王琪 楊浩倫 烏恩泰 嚴善春

(黑龍江省森林保護研究所，哈爾濱，150040)(林木遺傳育種與生物技術教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學))

冷杉梢斑螟(Dioryctriaabietella)和赤松梢斑螟(D.sylvestrella)是紅松(Pinuskoraiensis)球果和枝梢的重要害蟲，大發(fā)生年份球果被害率達80%以上，受其危害后紅松種子的質(zhì)量和產(chǎn)量大幅下跌；樹干分叉，木材材質(zhì)和出材率明顯下降，嚴重影響林區(qū)的經(jīng)濟效益和生態(tài)建設[1]。2種梢斑螟成蟲羽化期較長，由每年6月持續(xù)至8月[2]，且幼蟲生活于球果或枝條蟲包內(nèi)，傳統(tǒng)藥劑防治效果欠佳。植物的誘導抗性可以增強植物自身的抗蟲能力，從而抵御害蟲對寄主植物的危害，適用于防御營隱蔽性生活的害蟲[3]。

茉莉酸甲酯(MJA)和茉莉酮(ZJ)是茉莉酸防御反應途徑中重要的中間產(chǎn)物，在植物防御、生長及代謝過程中發(fā)揮重要作用[4]。茉莉酸甲酯或茉莉酮可作為外源誘導劑[4-6]，誘導植物產(chǎn)生抗性反應。研究認為2種物質(zhì)誘導反應途徑不同，誘導的防御策略也不同[5-8]。茶樹(Camelliasinensis)[9]、云杉(Piceaabies)[10]、落葉松(Larixgmelinii)和楊樹(Populusspp.)[11]等許多植物在經(jīng)茉莉酸甲酯處理后，均可誘導其產(chǎn)生系統(tǒng)性的誘導抗性，可通過直接或間接的防御反應抵御害蟲[12]。茉莉酮誘導的防御研究相對較少，早期的研究認為與茉莉酸途徑的其他茉莉酸異構(gòu)體相比，茉莉酮更主要是通過刺激植物特異性揮發(fā)物引誘天敵來控制害蟲，既采用間接防御策略減少害蟲危害[13]。隨著研究深入人們發(fā)現(xiàn)，用茉莉酮處理也能夠誘導小麥(Triticumaestirum)自身多種防御物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)增加[14]。課題組先前的研究結(jié)果同樣顯示利用外源茉莉酸甲酯、茉莉酮均可誘導紅松酚酸質(zhì)量分數(shù)增加，且茉莉酮誘導的酚酸種類更多[15]。但具體的機制尚不十分明確。過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物誘導防御反應過程的關鍵酶[3，12-16]；蛋白酶抑制劑(PPI)可與害蟲消化道蛋白酶相互作用，使昆蟲產(chǎn)生厭食反應[12]。本研究利用茉莉酸甲酯、茉莉酮的系統(tǒng)及局部噴施，研究誘導處理后紅松主梢和球果防御酶及蛋白酶抑制劑的活性變化，討論應用不同種類茉莉酸類化合物誘導的紅松防御反應的差異，從而為探索利用植物化學防御控制紅松梢斑螟危害奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

于2016年4月末，在牡丹江林口林業(yè)局刁翎紅松人工林內(nèi)，選擇40年生紅松為試驗植株。

1.2 樣品采集及相關酶活性測定

將健康紅松樣樹隨機分成16組，用不同濃度的茉莉酸類化合物進行原位噴霧誘導和系統(tǒng)噴霧誘導處理。原位誘導即噴施部位與樣品采集部位相同，系統(tǒng)誘導即噴霧部位與樣品采集部位不同，具體處理方式見表1。每處理組120棵樣樹，分別在5個時間段，即處理后的1、30、60、90、120 d摘取紅松球果(2年生)及主梢，每次取樣24株。赤松梢斑螟的第1次轉(zhuǎn)移期，是初孵幼蟲由主梢轉(zhuǎn)移到球果，此轉(zhuǎn)移期相應于本研究的1～30 d；其第2個轉(zhuǎn)移期，是5齡老熟幼蟲由球果轉(zhuǎn)移回主梢取食越冬，此轉(zhuǎn)移期相應于本研究的90～120 d。采集未噴施任何化合物的健康球果和主梢，作為健康對照；采集梢斑螟危害的紅松球果和主梢，作為蟲害對照。

