劉筱瑋 夏斌 陳斌 楊揚 何淼
(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)
土壤鹽漬化是人類面臨的全球性難題,全世界約有10億hm2的鹽漬化土地,中國鹽漬土總面積達3 600萬余hm2,占全國可利用土地面積的4.88%,且鹽漬土地面積仍在不斷增加[1-2]。土壤是植物賴以生存的必要條件之一,土壤鹽漬化會引起植物產(chǎn)生滲透脅迫、離子脅迫和營養(yǎng)失衡,影響植物的生存和生長,進而造成鹽漬土地區(qū)植物種類少,覆蓋度低和植物景觀效果單一等突出問題[3],而為鹽漬土地區(qū)篩選和擴大適宜生存的園林植物種類也已成為解決此類問題的關(guān)鍵。
光合作用是植物生長發(fā)育的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)[4],植物光合作用對土壤鹽堿化的反應(yīng)極其敏感[5],高鹽脅迫能使植物光合器官遭到破壞,葉綠素降解,光合能力下降[6-7];光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化能反映植物受到的鹽脅迫的損傷程度,用于評價植物對鹽脅迫的適應(yīng)能力[8-9]。
野菊(Chrysanthemumindicum)是菊科(Compositae)菊屬多年生草本植物,分布范圍廣,莖稈直立粗壯,抗性較強,具有耐鹽育種潛力[10]。神農(nóng)香菊(Ch.indicumvar.aromaticum)是野菊的一個變種,全株具有濃郁香氣,是重要的芳香菊花種質(zhì)資源,但其莖稈柔弱,全株匍匐,有關(guān)其耐鹽性未見報道[11-12]。菊花為我國傳統(tǒng)名花,觀賞及商用價值較高,其在鹽漬土地區(qū)的應(yīng)用和推廣對鹽漬土地區(qū)增加園林植物種類,豐富植物景觀效果具有重要意義,利用分子育種、菊花近緣優(yōu)良種質(zhì)進行菊花品種改良等可實現(xiàn)菊花種質(zhì)創(chuàng)新[13]。本課題組在前期的研究中利用野菊作為父本,神農(nóng)香菊作為母本進行雜交,獲得F1代雜交群體,并從中篩選得到5個莖稈粗壯、氣味芳香的優(yōu)良株系。本試驗以野菊、神農(nóng)香菊及其雜交F1代5個優(yōu)良株系為試驗材料,探究它們在不同NaCl濃度脅迫下光合生理的變化規(guī)律并對它們的耐鹽性進行評價,以期篩選出具有芳香性狀的耐鹽新株系,為豐富鹽漬土地區(qū)綠化植物種類提供新的植物資源。
試驗于2019年5—7月在黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)花卉研究所苗圃進行。供試材料為野菊、神農(nóng)香菊及以野菊為父本、神農(nóng)香菊為母本獲得的雜交F1代群體中5個優(yōu)良株系。為方便敘述,5個F1代株系編號依次為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5。
采集野菊、神農(nóng)香菊及5個F1代株系健康的嫩梢扦插于穴盤之中,扦插基質(zhì)為河沙。待插穗生根后移栽于上下直徑分別為14、9 cm,高12 cm的塑料花盆中,栽培基質(zhì)為V(腐殖土)∶V(蛭石)∶V(珍珠巖)=2∶1∶1,pH為6.65,每盆干栽培基質(zhì)0.5 kg,每盆1棵植株。移栽后進行常規(guī)的養(yǎng)護管理,待植株8葉齡時,選取長勢一致、生長健壯的植株進行試驗。
試驗分別設(shè)置0、100、200、400 mmol·L-14個NaCl濃度梯度,每個處理3個重復(fù),每個重復(fù)18盆植物,每隔3 d澆1次溶液,每盆120 mL,為防止鹽分流失,花盆下放置等大的托盤,將滲出的鹽溶液再次倒回花盆中,反復(fù)幾次,直至土壤充分吸收鹽溶液。處理12 d后,測定各項相關(guān)指標(biāo)。
