體與抗原形成抗原抗體復(fù)合物顆粒，再通過顯微鏡檢測，該方法可用來檢測感染非洲豬瘟病毒的豬組織涂片或切片中的病毒抗原。間接熒光抗體試驗(yàn)是利用熒光標(biāo)記的非洲豬瘟病毒二抗檢測樣品中因抗原產(chǎn)生的抗體，如Heuschele等[19]利用免疫熒光試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)不產(chǎn)生紅細(xì)胞吸附的非洲豬瘟病毒的檢測。

2.2 免疫印跡試驗(yàn)

免疫印跡試驗(yàn)(Immunoblotting test)的原理是將凝膠電泳分離后的蛋白固定于印跡紙上，通過類似于免疫熒光試驗(yàn)的直接或間接方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)非洲豬瘟抗原或抗體的檢測，其信號(hào)由熒光或酶促反應(yīng)產(chǎn)生。免疫印跡試驗(yàn)具有高通量、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其對(duì)試驗(yàn)條件與儀器設(shè)備有較高要求。Barderas等[20]利用粉紋夜蛾(Trichoplusiani)幼蟲制備了非洲豬瘟病毒重組蛋白p30，并通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定25 μg總幼蟲蛋白提取物固定到硝酸纖維素條上時(shí)可得到最優(yōu)結(jié)果，且在進(jìn)行正常豬血清測試時(shí)得到了陰性結(jié)果。Sakamoto等[21]利用昆蟲細(xì)胞表達(dá)了非洲豬瘟重組蛋白p32和p54，在5種抗病毒血清的測試中得到了陽性結(jié)果，在正常豬血清測試中得到了陰性結(jié)果。Kazakova等[22]制備了高純度重組蛋白p30，開發(fā)了基于高純度重組蛋白p30的免疫印跡檢測系統(tǒng)，對(duì)家豬和野豬或自然性感染非洲豬瘟病毒的血清和器官樣本進(jìn)行測試，方法的特異性和敏感性分別為98.75%與100.00%，其高靈敏度使得該方法可檢出感染非洲豬瘟病毒6～8 d的病豬免疫器官或血清中的非洲豬瘟病毒特異性抗體。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的基本原理是通過與酶分子共價(jià)結(jié)合的抗體與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，在有底物溶液存在的情況下，酶分子催化發(fā)生顏色反應(yīng)，由于檢測方法的不同(直接ELISA、雙夾心ELISA、間接ELISA等)，靶標(biāo)濃度與顏色深淺呈不同關(guān)系。如Barderas等[20]和Sakamoto等[21]同樣利用制備的重組蛋白p30(p32)和p54進(jìn)行間接ELISA，確認(rèn)了這幾種重組蛋白在針對(duì)非洲豬瘟病毒產(chǎn)生的特異性抗體檢測中的潛力。Perez-Filgueira等[23]利用重組蛋白p30開發(fā)的ELISA方法對(duì)來自西班牙的樣本檢測結(jié)果顯示出相似于傳統(tǒng)ELISA的靈敏度和更高的特異性，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染的早期檢測也呈現(xiàn)更高的靈敏度，對(duì)比來自西班牙和非洲的樣本，其抗原性的變異會(huì)影響基于重組蛋白p30的ELISA檢測，但這種方法仍是一種可用于發(fā)展中國家非洲豬瘟檢測的廉價(jià)可行策略。Hutchings等[24]開發(fā)了兩種間接夾心ELISA法檢測非洲豬瘟病毒抗原：一種是利用兔和豚鼠培養(yǎng)的抗細(xì)胞質(zhì)可溶性非洲豬瘟蛋白的多克隆血清；另一種是利用非洲豬瘟VP73蛋白的單克隆抗體與兔多克隆血清，這兩種方法均能檢出具有代表性的、系統(tǒng)遺傳學(xué)上不同的非洲豬瘟病毒抗原，但使用多克隆血清時(shí)的靈敏度更高。Cubillos等[25]同樣利用從東非分離株分離出的重組蛋白p30進(jìn)行了ELISA試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)基于該重組蛋白p30的ELISA能夠準(zhǔn)確檢出非洲豬瘟病毒。Giménez-Lirola等[26]通過對(duì)比p30、p54與p72 3種重組蛋白，最終選擇重組蛋白p30為基礎(chǔ)構(gòu)建間接雙夾心ELISA法，該方法能夠完成豬血清和口腔液中非洲豬瘟病毒特異性抗體的檢測。除此之外，商品化的ELISA試劑盒和傳統(tǒng)ELISA也被廣泛應(yīng)用于非洲豬瘟病毒的檢測[27-29]。