將采集到的球果及主梢裝入夾鏈袋中，迅速放入冰盒內(nèi)帶回室內(nèi)，于-20 ℃保存、備測。CAT、SOD、POD、PPO和PAL，蛋白酶抑制劑的測定方法參考文獻[16]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 11.5軟件計算防御酶、蛋白酶抑制劑活性的平均值和標準差。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD，α=0.05)比較不同處理、不同時間段防御酶、蛋白酶抑制劑活性的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 健康、蟲害及不同茉莉酸類化合物處理的紅松球果和主梢防御酶活性

健康、蟲害及不同濃度茉莉酸類化合物原位噴霧或系統(tǒng)噴霧處理，誘導紅松球果內(nèi)各防御酶隨時間的變化趨勢見表2。由表2可見，10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施茉莉酮誘導的球果SOD活性，只在處理60 d時略低于蟲害取食誘導，其他處理時間段高于(處理90 d)或與蟲害取食無顯著差異。健康球果CAT活性隨其生長不斷增加，但蟲害誘導的CAT活性在檢測的1～120 d均顯著高于健康球果，以不同濃度茉莉酸類化合物誘導球果CAT，發(fā)現(xiàn)尤以10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施球果誘導的CAT活性與蟲害誘導最為接近。不同濃度茉莉酸類化合物處理誘導的球果POD活性在處理1 d時顯著增加，與茉莉酸甲酯相比，茉莉酮誘導的POD更接近蟲害取食誘導。不同濃度茉莉酸類化合物處理誘導的球果PPO活性在處理1 d后顯著增加，10 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導的PPO活性與蟲害誘導無顯著差異，100 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導的PPO活性顯著高于蟲害誘導，10 mmol·L-1茉莉酮原位噴施及100 mmol·L-1茉莉酮原位、系統(tǒng)噴施，誘導的PPO活性均顯著高于100 mmol·L-1茉莉酸甲酯誘導。方差分析結(jié)果表明，在檢測的30～120 d，10 mmol·L-1茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施誘導的球果PPO活性與蟲害誘導無顯著差異。分析不同茉莉酸類化合物誘導的球果PAL活性，發(fā)現(xiàn)10 mmol·L-1茉莉酮原位誘導的PAL，在處理的1～120 d與蟲害誘導無顯著差異。

表2 健康、蟲害及不同濃度茉莉酸類化合物處理的紅松球果防御酶活性

處理時間/dCAT活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.221±0.045)fD(0.270±0.025)dD(0.450±0.039)aC(0.249±0.034)eC(0.391±0.028)bD(0.339±0.028)cD(0.278±0.044)dE(0.277±0.025)dD(0.440±0.012)aD(0.250±0.053)eD30(0.119±0.046)fD(0.530±0.041)bC(0.250±0.054)eD(0.119±0.0615)fD(0.530±0.064)bC(0.463±0.035)cC(0.412±0.039)dD(0.535±0.026)bC(0.615±0.038)aC(0.641±0.031)aC60(0.499±0.044)eC(0.713±0.036)bB(0.480±0.030)eC(0.388±0.031)fB(0.563±0.038)dC(0.481±0.034)eC(0.705±0.0275)bC(0.759±0.0314)aB(0.635±0.031)cC(0.656±0.030)cC90(0.733±0.036)efB(1.016±0.038)bcA(0.756±0.037)eB(0.728±0.022)fA(0.763±0.027)eB(0.826±0.040)dB(1.040±0.055)bB(1.210±0.073)aA(0.908±0.102)cB(0.904±0.026)cB120(0.957±0.014)eA(1.209±0.023)dA(0.978±0.012)eA(0.801±0.041)fA(1.309±0.023)bcA(1.382±0.012)aA(1.336±0.002)abA(1.275±0.012)cA(1.314±0.101)bA(1.314±0.099)bA