葉綠素質(zhì)量分數(shù)測定:取不同處理植株從頂芽數(shù)第3—第5片發(fā)育成熟的葉片,采用丙酮-乙醇混合液浸提法[14]測定并計算葉綠素a質(zhì)量分數(shù)、葉綠素b質(zhì)量分數(shù)、葉綠素(a+b)質(zhì)量分數(shù)。
光合參數(shù)的測定:選取不同處理植株從頂芽數(shù)第3片發(fā)育成熟的葉片,使用便攜式光合儀Li-6400(美國LI-COR公司)于晴天09:00—11:00測定其凈光合速率(Pn,μmol·m-2·s-1)、氣孔導(dǎo)度(Gs,mol·m-2·s-1)、胞間CO2摩爾分數(shù)(Ci,μmol·mol-1)和蒸騰速率(Tr,mmol·m-2·s-1),并計算水分利用效率(WUE=Pn/Tr)。葉室設(shè)定的光照強度為1 000 μmol·m-2·s-1,溫度設(shè)置為25 ℃,CO2氣源為室外大氣CO2。每個處理隨機測3株植株,每株植物記錄6次數(shù)據(jù)。
葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定:與光合參數(shù)測定同步,將功能葉暗處理30 min后,采用便攜式葉綠素?zé)晒獬上駜xFluorcam(捷克PSI公司)測定PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)換效率(Fv/Fm)、PSI潛在活性(Fv/F0)、PSⅡ光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP)以及非光化學(xué)猝滅系數(shù)(NPQ)。
采用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進行綜合評價[15-16]。
與耐鹽性正相關(guān)的指標(biāo)采用公式(1)計算,與耐鹽性負相關(guān)的指標(biāo)采用公式(2)計算。
Y(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
(1)
Y(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。
(2)
式中:Xi為指標(biāo)測定值;Xmin、Xmax分別為樣品某一指標(biāo)的最小值和最大值。
使用Excel 2012對數(shù)據(jù)進行整理和制圖、利用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析、主成分分析。
葉綠素質(zhì)量分數(shù)的高低在一定程度上能反映出植物光合潛能的大小。如表1所示,野菊葉片的葉綠素a質(zhì)量分數(shù)在NaCl脅迫濃度為100 mmol·L-1時與對照相比顯著下降(P<0.05),其余株系均在鹽濃度為200 mmol·L-1時與對照相比達到顯著差異水平(P<0.05)。神農(nóng)香菊、Z3、Z4、Z5葉片的葉綠素b質(zhì)量分數(shù)在鹽濃度為100 mmol·L-1時與對照相比顯著下降(P<0.05)。野菊、神農(nóng)香菊、Z4、Z5葉片的葉綠素(a+b)質(zhì)量分數(shù)在鹽濃度為100 mmol·L-1時與對照相比顯著下降(P<0.05),Z1、Z2、Z3葉片的葉綠素(a+b)質(zhì)量分數(shù)在鹽濃度為200 mmol·L-1時與對照相比顯著下降(P<0.05)。鹽濃度為400 mmol·L-1時,親本及F1代總?cè)~綠素質(zhì)量分數(shù)分別是對照的37.67%、14.44%、34.92%、42.27%、26.44%、24.87%、19.39%。
表1 不同濃度NaCl脅迫時親本及F1代的葉片葉綠素質(zhì)量分數(shù)
NaCl脅迫下,野菊的Pn隨著脅迫濃度的增大呈先上升后下降的趨勢(見表2),且在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最大值,是對照的1.16倍,與對照相比有顯著差異(P<0.05)。神農(nóng)香菊及F1代的Pn隨著脅迫濃度的升高均呈下降趨勢,且NaCl濃度為100 mmol·L-1時與對照差異顯著(P<0.05)。當(dāng)NaCl濃度為400 mmol·L-1時,Pn最高的是野菊,最低的是Z5。