2.4 免疫層析試紙

隨著納米粒子與顯色手段的發(fā)展，免疫層析試紙已不局限于膠體金試紙。免疫層析試紙的夾心法原理是形成顯色粒子抗體-抗原復(fù)合物后，被檢測線處抗體捕獲；其競爭法原理是影響陰性條件下檢測線處顯色復(fù)合物的形成。檢測線在靶標(biāo)存在與否時(shí)呈現(xiàn)顯色或不顯色的情況，質(zhì)控線是為了確認(rèn)試紙能夠正常檢測而存在，一般能夠直接捕獲顯色粒子標(biāo)記的抗體而顯色。最近幾年關(guān)于免疫試紙的研究主要集中于多重檢測和其他檢測信號(hào)的開發(fā)。Sastre等[2]通過不同顏色的羧基化乳膠微球，基于非洲豬瘟病毒衣殼蛋白VP72與經(jīng)典豬瘟病毒(Classic swine fever virus，CSFV)結(jié)構(gòu)蛋白E2構(gòu)建了可同時(shí)檢測非洲豬瘟病毒特異性抗體和經(jīng)典豬瘟病毒特異性抗體的雙重試紙，發(fā)現(xiàn)其在這兩種疾病診斷方面具有潛力。Sastre等[30]開發(fā)了一種基于非洲豬瘟病毒衣殼蛋白VP72單克隆抗體的抗原檢測免疫層析試紙，利用黑色和藍(lán)色的羧基化乳膠微球分別進(jìn)行檢測和質(zhì)控，該免疫層析試紙?jiān)趯?shí)驗(yàn)感染樣本檢測中具有和抗原ELISA很好的相關(guān)性，但不如PCR，在實(shí)際樣品檢測中則略優(yōu)于ELISA，特異性接近100%。Li等[31]利用重組蛋白p54與含銪熒光微球構(gòu)建了檢測非洲豬瘟抗體的快速檢測方法，最佳檢測條件下可在20 min內(nèi)僅需75 μL血清即可檢出靶標(biāo)，具有較高特異性，檢測結(jié)果與ELISA試劑盒一致，準(zhǔn)確性和可重復(fù)性高，成本低，適用于我國非洲豬瘟病毒的檢測。

2.5 其他免疫學(xué)檢測方法

Abad等[32]設(shè)計(jì)了一種壓電石英晶體微平衡(Quartz crystal microbalance，QCM)生物傳感器用于檢測非洲豬瘟病毒附著蛋白p12的抗體，可在30 min內(nèi)檢出結(jié)果，性能優(yōu)于ELISA，但沒有ELISA的高通量優(yōu)勢。其原理是利用抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)，引起質(zhì)量敏感的壓電晶體共振頻率的變化，通過對(duì)這種變化的檢測實(shí)現(xiàn)對(duì)非洲豬瘟病毒的檢測。類似的，Uttenthaler等[33]通過壓電石英晶體微平衡設(shè)計(jì)了一種直接壓電注射免疫分析法用于非洲豬瘟病毒特異性多肽單克隆抗體18BG3和病毒蛋白VP73的檢測。

Luminex懸浮芯片技術(shù)(Suspension array technology，SAT)也稱xMAP(Flexible multiple-analyte profiling)，其原理是以不同比例熒光標(biāo)記聚苯乙烯微球和磁性微球偶聯(lián)蛋白、核酸等分子，與靶標(biāo)結(jié)合后由流式細(xì)胞儀檢測。Aira等[34]利用xMAP技術(shù)開發(fā)了同時(shí)檢測非洲豬瘟病毒的特異性蛋白VP72的抗體、VP30的抗體和經(jīng)典豬瘟病毒的特異性蛋白E2的抗體的檢測方法，靈敏度優(yōu)于ELISA。