處理時間/dPOD活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.044±0.010)cB(0.061±0.001)aA(0.055±0.006)bA(0.064±0.001)cA(0.062±0.002)aA(0.067±0.005)aA(0.063±0.010)aA(0.069±0.005)aA(0.069±0.006)aA(0.056±0.003)aA30(0.045±0.002)aB(0.046±0.001)aB(0.048±0.001)aB(0.041±0.001)aC(0.045±0.001)aB(0.035±0.005)bC(0.038±0.004)bC(0.035±0.006)bC(0.044±0.005)aC(0.041±0.002)aB60(0.045±0.002)aB(0.045±0.006)aB(0.045±0.015)aB(0.049±0.002)aC(0.047±0.006)aB(0.040±0.003)aC(0.048±0.002)aB(0.040±0.006)aBC(0.049±0.014)aBC(0.041±0.002)aB90(0.057±0.002)aA(0.053±0.014)aAB(0.059±0.018)aA(0.045±0.001)aC(0.059±0.001)aA(0.055±0.005)aB(0.054±0.002)aB(0.054±0.014)aB(0.053±0.01)aB(0.055±0.006)aA120(0.059±0.001)aA(0.058±0.002)aA(0.053±0.001)aAB(0.050±0.002)aB(0.051±0.001)aAB(0.057±0.001)aB(0.066±0.001)aAB(0.047±0.001)aB(0.058±0.001)aB(0.053±0.001)aA

處理時間/dPPO活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(0.051±0.003)fB(0.060±0.002)eB(0.058±0.002)eA(0.060±0.002)eB(0.097±0.009)cA(0.102±0.005)cA(0.065±0.006)dB(0.137±0.003)aA(0.112±0.007)bA(0.115±0.005)bA30(0.067±0.002)dA(0.078±0.010)bA(0.053±0.002)fA(0.066±0.002)dB(0.057±0.001)eC(0.082±0.002)aB(0.070±0.005)cA(0.079±0.008)dB(0.056±0.007)eBC(0.069±0.006)cdC60(0.053±0.001)eB(0.066±0.001)cB(0.033±0.003)fB(0.064±0.002)cdB(0.059±0.005)dC(0.070±0.010)aC(0.068±0.008)bB(0.070±0.006)eB(0.066±0.001)cB(0.056±0.001)dD90(0.033±0.001)fC(0.064±0.001)cB(0.059±0.002)dA(0.070±0.005)abA(0.068±0.002)bB(0.050±0.002)eD(0.062±0.005)eB(0.065±0.008)bcC(0.052±0.001)deC(0.072±0.008)aB120(0.039±0.001)eC(0.059±0.002)aB(0.041±0.002)eB(0.032±0.003)eC(0.026±0.008)fD(0.065±0.003)bC(0.072±0.008)aA(0.059±0.001)cC(0.050±0.008)dC(0.052±0.001)dD

處理時間/dPAL活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(136.84±2.03)eC (153.19±10.03)bC(130.76±8.34)fC(137.08±9.34)eC(142.69±2.34)dD(135.70±8.23)eD(148.38±7.34)cC(142.19±8.90)dC(153.19±9.34)bB(165.00±2.34)aC30(142.31±3.23)fBC(158.94±3.45)abC(148.38±3.45)eC(142.19±2.45)fC(153.19±1.34)dC(157.44±3.45)dC(148.93±2.56)eC(175.53±1.23)bB(161.54±3.45)cB(179.24±3.45)aC60(152.31±3.76)fB(178.94±9.34)abB(161.55±2.34)eB(182.67±4.34)cA(186.82±1.15)bB(210.75±3.45)aA(153.18±3.46)fC(172.10±2.34)dB(152.31±3.45)fB(208.94±7.45)abB90(186.82±2.34)deA(230.75±3.46)bA(181.62±4.36)eA(177.82±3.27)fA(199.90±5.90)dA(182.75±4.76)eB(223.47±3.25)cdA(233.63±3.20)abA(235.15±1.23)aA(225.00±3.21)cA120(159.67±2.23)fB(200.00±3.24)cA(161.50±1.09)aB(164.94±2.07)bB(158.22±2.14)bC(187.33±2.34)efB(179.08±1.34)eB(214.55±7.23)fA(205.42±3.78)cdA(206.85±7.09)dB