親本及F1代的Gs變化趨勢與Pn基本一致(見表2)。野菊在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最大值,與對照相比無顯著差異(P>0.05)。神農(nóng)香菊及F1代Gs均呈下降趨勢,且各處理組與對照相比差異顯著(P<0.05)。
NaCl脅迫后親本及F1代的Ci呈現(xiàn)相同的變化趨勢(見表2)。親本及F1代的Ci隨著NaCl濃度的增大呈先下降后上升的趨勢,野菊、Z3的Ci在NaCl濃度為200 mmol·L-1時達到最低,神農(nóng)香菊及其余F1代株系在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最低。NaCl濃度為100 mmol·L-1時,Z1、Z2、Z4、Z5與對照相比達到顯著差異水平(P<0.05),NaCl濃度為200 mmol·L-1時,野菊、Z3與對照差異顯著(P<0.05)。
親本及F1代Tr隨NaCl脅迫濃度的增大呈下降趨勢(見表2),各處理組與相應(yīng)對照相比差異達顯著水平(P<0.05)。NaCl濃度為400 mmol·L-1時,親本及F1代蒸騰速率分別是對照的27.87%、17.18%、24.07%、29.80%、22.49%、18.27%、14.65%。
隨著NaCl脅迫濃度的升高,親本及F1代的WUE均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(見表2),除神農(nóng)香菊的WUE在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最大值,野菊及其余F1代株系的WUE均在NaCl濃度為200 mmol·L-1時達到最大值。NaCl濃度為100 mmol·L-1時,野菊、神農(nóng)香菊與對照相比差異顯著(P<0.05);NaCl濃度為200 mmol·L-1時,Z2、Z3、Z4與對照相比差異顯著(P<0.05);NaCl濃度為400 mmol·L-1時,Z1、Z5與對照相比差異顯著(P<0.05)。
表2 不同濃度NaCl脅迫時親本及F1代的光合參數(shù)
續(xù)(表2)
由Fv/Fm的變化可推斷反應(yīng)中心的變化情況[17]。隨著NaCl脅迫濃度的升高,親本及F1代的Fv/Fm逐漸下降(見表3)。在NaCl濃度為100 mmol·L-1時,神農(nóng)香菊、Z1、Z2的Fv/Fm與對照相比差異不顯著(P>0.05),僅有小幅度下降,野菊及其余F1代株系與對照差異顯著(P<0.05);NaCl濃度為200 mmol·L-1時,親本及F1代的Fv/Fm均與對照達到顯著差異水平(P<0.05);NaCl濃度為400 mmol·L-1時,親本及F1代的Fv/Fm分別是對照的74.39%、64.56%、75.00%、77.50%、70.00%、63.29%、53.75%,其中Fv/Fm最高的是野菊,最低的是Z5。
圖1 不同NaCl濃度脅迫時野菊親本及F1代的Fv/Fm
Fv/F0是PSⅡ的潛在光化學(xué)效率[18]。NaCl脅迫后親本及F1代的Fv/F0與Fv/Fm呈現(xiàn)相同的變化趨勢(見表3)。在NaCl濃度為100 mmol·L-1時,親本及F1代的Fv/F0與對照相比差異顯著(P<0.05)。NaCl濃度為400 mmol·L-1時,親本及F1代的Fv/F0分別是對照的34.79%、27.61%、36.56%、38.82%、31.40%、26.91%、19.07%。
qP表示PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度,其值的大小與PSⅡ的電子傳遞活性呈正比[19]。親本及F1代的qP變化趨勢與Fv/Fm基本一致(見表3),隨著NaCl脅迫濃度的升高,親本及F1代的qP逐漸下降。野菊、M、Z5的qP在NaCl濃度為100 mmol·L-1時與對照差異顯著(P<0.05),Z4的qP在NaCl濃度為400 mmol·L-1時與對照差異顯著(P<0.05)。