Szeredi等[35]使用一種商業(yè)化小鼠單克隆抗體(Clone 1BC11)，在細(xì)胞培養(yǎng)中利用免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemical，IC)方法，在組織樣本中利用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemical，IHC)方法對(duì)非洲豬瘟病毒衣殼蛋白p72進(jìn)行檢測，證明了這兩種方法在非洲豬瘟研究和診斷中是可以使用的輔助性實(shí)驗(yàn)室檢測方法，其原理類似于免疫熒光試驗(yàn)，區(qū)別在于將熒光標(biāo)記信號(hào)改變?yōu)槿旧盘?hào)。

3 分子學(xué)方法檢測非洲豬瘟病毒

ASFV全基因組大小在170～190 kb之間，具有數(shù)量在151～167之間的開放閱讀框架[5,17]，進(jìn)行分子學(xué)檢測首先需尋找非洲豬瘟病毒基因組中足夠保守又區(qū)別于其他進(jìn)化關(guān)系比較近的病毒序列，因此分子學(xué)檢測方法有必要對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證，以確保該方法可檢測到所有流行的非洲豬瘟病毒，且不會(huì)因?yàn)槠渌P(guān)系較近病毒而發(fā)生誤判，非洲豬瘟病毒中編碼蛋白的部分基因見表1。分子生物學(xué)檢測方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Isothermal amplification techniques)、成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系統(tǒng)等。

3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

PCR是利用雙鏈擴(kuò)增的原理，在引物、酶、4種脫氧核糖核苷酸存在的情況下，在生物體外對(duì)特定的DNA片段進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，得到該片段的大量拷貝。PCR是一種常用的非洲豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法，也是最為常見的實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)診斷方法之一。Agüero等[36]基于VP73基因提供了一種高靈敏的熱啟動(dòng)PCR檢測方法，可用于非洲豬瘟檢測的常規(guī)實(shí)驗(yàn)。Basto等[37]利用巢式PCR檢測了游走鳥壁虱體內(nèi)的非洲豬瘟病毒，相較于病毒分離法與普通PCR法，該方法具有更好的敏感性，其引物來自于非洲豬瘟VP72基因。Giammarioli等[38]建立了一種能夠同時(shí)檢測經(jīng)典豬瘟病毒、非洲豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬細(xì)小病病毒(Porcine parvovirus，PPV)的多重?zé)釂?dòng)PCR檢測方法，該方法需先進(jìn)行一步逆轉(zhuǎn)錄，其性能可滿足常規(guī)分子診斷需要。Luka等[39]從福爾馬林中的固定和非固定組織中進(jìn)行DNA提取，然后進(jìn)行PCR，證明了利用傳統(tǒng)方法提取這些樣品的DNA反應(yīng)效果更好。Peng等[40]建立了可同時(shí)檢測非洲豬瘟病毒和豬水皰病病毒(Swine vesicular disease virus，SVDV)的雙重PCR反應(yīng)，其中檢測非洲豬瘟病毒的引物是針對(duì)p72蛋白的基因設(shè)計(jì)的。Luo等[11]針對(duì)非洲豬瘟病毒VP72基因開發(fā)了一種新型PCR方法，該方法通過重新設(shè)計(jì)通用引物，使得該方法相較于OIE推薦的常規(guī)PCR方法在檢測部分基因型的ASFV時(shí)具有更高的靈敏度。Erickson等[41]利用多重反轉(zhuǎn)錄PCR與自動(dòng)電子芯片檢測了包括非洲豬瘟病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、豬水皰病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)、豬水皰疹病毒(Vesicular exanthema of swine virus，VESV) 7種豬病毒，其中非洲豬瘟病毒的檢測限為10 copies/μL。Xiao等[42]構(gòu)建了基于懸浮陣列系統(tǒng)的多重PCR檢測非洲豬瘟病毒、經(jīng)典豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬細(xì)小病毒、偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV) 7種豬病毒，檢出限為1 000 copies/μL，在豬相關(guān)病毒的檢測中是一種具有潛力的方法。Zeng等[43]將PCR方法與側(cè)流試紙結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒的快速檢測，該方法與經(jīng)過OIE驗(yàn)證的實(shí)時(shí)PCR方法符合率為89.67%，Kappa值為0.763(p<0.001)，與商用試劑盒的符合率為97.67%，Kappa值為0.950(p<0.001),表明該方法適用于非洲豬瘟病毒的現(xiàn)場檢測。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是利用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針標(biāo)記跟蹤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR與光譜結(jié)合的核酸定量檢測技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、閉管操作污染小、可定量與避免電泳污染等優(yōu)點(diǎn)。King等[44]建立的基于非洲豬瘟病毒VP72基因的快速檢測非洲豬瘟病毒的閉管PCR方法，首次將實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用于非洲豬瘟的檢測，并成為被OIE推薦的非洲豬瘟病毒檢測方法。作為一種極有價(jià)值的疑似病例鑒別分子學(xué)方法，實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究一直是較為熱門的方向(表2)。Ronish等[45]通過大量擴(kuò)增的非洲豬瘟病毒VP72基因的指數(shù)后線性PCR(Linear-after-the-exponential-PCR，LATE-PCR)建立了一種熒光信號(hào)讀取于PCR擴(kuò)增終點(diǎn)的新型檢測方法，該方法是區(qū)別于RTPCR的熒光定量PCR方法，檢測限可達(dá)1 copie。