表3蟲害誘導主梢POD活性在取食的30 d時略低于健康主梢，但差異不顯著，而此時恰好為赤松梢斑螟在球果內(nèi)危害的時期，其他時間段均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸類化合物原位及系統(tǒng)噴施誘導的主梢POD活性在處理1 d時，10 mmol·L-1原位噴施茉莉酮誘導的酶活性最高，10 mmol·L-1與蟲害無顯著差異，并在之后的4個時間段2種處理均與蟲害無顯著差異。蟲害誘導主梢PPO活性在處理的1～30 d與健康主梢無顯著差異，其他時間段均顯著高于健康主梢。10 mmol·L-1茉莉酸甲酯系統(tǒng)噴施及不同濃度茉莉酮系統(tǒng)和原位噴施誘導的PPO在處理后的1～120 d均顯著高于或與蟲害取食無差異。蟲害誘導的主梢SOD只有在取食后的30 d與健康主梢無顯著差異，其他時間段均顯著高于健康主梢。測定噴施不同茉莉酸化合物誘導的主梢SOD活性，發(fā)現(xiàn)1 d時，茉莉酮誘導的酶活性顯著高于茉莉酸甲酯誘導，并在處理的30和60 d一直保持較高水平，雖然在處理的90～120 d酶的活性有所下降，但10 mmol·L-1茉莉酮原位和系統(tǒng)噴施及100 mmol·L-1系統(tǒng)噴施誘導的酶活性仍高于蟲害取食。蟲害誘導的PAL活性在取食的1～120 d均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸化合物誘導的PAL活性在處理后1 d顯著低于蟲害，但從處理的30 d開始，不同濃度茉莉酮處理誘導主梢PAL活性均高于或與蟲害無顯著差異。

表3 健康、蟲害及不同濃度茉莉酸類化合物處理的紅松主梢防御酶活性

處理時間/dCAT活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.381±0.045)cB(0.374±0.036)dD(0.263±0.032)fC(0.332±0.035)eD(0.471±0.071)bC(0.462±0.045)bC(0.384±0.027)cC(0.385±0.045)cB(0.552±0.024)aB(0.345±0.067)eC30(0.374±0.065)fB(0.421±0.072)eC(0.463±0.023)cB(0.434±0.025)deCD(0.475±0.026)bC(0.461±0.025)cC(0.382±0.035)fC(0.381±0.036)fB(0.552±0.026)aB(0.443±0.027)dC60(0.278±0.024)fC(0.471±0.024)eC(0.887±0.062)aA(0.685±0.027)cdB(0.646±0.017)dB(0.855±0.027)bA(0.635±0.026)dB(0.725±0.026)cA(0.651±0.037)dB(0.725±0.037)cB90(0.398±0.027)fB(0.547±0.016)dB(0.794±0.017)aA(0.514±0.017)dC(0.683±0.038)cB(0.715±0.028)bB(0.423±0.019)eC(0.674±0.018)cA(0.554±0.037)dB(0.682±0.018)cB120(0.457±0.018)fA(0.621±0.018)eA(0.872±0.019)cA(0.912±0.045)bA(0.712±0.028)dA(0.772±0.019)dB(0.854±0.027)cA(0.765±0.028)dA(1.034±0.036)aA(0.913±0.067)bA