ΦPSⅡ反映PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率[20]。隨著NaCl脅迫濃度的升高,野菊的ΦPSⅡ呈先上升后下降的趨勢(見表3),且在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最大值,神農(nóng)香菊及F1代均逐漸下降。野菊的ΦPSⅡ在NaCl濃度為100 mmol·L-1時與對照達到顯著差異水平(P<0.05),是對照的1.11倍。Z5的ΦPSⅡ在NaCl濃度為100 mmol·L-1時與對照達到顯著差異水平(P<0.05),神農(nóng)香菊及其余F1代株系均在NaCl濃度為200 mmol·L-1時與對照達到顯著差異水平(P<0.05)。
NPQ反映植物耗散過剩時光能轉(zhuǎn)化為熱能的能力[21]。親本及F1代的NPQ均隨著脅迫濃度的升高呈先上升后下降的趨勢(見表3),除野菊、Z1、Z3在NaCl濃度為200 mmol·L-1時達到最大值,神農(nóng)香菊及其余F1代株系均在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最大值。
表3 不同濃度NaCl脅迫時不同株系的葉綠素?zé)晒鈪?shù)
對親本及F1代在NaCl脅迫后的各項指標(biāo)進行相關(guān)性分析,得到相關(guān)系數(shù)矩陣。從表4可以看出,葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)質(zhì)量分數(shù)、光合參數(shù)(Pn、Gs、Ci、Tr、WUE)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、NPQ、qP)之間普遍存在顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05),需要注意的是,葉綠素a與Gs和WUE之間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。3類性狀內(nèi)部彼此之間也存在著顯著相關(guān)性,即葉綠素a與葉綠素(a+b)極顯著正相關(guān)(P<0.01),Pn與Ci、Tr、WUE極顯著相關(guān)(P<0.01),F(xiàn)v/Fm與NPQ、qP極顯著正相關(guān)(P<0.01)。
由上述分析可知,各處理之間存在普遍相關(guān)性,因此可對試驗材料在4個試驗處理下的13個指標(biāo)進行主成分分析,提取出2個主成分荷載(見表5),其特征值分別為8.126、3.582,累計方差貢獻率達到90.06%,符合分析要求。第1主成分與Fv/F0、Tr、Gs、Fv/Fm、葉綠素b、葉綠素(a+b)、葉綠素a、Pn、ΦPSⅡ、qP等指標(biāo)高度正相關(guān),成分荷載均達0.750以上。第2主成分與WUE、NPQ正相關(guān),成分荷載分別為0.932、0.891,與Ci負相關(guān),成分荷載為-0.722。
表4 NaCl脅迫時不同株系各指標(biāo)間的相關(guān)性
表5 各測定指標(biāo)主成分分析旋轉(zhuǎn)后的成分載荷矩陣
根據(jù)主成分分析法計算因子得分,以因子1為橫軸,因子2為縱軸做分析圖[22](見圖2)。由圖2可知,親本及F1代在同種處理下所處的空間位置大致相同,在對照組中,親本及F1代集中分布在主成分軸1正向兩側(cè);NaCl濃度為100 mmol·L-1時,親本及F1代零散分布于主成分軸2正向兩側(cè);NaCl濃度為200 mmol·L-1時,親本及F1代零散分布于主成分軸1負向與主成分軸2正向之間;NaCl濃度為400 mmol·L-1時,親本及F1代零散分布于主成分軸1負向與主成分軸2負向之間。同一株系從對照組到各處理組的位移方向基本一致,但位移量不同,即同一植株對不同濃度的NaCl的響應(yīng)方式大致相同,但程度上有差別;親本及不同F(xiàn)1代株系從對照組到各處理組的位移差異較大,說明親本及不同F(xiàn)1代株系對NaCl的反應(yīng)方式不同。