表2 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測非洲豬瘟病毒的研究Table 2 The research of the detection of ASFV use RTFQ PCR

3.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

相較于PCR技術(shù)而言，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無需專業(yè)熱循環(huán)儀，更適用于現(xiàn)場檢測與非實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境下檢測。目前，已開發(fā)出包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(Cross priming amplification，CPA)、多重交叉替代擴(kuò)增技術(shù)(Multiple cross displacement amplification，MCDA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(Rolling circle amplification，RCA)、重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase protein amplification，RPA)、重組聚合酶輔助擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase-aided amplification，RAA)、解旋酶依賴擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-dependent amplification，HDA)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Hybridization chain reaction，HCR)、指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)(Exponential amplification reaction，EXPAR)等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。本課題組在等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于各種靶標(biāo)的檢測方法開發(fā)領(lǐng)域也進(jìn)行了一定工作，包括利用RPA和LAMP對(duì)食品病原體和轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測[56-59]、利用HCR對(duì)脂多糖進(jìn)行檢測[60]、利用EXPAR對(duì)microRNA進(jìn)行檢測[61]等。

3.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR即成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，又稱常間回文重復(fù)序列叢集，是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列。CRISPR/Cas系統(tǒng)是原核生物的“免疫系統(tǒng)”，利用CRISPR序列中來自于攻擊過該生物的病毒基因片段結(jié)合外來核酸片段，啟動(dòng)CRISPR相關(guān)聯(lián)蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)對(duì)外來核酸片段進(jìn)行摧毀，保護(hù)自身核酸。根據(jù)這一系統(tǒng)的原理，可對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測，該方法靈敏度極高。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)于非洲豬瘟病毒檢測的研究在最近是非常熱門的方向，如表3所示。

表3 利用CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測非洲豬瘟病毒的研究Table 3 The research of the detection of ASFV use CRISPR/Cas system

(續(xù)表3)

Sequence numberTargetDetection principleLODReference9p72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the RAA amplicon and the FAM-Biotin ssDNA reporter,the AuNPs-anti FAM antibody conjugates can through the control line to the test line form a red band(利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)同時(shí)裂解RAA擴(kuò)增子與FAM和生物素雙標(biāo)記的ssDNA報(bào)告分子后,金納米FAM抗體共軛物可以通過質(zhì)控線在檢測線形成紅色條帶)6×105 copies/mL[82]10VP72After the CRISPR/Cas12a system was used to simultaneously cleave the PCR amplicon or RPA amplicon and the ssDNA,the AuNPs-DNA probes conjugates lose the linker and turn to red(利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)同時(shí)裂解PCR擴(kuò)增子或RPA擴(kuò)增子和ss-DNA后,金納米DNA探針共軛物失去連接子,變?yōu)榧t色)200 copies[83]