處理時間/dPOD活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.051±0.010)cC(0.064±0.005)bAB(0.056±0.006)cB(0.055±0.004)cB(0.064±0.006)bA(0.056±0.005)cB(0.062±0.010)bB(0.075±0.005)aA(0.068±0.006)bB(0.064±0.010)bB30(0.066±0.004)eB(0.054±0.006)fB(0.067±0.005)bB(0.069±0.004)aA(0.064±0.006)cdA(0.056±0.005)eB(0.062±0.004)dB(0.054±0.006)fB(0.065±0.005)cB(0.062±0.004)dB60(0.060±0.002)aBC(0.070±0.006)aA(0.068±0.014)aB(0.066±0.004)aA(0.068±0.006)aA(0.066±0.005)aB(0.065±0.002)aB(0.066±0.006)aAB(0.063±0.014)aB(0.062±0.002)aB90(0.068±0.006)aB(0.061±0.014)aAB(0.061±0.010)aB(0.063±0.004)aAB(0.064±0.006)aA(0.068±0.005)aB(0.061±0.006)aB(0.065±0.014)aAB(0.064±0.010)aB(0.064±0.006)aB120(0.081±0.004)aA(0.074±0.006)aA(0.076±0.005)aA(0.075±0.004)aA(0.074±0.006)bA(0.086±0.005)aA(0.072±0.004)aA(0.075±0.006)aA(0.078±0.005)aA(0.084±0.004)aA

處理時間/dPPO活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(0.058±0.001)fA(0.060±0.007)eA(0.076±0.001)aA (0.074±0.011)abA(0.061±0.002)eA(0.073±0.006)bAB(0.063±0.002)dBC(0.076±0.002)aAB(0.069±0.006)cB(0.072±0.003)bA30(0.059±0.004)fA(0.060±0.003)fA(0.067±0.002)dAB(0.055±0.003)fB(0.064±0.002)eA(0.064±0.004)eB(0.076±0.003)bAB(0.082±0.001)aA(0.087±0.003)aA(0.073±0.004)cA60(0.053±0.002)eA(0.061±0.003)cA(0.065±0.015)bAB(0.056±0.002)dB(0.064±0.010)cA(0.047±0.001)fC(0.068±0.002)deB(0.055±0.003)aB(0.065±0.003)bcB(0.065±0.007)bA90(0.033±0.002)fB(0.045±0.009)eB(0.059±0.007)cB(0.070±0.003)aA(0.068±0.003)abA(0.050±0.003)dCB(0.052±0.003)dC(0.065±0.003)bB(0.052±0.003)dB(0.072±0.011)aA120(0.039±0.003)fB(0.061±0.007)dA(0.072±0.007)cAB(0.046±0.006)eB(0.067±0.003)cA(0.085±0.005)aA(0.085±0.002)aA(0.082±0.002)abA(0.078±0.006)bAB(0.063±0.002)dA

處理時間/dPAL活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(116.57±7.38)cC(150.43±9.28)aB(101.77±3.57)eC(102.28±9.28)eC(98.87±10.87)fC(98.96±2.89)fC(106.82±3.92)dC(127.16±3.89)bB(106.81±7.28)dB(105.31±10.39)dD30(133.19±10.89)fB(172.11±10.98)dA(136.99±9.20)efB(140.84±15.28)eB(191.50±9.29)bA(177.87±4.39)dB(179.88±5.17)dB(192.51±8.27)bA(203.35±7.38)aA(183.67±3.21)cC60(153.19±8.38)fA(172.11±8.39)eA(151.77±4.29)fAB(175.65±9.28)eA(190.74±4.27)dA(193.58±4.19)dA(207.77±3.21)cA(196.97±8.26)dA(212.66±4.21)bA(225.31±8.31)aA90(161.55±5.46)eA(182.67±11.42)cA(166.92±10.81)dA(178.34±3.41)cA(152.68±12.35)fB(195.65±13.41)bA(190.74±9.34)bAB(193.58±7.25)bA(207.77±6.31)aA(196.97±14.32)bBC120(159.67±13.43)fA(180.66±15.54)dA(165.61±7.36)eA(180.77±5.37)dA(192.45±4.21)cA(198.40±8.36)bA(200.74±9.26)bA(191.70±8.45)cB(194.30±6.28)bcA(204.42±9.21)aB