用隸屬函數(shù)法對親本及F1代進行耐鹽性綜合評價。由表6可知,野菊耐鹽性最強,Z1、Z2耐鹽性相差不大。親本及F1代耐鹽性從高到低依次為野菊、Z2、Z1、Z3、Z4、Z5、神農(nóng)香菊。
圖2 不同NaCl濃度處理時各株系空間位移
表6 NaCI脅迫時不同株系各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值
葉綠素是主要的光合色素,是植物進行光合作用的重要物質(zhì),其含量可以反映植物光合能力的大小,可以作為衡量植物對鹽脅迫耐受能力的關(guān)鍵指標(biāo)之一[23]。本試驗中,親本及F1代的葉綠素質(zhì)量分數(shù)隨NaCl脅迫濃度的升高逐步下降,且NaCl濃度越高,葉綠素質(zhì)量濃度下降幅度越大,與張利霞等[24]的研究結(jié)果一致,原因可能在于,NaCl提高了葉綠素酶的活性,加快葉綠素的分解,最終導(dǎo)致葉綠素質(zhì)量分數(shù)的下降。研究表明,葉綠素酶主要催化葉綠素b的降解,對葉綠素a有一定降解作用但影響較小[25],神農(nóng)香菊、Z3、Z4、Z5的葉綠素b質(zhì)量濃度在低濃度NaCl脅迫時顯著下降,可能是由于葉綠素酶起主要作用;另一個原因可能在于鹽脅迫下植物對活性氧的淬滅能力變?nèi)酰够钚匝踝杂苫黾?,進一步加速葉綠素的降解[26]。
光合作用是反映植物響應(yīng)鹽脅迫的重要生理指標(biāo)之一[27]。研究表明,植物光合作用下降的原因主要有氣孔限制和非氣孔限制,Gs是影響低鹽脅迫下Pn降低的主要原因,非氣孔限制則是高鹽脅迫下Pn降低的主要原因[28]。隨著NaCl濃度的增大,親本及F1代的Pn、Gs、Tr整體上均呈降低趨勢,Ci呈先下降后上升趨勢。研究表明,Ci、Gs同時降低表示Pn的降低是由氣孔因素導(dǎo)致的[29],說明在低濃度NaCl處理中,氣孔導(dǎo)度可能在親本及F1代葉片Pn降低過程中占主導(dǎo)作用,這與賈旭梅等[30]的研究結(jié)果一致;Ci先降后升,表明隨著NaCl濃度的增大,Pn降低的主導(dǎo)原因由氣孔因素過渡到非氣孔因素,即葉綠素質(zhì)量分數(shù)降低、類囊體膜受損或葉肉細胞的光化學(xué)活性降低等因素使植物光合作用CO2利用率降低所致[31]。在本試驗中,野菊、Z3的Ci在NaCl濃度為200 mmol·L-1時達到最低,神農(nóng)香菊及其余F1株系在NaCl濃度為100 mmol·L-1時達到最低,這說明在鹽脅迫下野菊、Z3具有更好的非氣孔因素穩(wěn)態(tài)。相關(guān)性分析表明,Pn與Gs、Tr呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),這表明Gs、Tr的降低是親本及F1代響應(yīng)NaCl脅迫過程中的重要機制。親本及F1代的WUE均呈先上升后下降趨勢,WUE下降的原因可能是由于Gs降低導(dǎo)致Tr下降的速度快于Pn,植物通過降低WUE的方式來維持自身生長發(fā)育[32],神農(nóng)香菊的WUE在NaCl濃度為100 mmol·L-1時即達到最大值,這說明神農(nóng)香菊在低NaCl濃度脅迫下光合作用已受到較大傷害,需要改變自身光合作用水分利用效率應(yīng)對鹽脅迫。