3.4 其他分子學(xué)檢測方法

原位雜交技術(shù)(In situ hybridisation，ISH)是利用核酸堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，使被標(biāo)記的外來核酸探針和被固定好的樣本內(nèi)的核酸結(jié)合，根據(jù)標(biāo)記采用不同的檢測手段，使該核酸在樣本中的位置顯現(xiàn)的方法。Ballester等[84]開發(fā)了一種新的原位雜交技術(shù)，設(shè)計(jì)了3種探針：p30、p54、p72 3種結(jié)構(gòu)蛋白基因互補(bǔ)的3種寡聚核苷酸鏈(40nt)、Ba71L基因組的18.5 kb片段、E75L全基因組，其中后兩種探針經(jīng)地高辛標(biāo)記后均可用于福爾馬林固定和石蠟包埋中的組織細(xì)胞的原位雜交。

光在由光密介質(zhì)進(jìn)入光疏介質(zhì)發(fā)生全反射時(shí)，入射光會(huì)透過光疏介質(zhì)一個(gè)波長距離的深度后再沿界面流動(dòng)半個(gè)波長距離后返回光密介質(zhì)，這段透過光疏介質(zhì)的波被稱為倏逝波。表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)現(xiàn)象是光在棱鏡與金屬膜表面發(fā)生全反射時(shí)，倏逝波與金屬中存在的離子波若發(fā)生共振，導(dǎo)致入射光的能量被離子波吸收，使反射光能量減弱。Biagetti等[85]建立了基于表面等離子共振原理的生物傳感器，利用固定核酸(Locked nucleic acid nucleotides，LNA)代替單鏈核酸作為VP72基因保守區(qū)域的互補(bǔ)原件構(gòu)建了倏逝波/共振鏡(Evanescent wave/resonant mirror)光學(xué)生物傳感器，固定核酸與靶標(biāo)雙鏈形成三核酸結(jié)構(gòu)后，質(zhì)量發(fā)生改變導(dǎo)致折射指數(shù)發(fā)生改變進(jìn)而被檢測出來，其檢測限與定量限為178 copies與245 copies。

4 總結(jié)與展望

近年來，非洲豬瘟病毒在全球范圍內(nèi)依舊是養(yǎng)豬業(yè)的重大威脅，其檢測方法的研究進(jìn)展對(duì)于非洲豬瘟病毒早期診斷至關(guān)重要，對(duì)疫情確認(rèn)和控制具有重要意義。本文所提到的非洲豬瘟病毒檢測方法的檢測能力與適用場景尚存在一定不足(表4)，針對(duì)這些存在的問題，非洲豬瘟病毒的檢測方法應(yīng)用需在保證靈敏度和特異性的情況下，提高其檢測限與現(xiàn)場即時(shí)診斷能力，未來關(guān)于非洲豬瘟病毒的研究應(yīng)集中于低成本、工業(yè)化、高通量、高性能等方向，分子學(xué)檢測方法在提高非洲豬瘟病毒的檢測性能方面十分有效，將分子學(xué)檢測方法與目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的試紙、試劑盒、微流控等相結(jié)合可以降低成本、提高檢測通量。

表4 非洲豬瘟病毒檢測方法匯總表Table 4 The summary sheet of african swine fever detection methods

(續(xù)表4)

Sequence numberMethodsAdvantagesLimitation5Polymerase chain reaction(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))Convenient operation,high specificity and sensitivity(操作方便、特異性好、靈敏度高)Need prefessional themal cycler,high-demand of instrument(需專業(yè)熱循環(huán)儀,儀器設(shè)備要求高)6Isothermal amplification techniques(等溫?cái)U(kuò)增技術(shù))No prefessional themal cycler,suitable for field detection(無需專業(yè)熱循環(huán)儀,適于現(xiàn)場檢測)Aerosol contamination,false positive(氣溶膠、假陽性)7CRISPR/Cas systemUltra high sensitivity(超高靈敏度)Need preamplication of nucleic acid,complex system(需核酸預(yù)擴(kuò)增,體系復(fù)雜)