2.2 健康、蟲害及不同茉莉酸類化合物處理的紅松球果和主梢蛋白酶抑制劑活性

表4蟲害取食誘導的球果胰蛋白酶抑制劑活性在取食的1～120 d顯著高于健康球果，不同濃度茉莉酮原位及系統(tǒng)噴施誘導的胰蛋白酶抑制劑活性顯著高于(1～60 d)或與蟲害無顯著差異(90、120 d)。蟲害取食誘導球果胰凝乳蛋白酶抑制劑活性只有在取食后60 d顯著低于健康球果，其他時間二者無顯著差異。不同濃度茉莉酸化合物誘導的胰凝乳蛋白酶抑制劑，除系統(tǒng)噴施茉莉酸甲酯30 d時誘導的抑制劑顯著低于蟲害外，在處理的1～120 d的其他處理均高于或與蟲害無顯著差異。

表4 健康、蟲害及不同濃度茉莉酸類化合物處理的紅松球果蛋白酶抑制劑活性

處理時間/d胰凝乳蛋白酶抑制劑活性/U·g-1·min-1ckCDCBC-MJA10CC-MJA10BC-MJA100CC-MJA100BC-ZJA10CC-ZJA10BC-ZJA100CC-ZJA100 1(12.12±0.82)fC(13.32±0.93)eB(13.48±0.74)eB(22.64±0.94)bA(14.19±0.23)dB(18.38±0.42)cA(13.15±0.980eC(12.75±0.34)fC(18.19±0.350cAB(27.29±0.78)aA30(19.54±0.87)dA(20.31±0.93)cA(19.75±0.82)dA(18.75±0.84)eAB(18.50±0.54)eA(11.75±0.43)fB(22.05±0.78)bA(24.29±0.35)aA(20.21±0.98)cA(24.23±0.45)aAB60(15.17±0.92)cdB(12.65±0.39)eB(15.75±0.34)cB(11.25±0.95)efD(15.28±0.75)dB(10.15±0.83)fB(16.15±0.89)bB(20.63±0.45)aA(20.23±0.47)abA(20.17±0.87)aBC90(12.84±0.75)fC(13.03±0.94)fB(18.75±0.78)cA(13.25±0.49)fDC(19.23±0.34)bA(19.25±0.35)bA(15.25±0.98)eBC(16.13±0.45)dB(20.15±0.78)aA(16.75±0.43)dC120(12.54±0.33)dC(12.31±0.83)dB(10.75±0.45)fC(15.75±0.78)bB(15.15±0.99)bB(11.75±0.34)eB(12.05±0.86)deC(24.16±0.78)aA(16.25±0.38)bB(14.17±0.92)cC

表5蟲害誘導的主梢胰蛋白酶抑制劑活性只有在處理后120 d低于健康主梢，其他時間段均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸類化合物誘導的胰蛋白酶抑制劑活性在處理后1和30 d均顯著高于蟲害取食。處理后60 d，只有系統(tǒng)噴施10 mmol·L-1茉莉酮顯著低于蟲害取食，處理后90 d，10 mmol·L-1茉莉酸甲酯原位噴施處理顯著低于蟲害取食。在120 d，各處理均顯著低于或與健康主梢無顯著差異。蟲害取食誘導的胰凝乳蛋白酶抑制劑在取食的1～120 d均顯著高于健康主梢。不同濃度茉莉酸化合物處理主梢后，主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性顯著增高，除處理后30 d原位噴施茉莉酸甲酯顯著高于同一濃度同種化合物系統(tǒng)噴施外，其他時間段的系統(tǒng)噴施誘導的抑制劑活性均較高。