植物葉片進行光合作用時吸收的光能主要通過葉綠素?zé)晒?、光化學(xué)反應(yīng)和熱耗散這3種方式消散掉,3種途徑之間聯(lián)系緊密、相互作用[33-34]。葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化,在一定程度上能反映出植物在遇到環(huán)境脅迫時做出的反應(yīng),與光合參數(shù)相比,葉綠素?zé)晒鈪?shù)能更好地反映植物光合作用的內(nèi)在變化[35]。研究表明,在植物受到脅迫后,F(xiàn)v/Fm降低表明葉片的PSⅡ反應(yīng)中心遭到破壞,發(fā)生光抑制現(xiàn)象;ΦPSⅡ、qP降低表明脅迫降低了PSⅡ反應(yīng)中心原初光捕捉效率,使PSⅡ電子傳遞受阻,從而影響實際光合效率[36]。隨著NaCl濃度的增大,親本及F1代的Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ、qP整體上呈下降趨勢,且顯著(P<0.05)低于對照,說明鹽脅迫破壞了親本及F1代的光合系統(tǒng),抑制了光合電子傳遞活性,降低了光能利用率,但不同的是,野菊、Z1、Z2下降幅度較小,在鹽脅迫下表現(xiàn)出更高的光能利用效率;NPQ隨著NaCl濃度的增大呈先上升后下降趨勢,表明隨NaCl濃度的增大,親本及F1代啟動了熱能量耗散機制,并通過非光化學(xué)淬滅以熱形式耗散激發(fā)能來適應(yīng)脅迫環(huán)境。其中野菊、Z1、Z3在200 mmol·L-1NaCl脅迫下達到最大值,而神農(nóng)香菊及其他F1代株系在100 mmol·L-1NaCl脅迫下達到最大值,表明野菊、Z1、Z3啟動熱耗散保護機制晚于神農(nóng)香菊及其他F1代株系,對鹽脅迫的抗性更好。相關(guān)性分析表明,F(xiàn)v/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ與Pn呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),qP、NPQ與Pn呈顯著正相關(guān)(P<0.05),說明Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、NPQ與光合作用密切相關(guān),其變化趨勢是判斷植物耐鹽能力的重要指標(biāo)。
植物的耐鹽性與多個因素相關(guān),指標(biāo)單一化難以準(zhǔn)確反映植物耐鹽的實質(zhì),因此用多個指標(biāo)對植物進行耐鹽能力的綜合評價是十分必要的。本試驗以親本及F1代的13個相關(guān)指標(biāo)為依據(jù),對其進行相關(guān)性、主成分及隸屬函數(shù)分析。相關(guān)性分析表示,植物Pn與葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、Gs、Tr、Fv/Fm、Fv/F0、ΦPSⅡ呈極顯著正相關(guān)(P<0.01),與WUE、qP、NPQ呈顯著相關(guān)(P<0.05),與Ci呈顯著負相關(guān)(P<0.05),因此可用以上指標(biāo)來評價不同菊花株系的耐鹽能力。第1主成分中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、Pn、Fv/F0、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP是損傷的重要指標(biāo),Tr、Gs是調(diào)節(jié)光合作用的重要指標(biāo),說明親本及F1代主要通過降低Tr、Gs來適應(yīng)鹽脅迫;第2主成分中WUE是節(jié)水指標(biāo),NPQ是熱耗散保護指標(biāo),說明親本及F1代通過提高WUE、啟動熱耗散機制來抵御鹽脅迫傷害。運用隸屬函數(shù)對親本及F1代耐鹽性進行綜合評價,耐鹽性由強至弱依次為野菊、Z2、Z1、Z3、Z4、Z5、神農(nóng)香菊。
綜上,耐鹽性強的植株表現(xiàn)出更高的光能利用效率,光合指標(biāo)基本上相互關(guān)聯(lián),能綜合反映本試驗植物材料的耐鹽能力,也為評價其他菊花耐鹽性提供參考;野菊與神農(nóng)香菊的雜交F1代芳香株系耐鹽性均優(yōu)于母本,這表明通過雜交可獲得耐鹽性改良的芳香菊花新品種,對培育芳香菊花耐鹽株系,進行菊花種質(zhì)創(chuàng)新和品質(zhì)改良具有重要意義。