表5 健康、蟲害及不同濃度茉莉酸類化合物處理的紅松主梢蛋白酶抑制劑活性

處理時間/d胰凝乳蛋白酶抑制劑活性/U·g-1·min-1ckTDTBT-MJA10TT-MJA10BT-MJA100TT-MJA100BT-ZJA10TT-ZJA10BT-ZJA100TT-ZJA100 1(12.34±0.38)eB(15.67±0.33)cB(18.75±0.29)abC(13.48±0.41)dC(12.63±0.83)deC(11.92±0.94)fC(19.25±0.62)aC(15.93±0.76)cC(16.33±0.38)bB(11.75±0.78)fC30(15.34±0.72)fA(18.75±0.45)cA(18.93±0.65)dC(27.92±0.88)aA(18.95±0.67)dB(26.65±0.44)aA(20.31±0.83)bC(19.43±0.62)bB(18.26±0.82)cB(16.47±0.78)eA60(13.15±0.97)eAB(19.53±0.35)dA(22.67±0.54)cB(25.96±0.46)aB(25.32±0.43)aA(12.31±0.23)fC(23.25±0.75)bC(22.46±0.78)cB(23.73±0.71)bA(12.31±0.65)fC90(12.84±0.82)fB(15.75±0.46)dB(28.24±0.46)aA(15.27±0.78)dC(25.96±0.56)bA(14.42±0.74)eC(25.11±0.93)bcB(25.34±0.66)cA(25.05±0.78)cA(14.06±0.65)eAB120(13.03±0.98)fAB(15.34±0.34)eB(22.24±0.53)dB(28.12±0.35)aA(25.27±0.36)bA(15.15±0.53)eB(29.16±0.56)aA(23.18±0.62)cAB(24.28±0.47)cA(15.60±0.37)eAB

3 結(jié)論與討論

植物防御酶的合成是植物防御體系形成的重要前提[16-18]。環(huán)境脅迫、損傷、昆蟲取食或外源激素使植物呼吸作用加強，活性氧(ROS)的產(chǎn)生和代謝失去平衡，導致氧脅迫[19-22]?；钚匝醣l(fā)過程中O2-·常常最先產(chǎn)生，SOD、CAT和POD調(diào)節(jié)氧爆發(fā)過程中產(chǎn)生的H2O2，協(xié)同植物誘導防御基因的表達[23]，之后涉及PAL[24]和PPO[25]等催化酚類代謝的合成酶的進一步提高。

蟲害、茉莉酸甲酯和茉莉酮誘導后，球果和主梢SOD、CAT和POD活性在1 d便迅速提高，說明3種處理均可誘導植物的抗性反應。SOD在抗性反應中主要是將O2-·歧化為H2O2[19]。在之后的過程中CAT可降低H2O2引起的植物表面局部性壞死；并對作為防御信號的H2O2起到調(diào)控作用，此過程可觸發(fā)植物水楊酸代謝途徑，外源施用水楊酸可以顯著誘導H2O2水平，并抑制CAT活性[26]。在植物抗性反應中水楊酸途徑與植物抗病性密切相關并與茉莉酸途徑存在交互作用[27]。本研究利用茉莉酸類化合物誘導植物系統(tǒng)防御反應可能在一定程度上抑制了水楊酸途徑，從而使CAT的活性更高。POD同樣可以清除H2O2[19]。在細胞壁中它催化NADH或NADPH氧化產(chǎn)生O-2，O-2進一步歧化為H2O2和分子氧，H2O2和POD與細胞內(nèi)酚底物發(fā)生反應，如將酪氨酸低聚物進步交聯(lián)，這種作用參與細胞壁伸展蛋白的偶聯(lián)形成木質(zhì)素[28]。木質(zhì)素被認為是抵抗病原侵入和擴展以及昆蟲取食的重要防衛(wèi)手段。但本研究中POD僅在1 d時活性較高，后期活性無顯著增加。研究認為當參與偶聯(lián)的POD降低時，細胞壁的強度降低，則會促進植物細胞膨大植株生長[29]。紅松的球果和主梢均為生長較旺盛的器官，這些部位的特點即為細胞膨大或增生，因此木質(zhì)素等物理障礙可能不是這些部位的主要防御手段。

PPO存在于植物質(zhì)體內(nèi)囊體，基因家族表達的多樣性是其顯著特征，保證了其能夠?qū)Ω鞣N因子做出反應，以滿足植物體復雜多變的生理活動[30]。創(chuàng)傷損傷、取食和茉莉酸甲酯均可誘導雜交楊(Populustrichocarpa×P.deltoides)PPO基因特異性表達[31]。煙草被棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)和煙夜蛾(Helicoverpaassulta)取食后，棉鈴蟲誘導的PPO活性顯著高于煙夜蛾取食[32]。研究認為PPO主要通過與細胞內(nèi)大量產(chǎn)生的酚底物結(jié)合，生成活性分子醌來抵御害蟲，醌會將昆蟲食物蛋白中的必需氨基酸烷基化，使昆蟲不能利用其營養(yǎng)[33]。還有研究認為PPO在腺體香毛簇中與酚底物結(jié)合后產(chǎn)生類似“超級黏著”的物質(zhì)，以捕獲體型微小的昆蟲[31]。Martin用茉莉酸甲酯處理云杉幼苗，6～9 d后靠近形成層的木質(zhì)部細胞與周圍細胞相比，細胞質(zhì)變濃，細胞壁變薄，在富含萜的小腔周圍形成樹脂導管初生上皮細胞，15 d后小腔充滿樹脂[10]。本研究中茉莉酸甲酯、茉莉酮和幼蟲取食誘導的PPO在處理后的1～120 d均保持較高水平。眾所周知，紅松在受到損傷后傷口會大量流脂，這種流脂可以黏著害蟲、封閉損傷傷口避免傷口感染，因此推測這可能是紅松球果和主梢防御取食和損傷的一種主要方式。植物蛋白酶抑制劑和PPO都有抗營養(yǎng)的作用，使昆蟲營養(yǎng)缺乏，從而對害蟲進行防御。噴施不同濃度茉莉酸類化合物使球果和主梢胰蛋白酶抑制劑活性分別在處理后的1～60 d和1～30 d顯著增加，球果和主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性分別在處理的1～120 d和30～120 d顯著高于或與蟲害取食無顯著差異，且系統(tǒng)誘導主梢胰凝乳蛋白酶抑制劑活性顯著高于原位誘導。

PAL是細胞壁酚底物形成的關鍵酶，它催化L-苯丙氨酸通過非氧化脫氨反應，生成反式肉桂酸和氨，為苯丙烷代謝的第一步，由此進入植物次生代謝反應，生成香豆酸、阿魏酸等一系列酚酸[24]。本研究中PAL活性也在測定的1～120 d保持較高水平。PAL和PPO活性持續(xù)時間與課題組先前對酚酸的測定結(jié)果[15]相吻合?？梢娷岳蛲瑯幽軌蛘T導植物自身防御物質(zhì)的積累。Maria利用茉莉酮處理小麥，誘導的除了反式香豆酸、丁香酸、對羥基苯甲酸、香草酸及順式和反式阿魏酸等酚酸外，還包括多種苯并噁唑嗪酮[14]。Dabrowska et al.[34]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酮的反應生成途徑包括2條：PathA通過順式-OPDA經(jīng)順式茉莉酸異構(gòu)而形成；PathB順式-OPDA在一定條件下可被轉(zhuǎn)化為反式-OPDA，再經(jīng)過一系列反應形成茉莉酮，但這個驅(qū)使條件目前尚不明確。同樣的反應在龍眼焦腐病菌(Lasiodiplodiatheobromae)也被發(fā)現(xiàn)[35]?？梢?，在防御反應中，植物會根據(jù)自身情況啟動不同茉莉酮反應途徑，以應對復雜的外部環(huán)境。

植物對茉莉酮信號的響應還存在組織特異性。Michael分別用茉莉酸甲酯和茉莉酮的霧化氣體處理蠶豆(Viciafaba)植株，發(fā)現(xiàn)2種物質(zhì)均誘導莖部防御基因D251序列表達上調(diào)，而葉部D251序列只有在茉莉酮處理的植株上才能穩(wěn)定表達[13]。本研究中，紅松球果和主梢經(jīng)茉莉酸甲酯或茉莉酮處理后誘導的防御酶與蛋白酶抑制劑無組織特異性，可能是因為主梢和球果均屬于細胞分類比較旺盛的組織器官，因此二者無顯著差異。

此外，研究發(fā)現(xiàn)一些昆蟲還將茉莉酮作為其性信息素的成分[36]。茉莉酮以及茉莉酸途徑的化合物在植物病蟲害防治過程中可能存在更多的潛在價值，需進一步挖掘研究。